胡巨偉，鄭娟，孟珂，周黎明，李潔

(寧波市婦女兒童醫(yī)院,寧波 315000)

輔助生殖技術為越來越多的不孕不育家庭帶來了生育的希望,已經(jīng)成為了最主要的助孕手段之一,但仍有約10%的患者在輔助生殖助孕過程中會發(fā)生反復種植失敗(RIF)。根據(jù)中國醫(yī)師協(xié)會生殖醫(yī)學專業(yè)委員會的專家共識[1],RIF定義為:40歲以下成年女性在3個新鮮或冷凍周期內(nèi)移植至少3枚優(yōu)質(zhì)胚胎后仍未能實現(xiàn)臨床妊娠,其中優(yōu)質(zhì)胚胎包括第3天優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎(細胞數(shù)≥8個、卵裂球大小均勻、碎片率<10%)和優(yōu)質(zhì)囊胚(≥3BB)。RIF病因復雜多樣,已成為影響輔助生殖助孕成功率的瓶頸之一。影響胚胎種植的因素繁多,涉及輔助生殖的整個流程,主要包括母胎界面免疫因素、生殖系統(tǒng)解剖結(jié)構(gòu)異常、控制性促排卵方案的影響、胚胎因素以及黃體支持方案等。近年來,越來越多的研究將目光專注于這一領域。但是,大多數(shù)研究聚焦于解剖學結(jié)構(gòu)異常、母胎界面的免疫紊亂以及基因異常等方面[2-3],而患者自身因素、體外受精-胚胎移植(IVF-ET) 過程及實驗室指標對RIF的影響的研究鮮有報道。本研究通過回顧性分析522個RIF周期和935個正常妊娠周期患者自身因素及胚胎實驗室指標,探索輔助生殖過程中發(fā)生RIF的危險因素,為RIF的病因篩查和臨床治療提供理論依據(jù)。

資料和方法

一、研究對象

回顧性分析2019年1月至2022年12月在寧波市婦女兒童醫(yī)院生殖中心行IVF-ET助孕治療的不孕不育患者的臨床資料。根據(jù)移植次數(shù)和妊娠結(jié)局分為RIF周期組(RIF組)和正常妊娠周期組(對照組)。

RIF組納入標準:女方年齡<40歲,在3個新鮮或凍融胚胎移植周期內(nèi)移植至少3枚優(yōu)質(zhì)胚胎后仍未能實現(xiàn)臨床妊娠,其中優(yōu)質(zhì)胚胎包括第3天優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎(細胞數(shù)≥8個、卵裂球大小均勻、碎片率<10%)和優(yōu)質(zhì)囊胚(≥3BB)。對照組納入標準:女方年齡<40歲,一次新鮮胚胎移植周期即獲得臨床妊娠。

排除標準:有染色體異?；颊?有嚴重的生殖道或?qū)m腔畸形患者;行植入前遺傳學檢測(PGT)患者。

共納入522個RIF周期和935個正常妊娠周期。本研究獲得寧波市婦女兒童醫(yī)院倫理委員會審批通過。

二、助孕過程回顧

根據(jù)患者的年齡、基礎卵泡刺激素(FSH)水平、抗苗勒管激素(AMH)水平、竇卵泡數(shù)(AFC)和既往促排卵周期的反應等綜合考慮選擇促排卵方案,個體化制定促性腺激素(Gn)啟動劑量。Gn刺激4 d后開始卵泡監(jiān)測,根據(jù)超聲和血清性激素水平及時調(diào)整Gn劑量,當60%的主導卵泡直徑達16～18 mm時,肌肉注射4 000～10 000 U人絨毛膜促性腺激素(HCG),36～37 h后在陰道超聲引導下穿刺取卵。取卵4 h后行體外受精(IVF)或卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI),授精18～20 h后觀察受精情況并記錄。

