湯賢英，楊杰，劉美，金平，李玉權(quán)

(貴陽(yáng)市婦幼保健院優(yōu)生遺傳科,貴陽(yáng) 550003)

生殖健康一直是全球關(guān)注的熱點(diǎn)。在不孕不育夫婦中,約50%為男性不育[1]。男性不育與損害精子發(fā)生的先天性、后天性或特發(fā)性因素有關(guān),而大多數(shù)的男性不育原因不明,為特發(fā)性男性不育,表現(xiàn)為無(wú)精子癥或少精子癥。在人類(lèi)精子形成過(guò)程中,精子頭部染色質(zhì)的適當(dāng)濃縮可促使精子成熟并具有受精能力以及胚胎的發(fā)育,這一過(guò)程有賴(lài)于DNA的正確甲基化,而異常的DNA甲基化導(dǎo)致精子變異引發(fā)不育[2]。5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶(5,10-methylenetetrahydofolate reductase,MTHFR)通過(guò)促進(jìn)5-甲基四氫葉酸酸的合成,為甲硫氨酸和同型半胱氨酸(Hcy)的合成與代謝提供原料,在DNA合成與甲基化中發(fā)揮著重要作用[3]。MTHFR基因的多態(tài)性,尤其是C677T與多種疾病有關(guān),如心血管疾病、癌癥、血管疾病、先天性唇腭裂、流產(chǎn)等,其原因可能與該多態(tài)性導(dǎo)致的高水平Hcy相關(guān)[3-4]?，F(xiàn)有的研究顯示,MTHFR基因的多態(tài)性可能是男性不育的遺傳性危險(xiǎn)因素之一[5-6],但有文獻(xiàn)報(bào)道二者之間并無(wú)相關(guān)性[7],究其原因,可能與地區(qū)、種族差異等有關(guān)。本研究通過(guò)檢測(cè)貴陽(yáng)地區(qū)男性不育癥患者的MTHFR基因多態(tài)性,探討MTHFR基因多態(tài)性是否是貴陽(yáng)地區(qū)原發(fā)性男性不育癥的遺傳危險(xiǎn)因素。

一、資料與方法

1.研究對(duì)象:參照2012年歐洲泌尿外科學(xué)會(huì)男性不育癥診療指南[8]選取2018年1月至2021年12月期間就診于貴陽(yáng)市婦幼保健院生殖中心的254例原發(fā)性男性不育患者為病例組,年齡19～50歲。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)婚后1年或1年以上、有正常性生活、未采取避孕措施未能使配偶懷孕;(2)兩次精液常規(guī)檢測(cè)確診為少弱精子癥。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)女方不孕因素;(2)隱睪及睪丸發(fā)育不良等生殖器發(fā)育異常者;(3)嚴(yán)重精索靜脈曲張、附睪損傷、生殖系統(tǒng)感染、染色體異常等因素所致不育者。同時(shí),選取配偶自然受孕且有正常生育史的健康男性238例為對(duì)照組,均為同期就診于貴陽(yáng)市婦幼保健院的體檢人員,年齡20～47歲。所有入組人員均簽署知情同意書(shū)。

2.MTHFR基因677、1298位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè):EDTA抗凝管采集病例組和對(duì)照組外周血2～3 ml。嚴(yán)格按血液基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技)說(shuō)明提取DNA,按照葉酸代謝能力(MTHFR)基因檢測(cè)試劑盒(江西諾德)操作程序檢測(cè)MTHFR基因677和1298位點(diǎn)的基因型。PCR擴(kuò)增程序:95℃變性10 min,95℃變性15 s、60℃退火45 s,40個(gè)循環(huán)。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。以百分?jǐn)?shù)(%)表示基因型、等位基因頻率,組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、結(jié)果

