方 偉，丁瑞霞，陳明強(qiáng)，王 雨，趙 旺，溫為庚，馬振華

1.三亞熱帶水產(chǎn)研究院/海南省深遠(yuǎn)海漁業(yè)資源高效利用與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 三亞 572000

2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510300

3.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所熱帶水產(chǎn)研究開(kāi)發(fā)中心，海南 三亞 572018

馬氏珠母貝 (Pinctadamartensii) 又稱合浦珠母貝，隸屬于軟體動(dòng)物門(mén)、瓣鰓綱、珍珠貝目、珍珠貝科、珠母貝屬，是世界上生產(chǎn)海水珍珠的主要貝種，也是我國(guó)生產(chǎn)海水養(yǎng)殖珍珠—“南珠”的主要貝類(lèi)之一[1]。馬氏珠母貝主要分布在熱帶和亞熱帶海域[2-4]，從日本千葉縣以南至菲律賓、越南、緬甸、印度尼西亞、斯里蘭卡、澳大利亞等均有分布[5-6]，我國(guó)主要分布在海南、廣東、廣西、臺(tái)灣等省沿海。

我國(guó)是世界海水珍珠養(yǎng)殖大國(guó)，馬氏珠母貝是人工插核育珠的主養(yǎng)貝種[7-9]。近年來(lái)馬氏珠母貝種質(zhì)退化，育珠貝病害嚴(yán)重，插核后的死亡率和吐核率增加，且優(yōu)質(zhì)珠率下降[10]。為了突破插核技術(shù)的局限性，人工將供體珍珠貝的外套膜組織塊或細(xì)胞小片一起移植到受體珍珠貝體內(nèi)，誘導(dǎo)其組織大量分泌珍珠質(zhì)，以實(shí)現(xiàn)無(wú)核珍珠的培育[11-13]。當(dāng)前國(guó)內(nèi)許多學(xué)者對(duì)珍珠貝細(xì)胞、組織體外培養(yǎng)進(jìn)行了大量研究，而國(guó)外相關(guān)的研究報(bào)道較少。Lei等[14]對(duì)馬氏珠母貝珍珠囊進(jìn)行了培養(yǎng)研究；李勇和孟立霞[15]研究了貝類(lèi)細(xì)胞的生存環(huán)境，總結(jié)了當(dāng)前貝類(lèi)細(xì)胞培養(yǎng)中存在的問(wèn)題，為建立細(xì)胞系提供了指導(dǎo)；靳雨麗等[16]對(duì)三角帆蚌 (Hypriosis cumingii) 外套膜細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行了研究，優(yōu)化了外套膜細(xì)胞培養(yǎng)及育珠的生產(chǎn)條件；岑妍慧和林江[17]改進(jìn)了馬氏珠母貝外套膜組織細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)和培養(yǎng)條件。