取卵3 d或5 d后觀察胚胎的生長情況并進行形態(tài)學評分。根據(jù)患者情況選擇1～2枚優(yōu)質(zhì)胚胎移植,移植后給予黃體支持,HCG陽性者持續(xù)黃體支持至移植后60 d。胚胎移植14 d后檢查血清HCG水平,血HCG >10 U/L診斷為HCG陽性,HCG陽性者于2周后B超檢查是否宮內(nèi)妊娠,見孕囊及胚芽者診斷為臨床妊娠。

三、觀察指標

患者一般資料,包括女方年齡、不孕年限、不孕類型、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、基礎AMH水平、HCG日子宮內(nèi)膜厚度;促排卵相關資料,包括Gn天數(shù)、Gn總量、HCG日黃體生成素(LH)、雌二醇(E2)、孕酮(P)水平以及HCG日卵泡數(shù);胚胎實驗室數(shù)據(jù),包括獲卵數(shù)、受精數(shù)、兩原核(2PN)受精數(shù)、卵裂數(shù)、優(yōu)胚數(shù)。

四、統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

一、患者臨床資料比較

本研究共納入522個RIF周期(RIF組)和935個正常妊娠周期(對照組)。

1.一般臨床資料比較:RIF組女方年齡、不孕年限和繼發(fā)不孕比例均顯著高于對照組(P<0.05),而基礎AMH水平顯著低于對照組(P<0.05)(表1)。

表1 患者一般臨床資料比較[(-±s),M(P25,P75),n(%)］

2.促排卵及實驗室相關資料比較:RIF組Gn天數(shù)、Gn總量、HCG日卵泡數(shù)、內(nèi)膜厚度,以及獲卵數(shù)、受精數(shù)、2PN數(shù)、卵裂數(shù)、優(yōu)胚數(shù)均顯著低于對照組(P<0.05),而HCG日LH、P水平均顯著高于對照組(P<0.05)(表2)。

表2 患者促排卵及實驗室資料比較[(-±s),M(P25,P75)］

二、RIF風險因素二元Logistic回歸分析

將上述組間比較中具有統(tǒng)計學意義的指標納入Logistic回歸分析模型,去除中介變量后,分析顯示:女方年齡、不孕年限、HCG日內(nèi)膜厚度、HCG日P水平和Gn使用天數(shù)為RIF的獨立影響因素(表3)。HCG日內(nèi)膜厚度和HCG日P水平對RIF影響較大:內(nèi)膜厚度每增加1 mm,發(fā)生RIF的風險下降約40%;HCG注射日P值每增加1 nmol/L,發(fā)生RIF的風險增加約46.2%。

表3 二元Logistic回歸分析RIF風險因素

三、ROC曲線評價Logistic預測模型

Logistic回歸模型的模型系數(shù)綜合檢驗顯示模型具有統(tǒng)計學意義(χ2=370.614,P<0.001)。用ROC曲線評價二元Logistic回歸預測模型[AUC=0.808,95%CI(0.783,0.833),P<0.001],提示我們所建立的預測模型效果較好(圖1)。

圖1 Logistic 回歸預測模型的ROC曲線

討 論

影響胚胎種植成功的關鍵因素有母體因素和胚胎因素,母體因素又包括一般危險因素、子宮內(nèi)膜因素、宮腔因素、免疫因素以及內(nèi)分泌因素等[4]。我們的研究通過比較RIF組和正常妊娠組患者在一般臨床資料、促排卵過程及胚胎實驗室數(shù)據(jù)資料方面的差異,尋找引發(fā)RIF的可能危險因素,而后又通過二元Logistic回歸分析進行多因素分析,進一步控制混雜因素,探索RIF的獨立影響因素。我們的研究顯示,女方年齡、不孕年限、HCG日內(nèi)膜厚度、HCG日P水平和Gn使用天數(shù)為RIF的獨立危險因素(P<0.05)。較全面地探索了輔助生殖助孕過程中個體因素、促排卵過程和胚胎實驗室指標中可能導致RIF的危險因素,有助于及時有針對性地調(diào)整助孕策略,提高胚胎的種植率,得到良好的妊娠結(jié)局。

