李澎濤，殷晨星，孟娜娜，王娜，曹娟，張佳妮，王玉真

(保定市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)科,保定 071000)

體外受精-胚胎移植(IVF-ET)過程中,一般在受精后16～18 h觀察卵母細(xì)胞原核情況來判斷其是否受精,具有兩個原核(2PN)的為正常受精卵。大多數(shù)未出現(xiàn)原核的卵母細(xì)胞為未受精卵,但有時也會存在一些無原核(0PN)的受精卵,其發(fā)生率為11.3%～20%[1],這些受精卵能夠繼續(xù)發(fā)育成卵裂胚甚至囊胚,我們稱這些胚胎為0PN來源胚胎。有一些研究認(rèn)為0PN受精卵可能為孤雌激活或胚胎染色體異常導(dǎo)致原核不能形成,不建議移植0PN來源胚胎[2-4]。但Manor等[5]認(rèn)為0PN來源胚胎形成的主要原因是由于觀察受精時間是固定的,而原核出現(xiàn)的時間不確定,導(dǎo)致當(dāng)那些提早發(fā)育的胚胎原核出現(xiàn)時,未能及時觀察到而錯過。正常受精卵原核一般在受精后23～25 h消失,而對于少部分發(fā)育比較快的受精卵,其原核消失的時間要早于大多數(shù)正常受精卵[6-7],而這部分受精卵在定時觀察原核時就可能被判定為0PN。近年來,一些研究表明將0PN來源胚胎移植后也可以妊娠并成功分娩健康嬰兒[8-12]。0PN來源胚胎的利用不僅避免了胚胎的浪費,而且給了患者更多的妊娠機會,尤其對于那些卵巢儲備功能減退的高齡患者尤為重要。Time-lapse時差培養(yǎng)箱在臨床的應(yīng)用,極大擴展了原核的觀察時間范圍,避免了錯失原核的最佳觀察時間,但由于設(shè)備昂貴,限制了其應(yīng)用范圍。因此對于那些未使用Time-lapse時差培養(yǎng)箱的生殖中心來說,如何安全有效地利用這些0PN來源胚胎具有重要意義。本研究通過對IVF-ET過程中的臨床及實驗室數(shù)據(jù)進(jìn)行回顧性分析,探討影響0PN受精卵形成的影響因素、0PN來源胚胎發(fā)育潛能及其利用價值。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析2019年1月至2021年12月在保定市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)科接受IVF-ET及凍融胚胎移植(FET)治療的患者的臨床、實驗室數(shù)據(jù)及妊娠結(jié)局。

納入標(biāo)準(zhǔn):(1)受精方式為常規(guī)IVF;(2)FET周期均為囊胚移植;(3)雙方均無遺傳性疾病。

排除標(biāo)準(zhǔn):(1)FET周期排除子宮內(nèi)膜異位癥患者;(2)FET周期排除內(nèi)膜轉(zhuǎn)化日內(nèi)膜厚度<8 mm者。

本研究共納入符合標(biāo)準(zhǔn)的1 597個常規(guī)IVF周期及596個FET周期。

二、診療回顧

1.控制性促排卵、受精及胚胎培養(yǎng):依據(jù)患者年齡、卵巢儲備情況、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)等自身情況制定適合患者的促排卵方案,于HCG注射36 h后經(jīng)陰道超聲引導(dǎo)下取卵。男方患者于女方獲卵后手淫取精,精液液化后均采用密度梯度離心法對精液優(yōu)化處理,所用梯度液為瑞典Vitrolife公司的SpermGradTM,洗精液、受精液、卵裂培養(yǎng)液及囊胚培養(yǎng)液均為瑞典Vitrolife公司的G-seriesTM培養(yǎng)液。于HCG注射39～40 h后在雙井皿中授精,授精濃度10～30萬條/ml,5 h左右去除顆粒細(xì)胞,觀察極體情況,有兩個極體(2PB)的卵母細(xì)胞判斷為受精卵,對于受精卵比例小于30%的患者進(jìn)行早補救授精。授精后17～19 h進(jìn)行原核評價,依據(jù)原核數(shù)量分為2PN受精卵(正常受精)、0PN受精卵[未觀察到原核,有兩個極體,授精后第2天(D2)發(fā)生卵裂的受精卵]、1PN受精卵(僅觀察到1個原核的受精卵)等。繼續(xù)培養(yǎng)至授精后第3天(D3),依據(jù)ASEBIR卵裂期胚胎評價標(biāo)準(zhǔn)[13]對胚胎進(jìn)行評價,將D3卵裂期胚胎分為Ⅰ～Ⅳ級。將Ⅰ、Ⅱ級正常受精卵裂胚選擇性移植或冷凍后剩余卵裂期胚胎繼續(xù)囊胚培養(yǎng)至D5/D6,依據(jù)Gardner囊胚分級法[14]對形成的囊胚進(jìn)行評價,選擇3期及以上且滋養(yǎng)層或內(nèi)細(xì)胞團評級不同時為C的囊胚冷凍保存。本中心將所有0PN來源胚胎培養(yǎng)至囊胚階段凍存,在沒有足夠2PN來源的胚胎情況下用于FET。