茶多酚是從茶葉中提取的多羥基酚類(lèi)物質(zhì)的總稱，主要包括黃烷醇類(lèi) (兒茶素類(lèi)) 、黃酮、花色苷類(lèi)等[18-19]。已有研究表明，茶多酚作為天然抗氧化物質(zhì)具有抗氧化、防輻射、抗衰老、抑菌、抗過(guò)敏、抗血栓和解毒等作用[20]。茶多酚不僅廣泛應(yīng)用于畜產(chǎn)品加工和貯藏、食物的防腐保鮮、飼料添加劑等，還可以調(diào)節(jié)前列腺癌[21]、乳腺癌[22]以及鼻咽癌[23]等多種腫瘤的生物學(xué)活性。劉芳君等[24]研究發(fā)現(xiàn)，質(zhì)量濃度低于0.05 g·L-1的茶多酚對(duì)小鼠 (Musmusculus) 黑色素瘤細(xì)胞的體外增殖無(wú)明顯的抑制作用，而當(dāng)其質(zhì)量濃度提高至0.15 g·L-1時(shí)對(duì)該細(xì)胞遷移具有抑制作用。田夢(mèng)秋等[25]研究發(fā)現(xiàn)，10～320 μg·mL-1的茶多酚對(duì)Hep2 細(xì)胞的體外增殖具有抑制作用，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，當(dāng)茶多酚的質(zhì)量濃度大于160 μg·mL-1時(shí)表現(xiàn)出較強(qiáng)的細(xì)胞毒性。王海琴等[26]研究了茶多酚對(duì)人牙槽骨成骨細(xì)胞增殖和凋亡的影響及分子機(jī)制。但茶多酚應(yīng)用于馬氏珠母貝外套膜組織和細(xì)胞培養(yǎng)的研究卻鮮有報(bào)道。本研究通過(guò)在馬氏珠母貝外套膜組織和細(xì)胞培養(yǎng)液中添加不同濃度的茶多酚，利用其抗氧化性、抑菌及解毒等特性來(lái)達(dá)到促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、提高細(xì)胞生物活性的目標(biāo)，從而進(jìn)一步優(yōu)化組織和細(xì)胞培養(yǎng)，探索最適完全培養(yǎng)液，以提高組織和細(xì)胞體外培養(yǎng)的成功率，為人工無(wú)核育珠提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用馬氏珠母貝由三亞熱帶水產(chǎn)研究院陵水試驗(yàn)基地提供。本次實(shí)驗(yàn)隨機(jī)選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的馬氏珠母貝，殼長(zhǎng)為 (5.80±0.32) cm，平均體質(zhì)量為 (26.50±0.13) g。暫養(yǎng)于室外遮陽(yáng)陸基玻璃池 (直徑2 m，高1.2 m 的圓筒形)，換水量為100%·d-1，投喂期間的餌料主要為牟氏角毛藻 (Chaetoceros mulleri)，水溫27～30 ℃，鹽度27‰～31‰，pH 7.6～8.1，溶解氧質(zhì)量濃度≥7.0 mg·L-1，亞硝酸鹽(NO-2)質(zhì)量濃度≤0.02 mg·L-1，氨氮 (NH+4-N) 質(zhì)量濃度≤0.2 mg·L-1。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 茶多酚的提取

根據(jù)前人對(duì)茶多酚提取工藝的研究[27-28]，采用溶劑提取法對(duì)茶多酚進(jìn)行提取。稱取研細(xì)的苦丁茶末3.0 g，加100 mL 體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇作為溶劑，在75 ℃下回流浸泡1.5 h，趁熱抽濾，取濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，待其呈膏狀時(shí)，用熱水溶解，并用無(wú)菌蒸餾水定容至50 mL 備用，通過(guò)吸光度法測(cè)定茶多酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%。

1.2.2 完全培養(yǎng)液的配制

基礎(chǔ)培養(yǎng)液配方：RMI-1640 培養(yǎng)基10.4 g·L-1、Hepes 緩沖液2.7 g·L-1、珍珠貝體液10.0 mL·L-1、青霉素100 000 IU·L-1、鏈霉素100 000 IU·L-1、氯化鈣 (CaCl2) 200 mg·L-1、滅活小牛血清200 mL·L-1、平衡鹽溶液50 mL·L-1、葡萄糖100 mL·L-1，pH 7.2。

自制珍珠貝體液：每次取10 個(gè)馬氏珠母貝的外套膜周邊黏液，經(jīng)2 000 r·min-1離心10 min，取上清液置于56 ℃水浴鍋中滅活處理20 min，并在紫外燈下滅菌20 min。加入培養(yǎng)液前需經(jīng)過(guò)0.2 μm 的濾膜過(guò)濾。

將獲取的茶多酚溶液稀釋為0%、5%、10%、15%和20% 5 種體積分?jǐn)?shù)，各取10 mL 溶液，分別加入到90 mL 的基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，配置成5 組含不同體積分?jǐn)?shù)茶多酚的完全培養(yǎng)液 (0%、0.5%、1.0%、1.5%和2.0%組)，其中0%組為對(duì)照組。