目前的研究多集中于宮腔環(huán)境對胚胎種植的影響,宮腔環(huán)境正常是胚胎種植的基本條件。多項研究表明,宮腔異常如子宮內(nèi)膜增生、子宮內(nèi)膜息肉、子宮粘膜下肌瘤、宮腔粘連等會影響胚胎種植[5-7]。但是,并非所有宮腔異常均會影響胚胎種植,明顯占位或者位置不佳的肌瘤及息肉、深部浸潤進而破壞生殖系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的子宮內(nèi)膜異位癥、直接損害子宮內(nèi)膜功能的子宮腺肌病以及嚴重輸卵管積水倒灌宮腔才會對胚胎種植造成較為嚴重的不良影[8]。目前,宮腔鏡檢查被認為是宮腔內(nèi)病變評估的金標準,在RIF的診斷和治療中被廣泛應用。多項研究表明,RIF患者在胚胎移植前行宮腔鏡檢查可顯著提高新鮮和凍融胚胎移植周期的胚胎種植率[9-10]。

胚胎植入過程還涉及母胎界面的免疫調(diào)節(jié),其中涉及多種免疫細胞及細胞因子的調(diào)控作用,是目前胚胎種植方面的研究熱點。子宮內(nèi)膜的蛻膜基質(zhì)細胞能夠調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細胞的侵襲并抑制局部母體免疫反應,對胚胎植入至關重要[1]。外周血或子宮內(nèi)膜免疫細胞的異常也可能導致胚胎植入的失敗,因此免疫調(diào)節(jié)紊亂也是導致RIF的重要因素。

年齡和不孕年限對胚胎的種植影響是多方面的,女性隨著年齡的增長,體內(nèi)激素水平下降,卵巢功能也隨之下降,進而影響卵子的質(zhì)量和胚胎的質(zhì)量。石禮紅等[11]的多因素回歸模型分析發(fā)現(xiàn)女性年齡是不孕女性行IVF-ET治療臨床妊娠結(jié)局的獨立危險因素,不同年齡組之間的臨床妊娠率、流產(chǎn)率和活產(chǎn)率差異有統(tǒng)計學意義,≥40歲的高齡婦女獲卵數(shù)、卵裂數(shù)、2PN數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)明顯減少。同時,女性年齡還影響子宮內(nèi)膜厚度,王瑜等[12]的研究顯示隨著女性年齡增加,子宮內(nèi)膜厚度降低,臨床妊娠率也顯著降低。郭玲等[10]的研究也顯示,RIF組患者的不孕年限顯著高于對照組,回歸分析顯示,不孕年限是RIF的獨立危險因素,我們的研究結(jié)論與其一致。

在合適的種植窗植入胚胎也是成功妊娠的關鍵[13]。種植窗期間子宮內(nèi)膜容受性最高,子宮內(nèi)膜由增值期轉(zhuǎn)化為分泌期,表現(xiàn)為子宮內(nèi)膜分子和組織學產(chǎn)生變化,如上皮細胞增殖抑制、上皮細胞重塑以及基質(zhì)細胞發(fā)生蛻膜化等[14]。子宮內(nèi)膜上皮細胞在胚胎植入過程中參與母-胚通訊,基質(zhì)細胞發(fā)生蛻膜化轉(zhuǎn)變?yōu)榉置诩毎?具有促進生長和發(fā)育的重要作用。發(fā)生這些變化的原因可能與子宮內(nèi)膜轉(zhuǎn)錄組基因的差異表達有關[15-16],孕酮(P)和雌二醇(E2)是上述功能的主要調(diào)節(jié)因素,通過多種旁分泌、近分泌和自分泌因子在時空上協(xié)調(diào)子宮功能。但是,如果發(fā)生激素紊亂,P水平過早升高,子宮內(nèi)膜組織中各類型細胞的發(fā)育不同步,也會影響胚胎的種植。據(jù)文獻報道,卵巢刺激后子宮內(nèi)膜轉(zhuǎn)錄組異常,在P水平過早升高的周期中,有45%以上的周期會發(fā)生子宮內(nèi)膜組織學進展提前2 d,這可能是胚胎種植失敗的潛在機制[17]。這一現(xiàn)象在另一項凍融胚胎移植周期研究中被驗證,當在P水平過早升高的周期中產(chǎn)生的胚胎被玻璃化冷凍后,在隨后的復蘇移植周期中,正常妊娠率得以恢復[18]。另一項研究也表明,有四分之一的RIF患者表現(xiàn)為種植窗移位,對種植窗移位的RIF患者,使用子宮內(nèi)膜容受性芯片檢測,采用個體化移植,可獲得正常的妊娠率和種植率[19]。