2.FET周期:囊胚的冷凍和解凍均使用日本Kitazato公司的冷凍及解凍套裝。囊胚冷凍前均進(jìn)行激光打孔皺縮。按照試劑說明書對胚胎進(jìn)行冷凍及復(fù)蘇,復(fù)蘇后將3/4期囊胚進(jìn)行激光輔助孵化。胚胎復(fù)蘇后,在37℃、6%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)2 h后觀察并記錄解凍胚胎細(xì)胞的存活細(xì)胞數(shù)、壞死細(xì)胞數(shù)及繼續(xù)培養(yǎng)后的生長情況。復(fù)蘇后3～4 h,用移植管連接1 ml氣密注射器,一段式裝管后,B超引導(dǎo)下將胚胎移植入子宮腔中后部。胚胎移植后35 d腹部B超下觀察到宮腔內(nèi)孕囊及心管搏動為臨床妊娠。妊娠后隨訪,記錄流產(chǎn)、胎停、出生情況等數(shù)據(jù)。

三、研究分組

常規(guī)IVF-ET周期分為3組:A1組(無0PN受精,731個周期)、A2組(0<0PN受精率≤20%,495個周期)和A3組(0PN受精率>20%,371個周期)。

依據(jù)行囊胚培養(yǎng)的D3剩余胚受精來源不同分為2組:B1組(0PN來源胚胎,2 409枚)和B2組(2PN來源胚胎,6 602枚)。

依據(jù)FET周期移植囊胚來源分為2組:C1組(0PN來源凍融囊胚,85周期)和C2組(2PN來源凍融囊胚,511周期)。

四、觀察指標(biāo)及判定標(biāo)準(zhǔn)

患者基線資料,包括年齡、不孕年限、BMI、抗苗勒管激素(AMH)水平、基礎(chǔ)激素水平、促排卵方案及受精相關(guān)指標(biāo);剩余D3胚的囊胚培養(yǎng)結(jié)局,包括囊胚形成率、可冷凍囊胚形成率;FET周期結(jié)局,包括移植囊胚數(shù)量/質(zhì)量、妊娠結(jié)局及新生兒結(jié)局。

0PN來源胚胎形成率=(D1未觀察到原核,有兩個極體,D2發(fā)生卵裂的受精卵數(shù))/獲卵數(shù)×100%;囊胚形成率=(D5/D6形成的2期以上囊胚數(shù))/繼續(xù)培養(yǎng)胚胎數(shù)×100%;可利用囊胚形成率=(D5/D6形成的可冷凍囊胚數(shù))/繼續(xù)培養(yǎng)胚胎數(shù)×100%;臨床妊娠率=(超聲下能檢測到孕囊的妊娠周期數(shù))/移植周期數(shù)×100%;種植率=(超聲下檢測到的孕囊數(shù))/移植胚胎數(shù)×100%;流產(chǎn)率=(孕周<28周的流產(chǎn)周期數(shù))/臨床妊娠周期數(shù)×100%;活產(chǎn)率=活胎分娩周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%;早產(chǎn)率=(孕周<37周的分娩周期數(shù))/分娩周期總數(shù)×100%。