1.2.3 外套膜的獲取

選取健康且活力較強(qiáng)的馬氏珠母貝，用0.3%(w) 肥皂水反復(fù)洗刷，去除貝殼表面的附著物。割斷閉殼肌、取出外套膜，用雙蒸水反復(fù)沖洗，并在0.01% (w) 高錳酸鉀溶液中浸泡30 min 進(jìn)行初步消毒。將已消毒處理的外套膜邊緣部位分離出來(lái)，并在抗菌溶液 (青霉素4 000 U·mL-1，鏈霉素5 000 U·mL-1) 中浸泡15 min，期間反復(fù)沖洗。最后用滅菌的雙蒸水再次沖洗2～3 次后待用。

1.2.4 外套膜細(xì)胞的體外培養(yǎng)

將處理過(guò)的外套膜組織小片通過(guò)撕膜法獲取外套膜外表皮，用無(wú)菌單面刀片切成碎塊，放入含有300 mL 消化液 (0.25%胰蛋白酶，pH 7.2～7.4，預(yù)配好的胰蛋白酶消化液經(jīng)0.22 μm 除菌膜進(jìn)行除菌后再使用) 的培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃恒溫?fù)u床上以120 r·min-1的速率消化30 min，后移至2.5 mL 離心管中以1 000 r·min-1的速率離心5 min，棄上清液。在留有沉淀物的離心管中加入平衡鹽溶液繼續(xù)以1 000 r·min-1的速率離心2 min，重復(fù)操作3 次，獲取外套膜細(xì)胞。將相同數(shù)量的外套膜細(xì)胞放入5 組含不同濃度茶多酚的培養(yǎng)液中，置于25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)共設(shè)置5 組，每組3 個(gè)平行，每2 d 更換一次新鮮培養(yǎng)基。

觀察組使用CT檢查診斷準(zhǔn)確率明顯高于對(duì)照組使用B超檢查診斷準(zhǔn)確率，兩組數(shù)據(jù)差異明顯。有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)附表。

1.2.5 外套膜組織的體外培養(yǎng)

將處理過(guò)的外套膜放入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，先用脫脂棉吸收表面的液體殘留，然后用無(wú)菌雙面刀片將其切割成1 mm2大小均勻的組織小片。每個(gè)培養(yǎng)瓶 (225 cm2) 內(nèi)貼片30 個(gè)組織小片，待組織小片附著于瓶壁后，將培養(yǎng)瓶反轉(zhuǎn)并加入5 mL 完全培養(yǎng)液。放入恒溫箱中25 ℃培養(yǎng)24 h 后，將培養(yǎng)瓶再次反轉(zhuǎn)，使組織小片完全浸沒(méi)在培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)和觀察。通過(guò)前期開(kāi)展利用不同濃度的茶多酚對(duì)細(xì)胞活性影響的實(shí)驗(yàn)，得出當(dāng)茶多酚添加量為1.0%時(shí)，相對(duì)細(xì)胞生物活性最高，細(xì)胞生長(zhǎng)效果最佳，因此在開(kāi)展外套膜細(xì)胞和組織培養(yǎng)觀察實(shí)驗(yàn)時(shí)僅采用1.0%組培養(yǎng)液，每2 d 更換一次新鮮培養(yǎng)基。

1.3 測(cè)定指標(biāo)

1.3.1 外套膜細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

每隔48 h 對(duì)5 組分別取樣，按常規(guī)方法消化后各取1 mL 細(xì)胞懸液至EP 管中計(jì)數(shù)細(xì)胞量，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。

1.3.2 生物活性檢測(cè)

將收集的外套膜細(xì)胞懸浮液加入 96 孔培養(yǎng)板(Corning，美國(guó))，每孔100 μL。為確保每孔細(xì)胞的數(shù)量及活性一致，每批實(shí)驗(yàn)都使用同一管混合均勻的細(xì)胞懸液，并確保細(xì)胞密度約為5×104個(gè)·mL-1。向細(xì)胞懸液中分別加入5 種不同濃度的茶多酚。設(shè)置兩組對(duì)照分別為：僅含 100 μL 培養(yǎng)基的空白對(duì)照組和僅含100 μL 細(xì)胞懸液的對(duì)照組，每組3 個(gè)平行。添加完茶多酚后，將細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)箱 (25 ℃) 中培養(yǎng)24 h。