1.患者的一般資料:本研究納入254例患者均為貴陽(yáng)地區(qū)常住居民,年齡19～50歲,平均年齡(32.98±7.18)歲;對(duì)照組為配偶自然受孕且有正常生育史的健康男性238例,年齡20～47歲,平均年齡(32.61±6.08)歲。兩組研究對(duì)象根據(jù)MTHFR基因檢測(cè)結(jié)果將677位點(diǎn)分為CC型、CT型、TT型3個(gè)亞組;1298位點(diǎn)分為AA型、AC型、CC型3個(gè)亞組。

2.MTHFR基因677位點(diǎn)基因型及等位基因頻率分布情況:病例組和對(duì)照組的MTHFR基因677位點(diǎn)TT型基因頻率分別為14.17%、14.71%,兩組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);兩組間T等位基因頻率相似,分別為37.60%和36.13%,亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表1)。病例組及對(duì)照組中均未發(fā)現(xiàn)同一個(gè)體發(fā)生兩個(gè)位點(diǎn)純合突變的情況,即無(wú)MTHFR677TT基因型復(fù)合1298CC基因型的情況。

表1 兩組間MTHFR基因677位點(diǎn)基因型頻率及等位基因頻率比較[n(%)］

3.MTHFR基因1298位點(diǎn)基因型及等位基因頻率分布情況:病例組MTHFR基因1298位點(diǎn)CC基因型頻率5.51%,高于對(duì)照組(3.78%),但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);兩組間C等位基因頻率亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表2)。

表2 兩組間MTHFR基因1298位點(diǎn)基因型頻率及等位基因頻率比較[n(%)］

三、討論

現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn),MTHFR基因多個(gè)位點(diǎn)易發(fā)生單核苷酸變異,呈現(xiàn)多態(tài)性。其中,677和1298位點(diǎn)為目前研究較多且變異頻率較高的位點(diǎn),并顯示與多種疾病的易感性相關(guān)[3-5,9-10]。MTHFR677位點(diǎn)胸腺嘧啶(T)取代了胞嘧啶(C),使該位點(diǎn)呈現(xiàn)出CC(野生型)、CT(雜合突變型)以及TT(純合突變型)三種基因型;1298位點(diǎn)胞嘧啶(C)取代腺嘌呤(A),呈現(xiàn)AA、AC、CC三種基因型。這兩個(gè)位點(diǎn)的基因突變均可降低MTHFR酶活性,尤以677TT基因型酶活性降低最為顯著,約降低了50%～60%,阻礙了葉酸的正常代謝[3,9],進(jìn)而破壞了甲硫氨酸和Hcy的合成與代謝平衡,導(dǎo)致異常的DNA合成與甲基化、DNA修復(fù)等,影響精子的成熟與受精能力,這可能是MTHFR基因多態(tài)性導(dǎo)致原發(fā)性男性不育的原因之一[2-4],亦是MTHFR基因多態(tài)性與原發(fā)性男性不育癥相關(guān)性研究的熱點(diǎn)之一。

近年來(lái),不斷有相關(guān)的研究或薈萃分析報(bào)道MTHFR基因多態(tài)性與原發(fā)性男性不育的可能關(guān)系[5-6,9-13],MTHFRC677T與無(wú)精子癥和少精子癥的關(guān)系存在著種族和地域的差異:如在亞洲、印第安及土耳其人群中,MTHFRC677T是無(wú)精子癥和少精子癥的遺傳危險(xiǎn)因子[6,11-12];而在波蘭及巴基斯坦人中,MTHFRC677T并不是非梗阻性男性不育癥的主要遺傳危險(xiǎn)因子[9,13];一項(xiàng)C677T多態(tài)性與男性不育癥的關(guān)聯(lián)分析[7]發(fā)現(xiàn),在東亞人和西亞人種族中MTHFRC677T與男性不育風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān),而在其他種族(如高加索人和非洲人)不存在這種相關(guān)性。