五、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、常規(guī)IVF周期患者臨床資料

1.基線資料:本研究共納入1 597個常規(guī)IVF周期。其中,A1組(無0PN受精)731個周期、A2組(0<0PN受精率≤20%)495個周期、A3組(0PN受精率>20%)371個周期。A2、A3組患者的年齡低于A1組(P<0.05),AMH水平顯著高于A1組(P<0.05),基礎(chǔ)FSH值顯著低于A1組(P<0.05)。 三組間不孕年限、BMI比較無顯著差異(P>0.05)(表1)。

表1 常規(guī)IVF周期3組患者基本情況比較(-±s)

2.促排卵資料:A2、A3組患者用藥天數(shù)、長方案占比、獲卵數(shù)顯著高于A1組(P<0.05);A2組拮抗劑方案占比最低、獲卵數(shù)最高,與其余兩組有顯著差異(P<0.05)(表2)。

表2 常規(guī)IVF周期3組患者促排卵治療情況比較[(-±s),%］

二、剩余D3卵裂期胚行囊胚培養(yǎng)情況

常規(guī)IVF周期共授精17 882枚卵母細(xì)胞,形成2 422枚0PN受精卵,0PN受精卵形成率為13.54%。D3剩余卵裂期胚胎繼續(xù)培養(yǎng)至D5/6,其中,B1組(0PN來源D3胚胎)2 409枚,B2組(2PN來源D3胚胎)6 602枚。兩組的囊胚形成率無顯著差異(P>0.05),B1組的可利用囊胚形成率顯著高于B2組(P<0.05)(表3)。

表3 兩組剩余D3卵裂期胚胎進(jìn)行囊胚培養(yǎng)情況比較(%)

三、FET周期臨床結(jié)局

本研究共納入了596個FET周期,其中C1組(移植0PN來源凍融囊胚)85周期,C2組(移植2PN來源凍融囊胚)511周期。兩組患者一般情況年齡、不孕年限、BMI、優(yōu)質(zhì)囊胚比例、D5囊胚占比比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05);C2組的平均移植胚胎數(shù)顯著高于C1組(P<0.05)。囊胚移植后妊娠結(jié)局,兩組間胚胎種植率、臨床妊娠率、孕周、多胎分娩率、早產(chǎn)率、新生兒體重、新生兒體長比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05),C1組流產(chǎn)率顯著高于C2組、活產(chǎn)率顯著低于C2組(P<0.05)(表4)。

表4 FET周期兩組患者基本情況及胚胎移植后臨床結(jié)局比較[(-±s),%］

討 論

隨著輔助生殖技術(shù)的發(fā)展,胚胎體外培養(yǎng)體系在模擬體內(nèi)生長環(huán)境方面日趨完善,然而與生理狀態(tài)相比,體外培養(yǎng)仍存在一些不盡如人意的地方如延遲細(xì)胞分裂、降低胚胎氧化代謝及增加乳酸的產(chǎn)生等。在胚胎的動態(tài)的生長發(fā)育過程中,細(xì)胞形態(tài)評價僅能提供有限的參考信息,比如授精后17～19 h對原核數(shù)量及形態(tài)的觀察,一些發(fā)育較快的受精卵的原核在此時可能已經(jīng)消失。Campbell等[15]通過Time-lapse時差培養(yǎng)箱觀察發(fā)現(xiàn)15%～20%受精卵的原核在受精后16 h內(nèi)就消失了。