細(xì)胞活性檢測(cè)方法：使用 Cell Counting Kit-8(CCK-8) 試劑盒 (東仁化學(xué)) 按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。在100 μL 的細(xì)胞懸液中加入10 μL CCK-8 試劑，放回25 ℃培養(yǎng)箱孵育4 h 后，用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)450 nm 處的吸光度。

相對(duì)細(xì)胞活性計(jì)算方法：相對(duì)細(xì)胞活性=(實(shí)驗(yàn)組吸光度-培養(yǎng)基吸光度)/(對(duì)照組吸光度-培養(yǎng)基吸光度)。

1.3.3 細(xì)胞形態(tài)和鈣離子 (Ca2+) 濃度測(cè)定方法

采用倒置顯微鏡觀察組織細(xì)胞的形態(tài)與生長(zhǎng)狀況，并做好記錄。采用血?dú)夥治鰞x測(cè)定馬氏珠母貝外套膜組織及細(xì)胞培養(yǎng)液中的Ca2+濃度。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異顯著。結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差 ()”表示。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的茶多酚對(duì)細(xì)胞活性的影響

不同濃度的茶多酚對(duì)馬氏珠母貝外套膜細(xì)胞活性的影響見(jiàn)圖1。在不同濃度的茶多酚刺激下，5 組間的細(xì)胞活性均存在顯著性差異 (P＜0.05)，同時(shí)各組對(duì)細(xì)胞活性的影響差別較大。當(dāng)茶多酚的濃度為1.0%時(shí)，細(xì)胞的相對(duì)活性提高至3 倍，對(duì)細(xì)胞活性的促進(jìn)作用最大，其次為1.5%、0.5%、2.0%組。馬氏珠母貝外套膜細(xì)胞在5 組培養(yǎng)液中的生長(zhǎng)曲線如圖2 所示，均呈現(xiàn)“S”型，分為4 個(gè)階段：潛伏期 (第0—第2 天)、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(第3—第5 天)、平臺(tái)期 (第6—第14 天) 和衰退期 (第16—第30 天)。其中1.0%組峰值最高，在培養(yǎng)第12 天時(shí)細(xì)胞密度達(dá)6.9×105個(gè)·cm-2，其他4 組峰值高度依次為1.5%組＞0.5%組＞2.0%組＞0%組。在細(xì)胞培養(yǎng)第30 天，細(xì)胞密度最高的為1.0%組，最低的為0%組。結(jié)果表明，茶多酚對(duì)馬氏珠母貝外套膜細(xì)胞的活性具有顯著的促進(jìn)作用，有利于細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)，當(dāng)濃度為1.0%時(shí)，促進(jìn)效果最佳。

2.2 外套膜細(xì)胞的培養(yǎng)觀察

由2.1 中結(jié)果可知，1.0%組完全培養(yǎng)液對(duì)于馬氏珠母貝外套膜細(xì)胞的培養(yǎng)優(yōu)于其他組。因此采用1.0%組培養(yǎng)液對(duì)馬氏珠母貝外套膜細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，并利用倒置顯微鏡觀察不同時(shí)期的細(xì)胞生長(zhǎng)狀況 (圖3)。培養(yǎng)至第5 天時(shí)，細(xì)胞呈分散狀態(tài)，形態(tài)為圓形或橢圓形，其中數(shù)量最多的為近圓形的上皮細(xì)胞，大小為40～50 μm，分裂過(guò)程中上皮細(xì)胞呈現(xiàn)多種形態(tài)。當(dāng)培養(yǎng)至第10 天時(shí)，細(xì)胞貼壁效果較好，少量細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)液中，瓶壁出現(xiàn)少量晶體顆粒。第20 天時(shí)，細(xì)胞相互聚集，呈現(xiàn)島嶼狀分布。第30 天時(shí)，細(xì)胞聚集生長(zhǎng)現(xiàn)象更為明顯，培養(yǎng)瓶中可觀察到在細(xì)胞群周邊出現(xiàn)絮狀結(jié)晶。

