王 逗，游錦若，申鉉日,2，李永成,2，夏光華,2，何燕富,2，張雪瑩,2

1.海南大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，海南 ?？?570228

2.南海水產(chǎn)資源高效利用工程研究中心，海南 ?？?570228

幾丁質(zhì)由N-乙酰-D-氨基葡萄糖 (GlcNAc) 通過(guò)β-1,4-糖苷鍵連接而成[1]，在自然界中廣泛分布于蝦和蟹的外殼[2]、真菌細(xì)胞壁、昆蟲(chóng)外骨骼以及一些綠藻中。僅水生生態(tài)系統(tǒng)中，幾丁質(zhì)每年的產(chǎn)量就超過(guò)1×1011t[3]。天然幾丁質(zhì)由于分子內(nèi)和分子間強(qiáng)大的氫鍵作用而性質(zhì)穩(wěn)定，難溶于水、稀酸、堿，僅溶于濃鹽酸、硝酸等強(qiáng)酸以及一些離子液體 (如咪唑基離子液體等)[4]，所以很難得到有效利用，造成了嚴(yán)重的資源浪費(fèi)。然而，幾丁質(zhì)的水解產(chǎn)物N-乙酰殼寡糖卻具有水溶性、細(xì)胞膜滲透性和易吸收性等理化特點(diǎn)；還具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、降血壓和降低膽固醇等多種生物活性[5]，廣泛應(yīng)用于生物化工、生物醫(yī)藥、農(nóng)產(chǎn)品、化妝品、保健品等領(lǐng)域[6]。其中，N,N-二乙?；鶜ざ?[(GlcNAc)2] 具有抗腫瘤、抗菌和免疫刺激作用等生物活性[7]。(GlcNAc)2在醫(yī)療方面，能夠防止術(shù)后組織黏連[8]；在農(nóng)業(yè)方面，能夠促進(jìn)植物生長(zhǎng)和誘導(dǎo)植物先天免疫[9]。此外，(GlcNAc)2還能誘導(dǎo)幾丁質(zhì)酶在鏈霉菌、蘑菇等生物中的表達(dá)[10-11]。

降解幾丁質(zhì)的方法包括物理法、化學(xué)法和生物酶法。迄今為止，采用物理法制備N(xiāo)-乙酰殼寡糖的研究較少，在工業(yè)上尚未形成規(guī)?；a(chǎn)。傳統(tǒng)的化學(xué)法采用強(qiáng)酸處理幾丁質(zhì)，反應(yīng)非常復(fù)雜，難以控制，并會(huì)產(chǎn)生各種二級(jí)化合物，難以去除。生物酶法作為綠色生產(chǎn)技術(shù)，可克服物理和化學(xué)法的缺點(diǎn)[12]，其反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)率高、對(duì)環(huán)境無(wú)污染，因而受到越來(lái)越多的關(guān)注[13]。

幾丁質(zhì)酶 (Chitinase,EC 3.2.1.14) 屬于糖苷水解酶，通過(guò)水解幾丁質(zhì)的β-(1→4) 糖苷鍵將其降解為N-乙酰殼寡糖或GlcNAc[14]。在碳水化合物-活性酶數(shù)據(jù)庫(kù) (CAZy) 中，根據(jù)催化結(jié)構(gòu)域氨基酸序列的保守性，被分為糖苷水解酶18 家族(GH18)、19 家族 (GH19) 和20 家族 (GH20)。GH18 家族幾丁質(zhì)酶主要由細(xì)菌、真菌、昆蟲(chóng)、植物和動(dòng)物產(chǎn)生，GH19 家族幾丁質(zhì)酶主要來(lái)源于高等植物和某些細(xì)菌[15]，而GH20 家族幾丁質(zhì)酶來(lái)源于細(xì)菌和人類(lèi)。不同來(lái)源的幾丁質(zhì)酶已在大腸桿菌(Escherichiacoli) 和枯草芽孢桿菌 (Bacillussubtilis)等異源宿主系統(tǒng)中以重組蛋白的形式表達(dá)[16-17]。幾丁質(zhì)酶有許多潛在的應(yīng)用，除了用于制備N(xiāo)-乙酰殼寡糖[18-19]外，還可以用作致病菌的抗真菌劑[20]，利用和清理幾丁質(zhì)廢棄物并將其轉(zhuǎn)化為生物乙醇[21]。