本研究通過對IVF-ET周期患者基本情況、臨床治療及實驗室數(shù)據(jù)的比較,發(fā)現(xiàn)女方患者年齡、AMH水平、基礎(chǔ)FSH水平、獲卵數(shù)及促排卵方案的選擇等因素對0PN受精卵的發(fā)生有顯著影響。趙雙丹等[8]對10 834個IVF周期進(jìn)行了回顧性分析,利用二元Logistic回歸對患者基本情況及獲卵數(shù)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)患者年齡、平均周期數(shù)、獲卵數(shù)多等因素與0PN來源胚胎發(fā)生率具有顯著相關(guān)性。在本研究中,與無0PN來源胚胎發(fā)生的患者相比,有0PN來源胚胎的兩組的女方患者年齡小、AMH值高、FSH值低、長方案促排占比高、獲卵數(shù)高,且均有顯著性差異,以上參數(shù)情況也反映了有0PN來源胚胎的兩組的女方患者卵巢儲備功能要好于無0PN來源胚胎發(fā)生的患者,這一結(jié)果與劉景等[16]的報道一致。由于卵巢功能好的患者一般較多的會選擇卵泡期長方案促排卵,這一方案獲卵數(shù)顯著高于其他方案[17],并且卵泡發(fā)育不同步明顯,因此獲卵后即使表觀成熟度相同的卵母細(xì)胞,實際上其卵母細(xì)胞成熟度也并非完全一致[8],每個卵母細(xì)胞的受精時間點不同,卵母細(xì)胞間的原核呈現(xiàn)時間不同步,這就會導(dǎo)致一些發(fā)育快的合子的原核出現(xiàn)得早于我們的常規(guī)觀察受精時間(16～18 h)[5]。在本研究中為探究0PN來源胚胎率高于正常值的影響因素,將有0PN來源胚胎的患者做了進(jìn)一步的分組比較,兩組間患者自身因素數(shù)據(jù)無顯著差異,只有在促排方案選擇及獲卵數(shù)上存在顯著差異,0PN來源胚胎率低的組獲卵數(shù)顯著高于0PN來源胚胎高的組,從而推測獲卵數(shù)及促排卵方案僅影響了0PN來源胚胎的產(chǎn)生,并未對其0PN來源胚胎率的高低造成顯著影響。

本研究中0PN受精卵發(fā)生率13.54%(2 422/17 882)。在1 597個常規(guī)IVF周期中無0PN受精卵周期占45.77%(731/1 597),0PN受精卵率在0%～20%之間的周期占31.00%(495/1 597),0PN受精卵率20%以上的周期占23.23%(371/1 597)。在沒有Time-lapse時差培養(yǎng)箱的情況下0PN受精卵發(fā)生是不可避免的,囊胚培養(yǎng)不僅能形成比卵裂胚更具發(fā)育潛能的囊胚,而且在培養(yǎng)過程中染色體異常、發(fā)育潛能差的胚胎會被淘汰。有文獻(xiàn)報道0PN來源囊胚染色體正常率(60%)顯著高于D3卵裂期胚胎(40%)[18],所以囊胚培養(yǎng)可以對胚胎進(jìn)行篩選。本中心對于0PN來源胚胎在D3均不選擇移植,而是繼續(xù)培養(yǎng)至D5/D6囊胚階段選擇冷凍保存。有研究發(fā)現(xiàn)利用Time-lapse時差培養(yǎng)箱培養(yǎng),發(fā)育快的胚胎原核消失要早于正常發(fā)育的胚胎,在授精后固定時間16～18 h觀察受精形成的0PN受精卵大多數(shù)是由于錯過了這些發(fā)育快的胚胎的原核觀察時間,在隨后的囊胚培養(yǎng)過程中,0PN來源胚胎的囊胚形成率與2PN來源胚胎的囊胚形成率比較無顯著差異[19]。Yao等[18]將1 649枚臨床廢棄胚胎(包括正常及異常受精胚胎)行囊胚培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)那些發(fā)育快、在觀察受精時未觀察到原核的0PN來源胚胎的囊胚形成率為16.7%,與2PN來源胚胎的囊胚形成率22.6%相近;而那些在觀察受精時已經(jīng)卵裂的胚胎的囊胚形成率達(dá)63.8%,顯著高于2PN來源胚胎的囊胚形成率。在本研究中0PN來源胚胎的囊胚形成率與2PN來源胚胎的囊胚形成率比較無顯著差異,與以上文獻(xiàn)一致;并且0PN來源胚胎可冷凍囊胚形成率顯著高于2PN來源胚胎(P<0.05),造成這種差異的可能因素為2PN優(yōu)質(zhì)卵裂胚進(jìn)行了移植或冷凍,剩下質(zhì)量較差的胚胎行囊胚培養(yǎng)。這一結(jié)果與Fu等[20]報道一致。但也有報道發(fā)現(xiàn)0PN來源胚胎的囊胚形成率(30.03%)顯著低于2PN來源胚胎的囊胚形成率(45.71%)[21]。