圖3 馬氏珠母貝外套膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)觀察 (400×)注：a.培養(yǎng)第5 天的細(xì)胞； b.培養(yǎng)第10 天的細(xì)胞；c.培養(yǎng)第15 天的細(xì)胞； d.培養(yǎng)第20 天的細(xì)胞；e.培養(yǎng)第25 天的細(xì)胞；f.培養(yǎng)第30 天的細(xì)胞。Fig.3 Observation on cells of P.fucata mantle (400×)Note: a.Cell cultured on Day 5; b.Cell cultured on Day 10; c.Cell cultured on Day 15; d.Cell cultured on Day 20;e.Cell cultured on Day 25; f.Cell cultured on Day 30.

2.3 外套膜組織培養(yǎng)觀察

采用1.0%組培養(yǎng)液對(duì)馬氏珠母貝外套膜組織進(jìn)行培養(yǎng)，并利用倒置顯微鏡觀察不同時(shí)間組織的生長(zhǎng)狀況 (圖4)。外套膜組織培養(yǎng)第5 天時(shí)，組織塊周邊逐漸有細(xì)胞遷移出來(lái)，且組織塊有細(xì)胞遷移留下的痕跡 (圖4-a)。遷移出的細(xì)胞形態(tài)以圓形和橢圓形為主，呈顆粒狀分散。當(dāng)培養(yǎng)第10 天時(shí)，組織塊生長(zhǎng)暈上的細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛且細(xì)胞排列緊密，周邊細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步增加，并出現(xiàn)透明形態(tài)的細(xì)胞，胞體周邊有突起，且貼壁效果明顯，瓶底出現(xiàn)微小的顆粒狀晶體。培養(yǎng)第15—第20 天，組織塊周邊細(xì)胞密集分布形成細(xì)胞片，上皮細(xì)胞的分泌作用使瓶底顆粒狀晶體進(jìn)一步增多。培養(yǎng)第25 天，組織塊周邊出現(xiàn)很多纖維狀的突起，上皮細(xì)胞繼續(xù)分泌大量顆粒狀物質(zhì)，在瓶底形成明顯的白色塊狀物質(zhì)。培養(yǎng)第30 天，組織塊已變成了茶褐色，大部分組織和細(xì)胞仍然存活，但活力明顯減弱，細(xì)胞分泌能力停止。

圖4 馬氏珠母貝外套膜組織培養(yǎng)觀察 (400×)注：a.培養(yǎng)第5 天的組織；b.培養(yǎng)第10 天的組織；c.培養(yǎng)第15 天的組織；d.培養(yǎng)第20 天的組織；e.培養(yǎng)第25 天的組織；f.培養(yǎng)第30 天的組織。Fig.4 Observation on tissue of P.fucata mantle (400×)Note: a.Tissue cultured on Day 5; b.Tissue cultured for on Day 10; c.Tissue cultured on Day 15; d.Tissue cultured on Day 20;e.Tissue cultured on Day 25; f.Tissue cultured on Day 30.