子宮內(nèi)膜厚度是子宮內(nèi)膜容受性的最直觀的指標,內(nèi)膜厚度達9～14 mm時,有利于胚胎植入[20]。Peel等[21]研究結(jié)果顯示,與未妊娠組相比,妊娠組HCG日子宮內(nèi)膜厚度明顯較高,不同子宮內(nèi)膜厚度組妊娠率比較也顯示在一定范圍內(nèi)妊娠率與子宮內(nèi)膜厚度呈正相關。另一項研究顯示,隨著子宮內(nèi)膜厚度從9 mm增長到16 mm,妊娠率則從53%增加到77%,這表明不同內(nèi)膜厚度者的胚胎植入率確實存在顯著差異[22]。我們的研究結(jié)果也表明子宮內(nèi)膜厚度是RIF的獨立影響因素,為上述研究發(fā)現(xiàn)提供了新的佐證。子宮內(nèi)膜厚度對胚胎種植的影響可能和雌激素受體(ER)有關,ER通常處于較低水平,ER-ɑ是雌激素作用的主要受體。有研究證明,ER-ɑ缺失的小鼠子宮發(fā)育不良且不孕[23]。另一項前瞻性研究發(fā)現(xiàn),子宮內(nèi)膜厚度欠佳的女性表現(xiàn)出異常的ER-ɑ表達模式,與ER-ɑ相關連的基因也存在差異表達,這些基因可能通過影響增殖和血管生成從而在種植過程中發(fā)揮作用,可能是子宮內(nèi)膜厚度影響胚胎種植的潛在機制[24]。

Gn使用天數(shù)對RIF的影響研究較少。我們的回歸分析顯示Gn使用天數(shù)是RIF的獨立影響因素,Gn使用時間越短,發(fā)生RIF的風險越高。劉闖等[25]的研究顯示,在凍融胚胎移植周期,Gn促排卵時間與胚胎植入率和臨床妊娠率無顯著相關性,進一步分析各組Gn用量和促排卵時間對結(jié)局交互作用影響,結(jié)果顯示Gn促排時間≥15 d,且Gn累積用量≥40支時,凍融胚胎移植周期的胚胎植入率和臨床妊娠率顯著下降。關于Gn使用時間對RIF的影響還需要更深入的研究來評價。

RIF的另一個影響因素則是胚胎自身因素。許多研究發(fā)現(xiàn)胚胎遺傳物質(zhì)異常主要體現(xiàn)在染色體數(shù)目異常及結(jié)構(gòu)異常。已證實不同年齡患者形態(tài)學正常的優(yōu)質(zhì)胚胎其染色體非整倍體的發(fā)生率存在顯著差異,隨著患者年齡的增長,胚胎染色體非整倍體的發(fā)生率也隨之增高,RIF患者胚胎染色體非整倍體的發(fā)生率顯著高于非RIF的對照組[26]。另外,染色體結(jié)構(gòu)異常如易位、倒位、缺失及嵌合體也會影響胚胎的種植和發(fā)育[27]。

綜上所述,本研究提示女方年齡、不孕年限、HCG日內(nèi)膜厚度、HCG日P水平和Gn使用天數(shù)為RIF的獨立危險因素,在臨床診療過程中要特別注意上述因素的變化,及時進行治療和干預。但由于本研究屬于回顧性研究,且影響RIF的混雜因素較多,還需在今后的工作中進行多中心的前瞻性研究以進一步驗證。