人類輔助生殖技術(shù)的最終目的是使患者獲得妊娠并成功分娩健康的嬰兒。關(guān)于0PN來源胚胎移植是一個備受關(guān)注的問題。近年來,一些研究利用囊胚培養(yǎng)技術(shù)或Time-lapse時差培養(yǎng)箱對0PN來源胚胎選擇移植并成功分娩健康嬰兒[8-12,16,19]。本研究將0PN來源胚胎繼續(xù)培養(yǎng)至囊胚,冷凍保存,在無2PN來源胚胎可以利用的情況下,對0PN來源囊胚復(fù)蘇移植。比較同期0PN、2PN來源囊胚移植后的妊娠結(jié)局及新生兒情況,盡管2PN來源囊胚移植的臨床妊娠率、胚胎種植率高于0PN來源囊胚妊娠率、種植率,但無顯著差異(P>0.05),這與劉景等[16]的研究一致。在陳國勇等[22]的研究中,0PN來源囊胚凍融移植的種植率、臨床妊娠率均顯著高于2PN來源囊胚(P<0.05)。馬水英等[9]則認(rèn)為0PN來源囊胚移植的臨床妊娠率、種植率顯著低于2PN來源囊胚,該研究分別對IVF、ICSI兩種受精方式不同受精來源的囊胚的FET周期妊娠結(jié)局進(jìn)行了對比分析,發(fā)現(xiàn)IVF受精方式無論D5還是D6的2PN來源囊胚的臨床妊娠率、種植率均顯著高于0PN來源囊胚(P<0.05);而ICSI受精方式中相同發(fā)育天數(shù)的0PN來源囊胚與2PN來源囊胚的臨床妊娠率、種植率無顯著差異(P>0.05);同樣,在該研究中也報道了IVF受精方式0PN來源囊胚凍融移植的流產(chǎn)率、活產(chǎn)率與2PN來源囊胚相比均有顯著差異(P<0.05)。本研究也有相似結(jié)果,0PN來源囊胚對比2PN來源囊胚凍融移植的流產(chǎn)率(40.0% vs. 20.8%)更高、活產(chǎn)率(24.71% vs. 38.75%)更低。

在體外受精-胚胎移植過程中,染色體非整倍體是導(dǎo)致胚胎停育、自發(fā)性流產(chǎn)的主要原因。石小丹等[23]通過植入前遺傳學(xué)檢測技術(shù)(PGT)對78枚0PN來源囊胚檢測,發(fā)現(xiàn)整倍體率僅為28.21%,顯著低于2PN來源囊胚的46.53%及1PN來源囊胚的63.33%(P<0.05)。在本研究中,0PN來源囊胚與2PN來源囊胚凍融移植后比較妊娠患者的多胎分娩率、孕周、早產(chǎn)率、新生兒畸形率、體重、體長等指標(biāo),均無顯著差異(P>0.05),與Chen等[24]研究一致。本研究中2PN來源囊胚移植患者孕周較低、早產(chǎn)率較高的主要因素是2PN來源囊胚移植患者多胎分娩率高于0PN來源囊胚(20.71% vs. 9.52%),2PN來源囊胚移植46例早產(chǎn)患者中30例多胎分娩,2PN來源囊胚移植的新生兒4例畸形(卵圓孔閉合2例、右手拇指缺如1例,以及肛門閉鎖1例出生后存活10 d)。

本研究還有一些不足之處,比如由于未對凍融囊胚移植周期的流產(chǎn)絨毛進(jìn)行核型分析,因此不能確定0PN來源囊胚如此高的流產(chǎn)率是否由于染色體異常所致。

綜上所述,接受常規(guī)體外受精-胚胎移植治療的患者卵巢儲備情況可能會對0PN來源胚胎的形成有一定影響;與2PN來源囊胚相比,0PN來源囊胚移植后流產(chǎn)率、活產(chǎn)率存在一定差異,但在患者無2PN來源胚胎可移植的情況下,0PN來源囊胚移植提高了胚胎利用率,降低了患者診療費用,減少了患者精神及身體上的痛苦,有很大利用價值。當(dāng)然0PN來源囊胚移植的風(fēng)險也是一個值得關(guān)注的問題,Time-lapse時差培養(yǎng)箱及植入前診斷技術(shù)是目前盡量避免這類風(fēng)險的有效途徑。