2.4 外套膜組織和細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)Ca2+吸收的影響

采用1.0%組培養(yǎng)液對(duì)馬氏珠母貝外套膜組織和細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，其組織和細(xì)胞培養(yǎng)液中的Ca2+質(zhì)量濃度變化如表1 所示。在組織和細(xì)胞培養(yǎng)的整個(gè)過(guò)程中，培養(yǎng)液中Ca2+的質(zhì)量濃度隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)均呈現(xiàn)先減后增的趨勢(shì)，且培養(yǎng)液中的Ca2+質(zhì)量濃度均在第10 天達(dá)到最低，分別為 (163.58±8.40) 和 (148.98±6.58) mg·L-1。培養(yǎng)第0—第5 天，細(xì)胞培養(yǎng)液中的Ca2+質(zhì)量濃度低于組織培養(yǎng)液，且存在顯著性差異 (P＜0.05)，表明在培養(yǎng)前期細(xì)胞對(duì)Ca2+的吸收能力明顯強(qiáng)于外套膜組織；培養(yǎng)第5—第15 天，細(xì)胞培養(yǎng)液中的Ca2+質(zhì)量濃度在同期略低于組織培養(yǎng)液，但兩者之間無(wú)顯著性差異；培養(yǎng)第0—第15 天，組織和細(xì)胞培養(yǎng)液中的Ca2+含量均呈現(xiàn)遞減的趨勢(shì)，說(shuō)明在組織和細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中均吸收了培養(yǎng)液中的Ca2+。培養(yǎng)第15—第25天，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，組織和細(xì)胞培養(yǎng)液中的Ca2+質(zhì)量濃度均呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)，但始終低于初始質(zhì)量濃度 (200 mg·L-1)，兩者之間存在顯著性差異(P＜0.05)。

表1 馬氏珠母貝外套膜組織和細(xì)胞培養(yǎng)液中的Ca2+質(zhì)量濃度變化Table 1 Change of Ca2+ mass concentration in mantle tissue and cell culture medium of P.fucata

3 討論

3.1 茶多酚對(duì)馬氏珠母貝組織和細(xì)胞培養(yǎng)的影響

馬氏珠母貝屬于雙殼類(lèi)軟體動(dòng)物，作為低等動(dòng)物，其外套膜組織細(xì)胞的培養(yǎng)有別于哺乳動(dòng)物及其他脊椎動(dòng)物。當(dāng)前馬氏珠母貝外套膜組織和細(xì)胞培養(yǎng)還未取得突破性進(jìn)展，培養(yǎng)液的優(yōu)化一直處在不斷探索中[29]。常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)液具有良好的借鑒作用，但局限性比較明顯，通常情況下細(xì)胞的生物活性會(huì)隨著培養(yǎng)時(shí)間逐漸降低，影響細(xì)胞的體外培養(yǎng)效果[30]。茶多酚作為一種天然提取物，具有顯著的調(diào)節(jié)生物學(xué)活性、消除自由基、抗氧化、抑菌等功效[31]。在馬氏珠母貝細(xì)胞培養(yǎng)液中添加適量的茶多酚，其酚羥基提供的大量H+與培養(yǎng)液中的氧自由基發(fā)生反應(yīng)，從而提高培養(yǎng)液的抗氧化能力，促進(jìn)細(xì)胞新陳代謝，改善細(xì)胞活性，可進(jìn)一步優(yōu)化組織細(xì)胞培養(yǎng)效果。本研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)培養(yǎng)液中添加茶多酚的體積分?jǐn)?shù)為1.0%時(shí)，對(duì)細(xì)胞活性的促進(jìn)作用最優(yōu)，細(xì)胞的相對(duì)活性提高至3 倍。茶多酚在一定程度上消除了細(xì)胞微環(huán)境中的自由基，增強(qiáng)了機(jī)體抗氧化性，進(jìn)一步釋放了細(xì)胞的生物活性。曹東維等[32]研究發(fā)現(xiàn)，茶多酚在體外高糖環(huán)境下可延緩人腎小球系膜細(xì)胞 (Human glomerular mesangial cells,HGMCs) 衰老，提高細(xì)胞生物活性，這與本研究得出的結(jié)果相似。本研究共設(shè)置了含5 個(gè)體積分?jǐn)?shù)梯度茶多酚 (0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%) 的培養(yǎng)液，各組的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線均呈“S”型，說(shuō)明茶多酚在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中未產(chǎn)生抑制或其他不良反應(yīng)。通常細(xì)胞在生長(zhǎng)過(guò)程中伴隨著新陳代謝會(huì)排泄出二氧化碳、尿酸及其他有害物質(zhì)，容易滋生有害細(xì)菌，引起培養(yǎng)環(huán)境的惡化，長(zhǎng)期積累的毒素甚至?xí)?dǎo)致細(xì)胞死亡。在培養(yǎng)液中添加適量的茶多酚，其抗氧化、抑菌等功效可以維持培養(yǎng)環(huán)境的穩(wěn)定，從而促進(jìn)馬氏珠母貝外套膜細(xì)胞的新陳代謝，起到延緩衰亡的功效。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有添加茶多酚的實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)效果均優(yōu)于對(duì)照組，其中茶多酚體積分?jǐn)?shù)為1.0%時(shí)，培養(yǎng)效果最優(yōu)，與其他4 組存在顯著性差異 (P＜0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明了在細(xì)胞培養(yǎng)液中添加適量的茶多酚，對(duì)細(xì)胞增殖具有良好的促進(jìn)作用。也有研究發(fā)現(xiàn)不同劑量的茶多酚對(duì)癌細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)具有抑制作用，這可能與癌細(xì)胞的增長(zhǎng)和凋亡機(jī)制相關(guān)[33-34]。在培養(yǎng)液中添加過(guò)量的茶多酚是否對(duì)馬氏珠母貝外套膜組織和細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生抑制作用有待進(jìn)一步研究。