Yang等[14]的研究報(bào)告指出,我國(guó)漢族人群中MTHFR677 T等位基因頻率顯示自北向南逐漸降低的趨勢(shì),山東最高為63.1%、海南最低為24%,TT基因型分別為40.8%、6.4%,這為解釋國(guó)內(nèi)各地677TT基因型與原發(fā)性男性不育癥相關(guān)性存在地區(qū)差異提供了一種可能。但也有研究顯示,各地區(qū)原發(fā)性男性不育癥與MTHFR基因多態(tài)性的關(guān)系并未遵循這一趨勢(shì),如四川、湖北、徐州、寧夏(漢族)等地區(qū)的研究顯示MTHFRC677T與無(wú)精子癥和少精子癥有相關(guān)性[15-20],而在中國(guó)中部和東部省份MTHFRC677T與漢族特發(fā)性男性不育癥無(wú)關(guān)聯(lián)[21-23]。本研究結(jié)果顯示,MTHFRC677T、A1298C基因多態(tài)性在貴陽(yáng)地區(qū)貴州籍原發(fā)性男性不育癥(無(wú)精子癥和少子精癥)患者與那些有證實(shí)生育力的對(duì)照男性之間并無(wú)顯著性差異,說(shuō)明MTHFR基因多態(tài)性與原發(fā)性男性不育癥的相關(guān)性存在不一致性,并不能單純地用地域差異來(lái)解釋,而是提示可能存在多種遺傳因素或環(huán)境因素影響疾病的遺傳風(fēng)險(xiǎn)。導(dǎo)致這種差異的可能相關(guān)因素如下:(1)其他與男性不育有關(guān)的尚未確定的致病基因的存在掩蓋了MTHFR基因多態(tài)性的影響;(2)基因與基因間的相互作用,如與其他Hcy代謝相關(guān)的基因多態(tài)性因素互相疊加或干擾有關(guān);(3)種族、民族因素:現(xiàn)有研究顯示在歐洲人、北美人和中國(guó)人,以及國(guó)內(nèi)多個(gè)民族中均觀(guān)察到MTHFR677T等位基因頻率差異[24-25],這種差異可能對(duì)疾病遺傳危險(xiǎn)因素的判定產(chǎn)生影響;(4)飲食因素:有研究提示飲食也是一種與男性不育及其他疾病相關(guān)的環(huán)境因素[7]。在具有MTHFRC677T多態(tài)性T等位基因的男性中,足量的維生素B9(葉酸)和B12(鈷胺素)攝入在降低同型半胱氨酸水平、改善精子濃度和活力方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[26],提示MTHFR基因多態(tài)性與微量營(yíng)養(yǎng)素之間的相互作用,可影響同型半胱氨酸代謝途徑的效率,進(jìn)而影響MTHFR基因多態(tài)性與相關(guān)疾病遺傳風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估;(5)其他環(huán)境因素。

本研究的研究對(duì)象均來(lái)自于貴陽(yáng)地區(qū)常住人口,由于樣本量小,不排除結(jié)論存在偏倚性;其次,貴州地處西南,飲食結(jié)構(gòu)多樣化,富含葉酸食物種類(lèi)繁多,可能降低了MTHFR基因C677T多態(tài)性對(duì)男性不育的影響。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、生活水平日益改善,人們對(duì)生殖健康的關(guān)注或重視日益提高,對(duì)微量元素的足量攝入亦逐漸重視,本研究不排除對(duì)照組人員攝入足量微量元素可能影響了MTHFR基因C677T多態(tài)性與男性不育相關(guān)性的判斷。此外,貴州是多民族聚居地區(qū),不同民族間可能存在基因多態(tài)性的差異、人口遷移等因素。本研究中亦有少數(shù)民族樣本存在,但因樣本量小不足以探討MTHFR基因多態(tài)性在不同民族男性不育癥間的差異。因此,后續(xù)研究有必要進(jìn)一步加大樣本量,并增加民族、飲食結(jié)構(gòu)以及影響DNA甲基化的其他基因的調(diào)查,進(jìn)而深入探討MTHFR基因多態(tài)性與貴州地區(qū)原發(fā)性男性不育的關(guān)系以及相互作用的機(jī)制,指導(dǎo)男性不育癥的預(yù)防和治療。