3.2 馬氏珠母貝外套膜組織與細(xì)胞培養(yǎng)觀察

在培養(yǎng)液中添加1.0%的茶多酚時(shí)，馬氏珠母貝外套膜組織和細(xì)胞均可正常分裂增殖。培養(yǎng)第5 天，組織塊周邊出現(xiàn)細(xì)胞遷移，呈顆粒狀分布，而細(xì)胞培養(yǎng)液中也相應(yīng)的出現(xiàn)大量細(xì)胞分裂增殖，兩者均觀察到了近圓形的上皮細(xì)胞。培養(yǎng)第10 天，組織和細(xì)胞培養(yǎng)液中均觀察到了細(xì)胞貼壁現(xiàn)象，且晶體顆粒初現(xiàn)。王愛(ài)民等[35]研究發(fā)現(xiàn)在馬氏珠母貝外套膜組織培養(yǎng)中，最先遷移出來(lái)的是顆粒狀細(xì)胞，緊隨其后的是透明細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞培養(yǎng)前期發(fā)現(xiàn)了大量的顆粒狀細(xì)胞，而透明細(xì)胞的數(shù)量相對(duì)較少，說(shuō)明在茶多酚的刺激下細(xì)胞活性增強(qiáng)，前期以大量分裂增殖為主，當(dāng)細(xì)胞增殖到一定數(shù)量后，開(kāi)始逐漸分化為其他形態(tài)的細(xì)胞。Machii 和Wada[36]在對(duì)褶紋冠蚌 (Cristariaplicata) 的研究中，以外套膜組織塊上部或邊緣部位觀察到褐色或茶色來(lái)判定其分泌作用，表明組織塊而非獨(dú)立的上皮細(xì)胞分泌了珍珠質(zhì)。本研究在培養(yǎng)第20 天后發(fā)現(xiàn)組織和細(xì)胞培養(yǎng)液中均出現(xiàn)了晶體顆粒，說(shuō)明馬氏珠母貝上皮細(xì)胞也具有分泌珍珠質(zhì)的功能。這可能是不同物種貝類(lèi)的外套膜組織和細(xì)胞在不同的培養(yǎng)條件下，其功能表達(dá)存在差異。

3.3 組織和細(xì)胞培養(yǎng)液中的Ca2+濃度變化

培養(yǎng)液是維持動(dòng)植物組織生長(zhǎng)的人工配制養(yǎng)料，細(xì)胞培養(yǎng)成功的關(guān)鍵在于培養(yǎng)液中含有充足的營(yíng)養(yǎng)組分，可提供細(xì)胞生長(zhǎng)所需的能量、微量元素及未知的生物因子等。由于珍珠的化學(xué)成分與產(chǎn)珠貝殼類(lèi)似，均由超過(guò)95%的碳酸鈣和4%的固體蛋白質(zhì)生物礦化而來(lái)[37-38]，因此在馬氏珠母貝外套膜組織和細(xì)胞培養(yǎng)液中添加適量的Ca2+，可保障其正常的分泌功能。本研究在完全培養(yǎng)液中添加了200 mg·L-1的Ca2+，隨著組織和細(xì)胞的培養(yǎng)，組織液中Ca2+質(zhì)量濃度在前10 d 呈遞減趨勢(shì)，說(shuō)明組織和細(xì)胞增殖的過(guò)程中吸收了大量的Ca2+，同時(shí)鏡檢發(fā)現(xiàn)在瓶壁上存在顆粒狀晶體也進(jìn)一步給予證實(shí)。陳勇富和錢(qián)國(guó)英[39]對(duì)三角帆蚌外套膜離體上皮組織珍珠質(zhì)分泌能力的研究也得出相似結(jié)論。在培養(yǎng)第15 天后，培養(yǎng)液中的Ca2+濃度隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高，說(shuō)明在培養(yǎng)后期馬氏珠母貝外套膜組織和細(xì)胞同正常的活體一樣，具有旺盛的鈣質(zhì)吸收和分泌功能。這與唐敏和石安靜[40]對(duì)外套膜外表皮細(xì)胞鈣的分泌研究結(jié)果一致。通過(guò)對(duì)培養(yǎng)液中Ca2+濃度變化的研究可知，當(dāng)培養(yǎng)液中添加適量的茶多酚、Ca2+及其他營(yíng)養(yǎng)成分后，馬氏珠母貝外套膜組織和細(xì)胞可正常增殖分化，且分泌珠質(zhì)的功能并未受到影響。在茶多酚的刺激下，細(xì)胞的氧化代謝能力增強(qiáng)，培養(yǎng)前期可吸收大量的Ca2+，為珍珠質(zhì)的分泌提供充足的鈣源。在馬氏珠母貝無(wú)核育珠的實(shí)踐生產(chǎn)中，既要保證細(xì)胞培養(yǎng)液中含有充足的Ca2+，同時(shí)也要確保外套膜細(xì)胞在茶多酚的刺激下對(duì)其充分吸收，以加快珠質(zhì)的分泌，提升珍珠的質(zhì)量和產(chǎn)量。

4 結(jié)論

本研究探索了茶多酚對(duì)馬氏珠母貝外套膜組織和細(xì)胞體外培養(yǎng)的影響。當(dāng)培養(yǎng)液中茶多酚的添加量控制在0.5%～2.0%時(shí)，均可增強(qiáng)馬氏珠母貝外套膜細(xì)胞的生物活性，其中添加量在1.0%時(shí)的增殖效果最優(yōu)；進(jìn)一步優(yōu)化了馬氏珠母貝外套膜細(xì)胞培養(yǎng)液 (1.0%茶多酚、RMI-1640 培養(yǎng)基10.4 g·L-1、Hepes 緩沖液2.7 g·L-1、珍珠貝體液10.0 mL·L-1、青霉素100 000 IU·L-1、鏈霉素100 000 IU·L-1、CaCl2200 mg·L-1、滅活小牛血清200 mL·L-1、平衡鹽溶液50 mL·L-1、葡萄糖100 mL·L-1，pH 7.2)；馬氏珠母貝外套膜組織和細(xì)胞在添加適量茶多酚后均可正常增殖分化，且培養(yǎng)液中的Ca2+濃度隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先減后增的趨勢(shì)。馬氏珠母貝外套膜組織和細(xì)胞培養(yǎng)液作為無(wú)核育珠的關(guān)鍵技術(shù)之一，可通過(guò)添加1.0%的茶多酚進(jìn)行優(yōu)化和改良，這不僅填補(bǔ)了茶多酚在貝類(lèi)細(xì)胞培養(yǎng)研究中的空白，也為貝類(lèi)育珠的實(shí)際生產(chǎn)提供了重要的參考依據(jù)。