海洋環(huán)境中含有豐富的幾丁質(zhì)，是篩選產(chǎn)幾丁質(zhì)酶微生物的重要來(lái)源地之一。在前期研究中，本課題組從紅樹(shù)林蝦場(chǎng)土壤中篩選到一株能夠利用幾丁質(zhì)的放線菌橙黃小單孢菌(Micromonosporaaurantiaca)。迄今為止，已有諸多放線菌來(lái)源的幾丁質(zhì)酶被分離和鑒定[22-23]，但是橙黃小單孢菌來(lái)源幾丁酶的相關(guān)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究以橙黃小單孢菌的基因組DNA 為模板，克隆到了一條幾丁質(zhì)酶基因Machi3，并成功在大腸桿菌中表達(dá)。之后，對(duì)重組酶進(jìn)行純化及酶學(xué)特性的研究，采用掃描電鏡(SEM) 進(jìn)一步驗(yàn)證了該重組酶對(duì)幾丁質(zhì)底物的水解活性。最后，利用該重組酶水解膠體幾丁質(zhì)制備(GlcNAc)2，為幾丁質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)和利用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

橙黃小單孢菌：于海南省?？谑袞|寨港紅樹(shù)林蝦場(chǎng)土壤中篩選得到，保存于本實(shí)驗(yàn)室；pMD-19T載體購(gòu)于寶生物工程 (大連) 有限公司；E.coliDH5α、E.coliBL21 (DE3) 和表達(dá)載體pET-28a 購(gòu)于Novagen公司。

1.2 主要材料與儀器

細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒 (上海捷瑞生物工程有限公司)；PCR 產(chǎn)物純化試劑盒、DNA 膠回收試劑盒、蛋白Marker [生工生物工程 (上海) 股份有限公司]；T4 DNA 連接酶、DNA Marker [寶生物工程 (大連) 有限公司]；限制性內(nèi)切酶 (賽默飛世爾科技公司)；GlcNAc (上海源葉生物科技有限公司)；(GlcNAc)2-6標(biāo)準(zhǔn)品(山東青島博智匯力有限公司)；牛血清白蛋白 (武漢賽維爾生物科技有限公司)；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

DYCZ-24DN 型雙板垂直電泳槽、DYPC-31DN 型水平電泳槽 (北京六一生物科技有限公司)；A300 型PCR 擴(kuò)增儀、LG2020D 型凝膠成像系統(tǒng) (杭州朗基科學(xué)儀器有限公司)；高效液相色譜柱：Shodex Asahipak NH2P-50 4E (4.6 mm×250 mm,5 μm) (北京迪科馬科技有限公司)；K6600B 型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀 (北京凱奧科技發(fā)展有限公司)；NRY-200 型全溫培養(yǎng)搖床 (上海南榮實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司)；Phenom ProX 型SEM (飛納科學(xué)儀器有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 目的基因的克隆和生物信息學(xué)分析

本研究根據(jù)美國(guó)國(guó)家生物信息中心 (NCBI) 已公布的橙黃小單孢菌ATCC 27029 的全基因組DNA 序列信息 (NCBI 登陸號(hào)CP002162)，從中挖掘出一條可能編碼幾丁質(zhì)酶的基因序列，根據(jù)該基因序列采用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)特異性引物Primer-F (CATATGGTGGTCCTCCCGAACAACTTC，酶切位點(diǎn)為NdeI) 和Primer-R(AAGCTTTCAGGCCGGCAGCCGC，酶切位點(diǎn)為Hind III)，委托生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成。PCR 反應(yīng)體系 (50 μL)：TaKaRa LA Taq 0.5 μL，Primer-F (20 μmol·L-1) 1 μL，Primer-R (20 μmol·L-1) 1 μL，基因組DNA 1 μL，dNTP Mixture 8 μL，2 × GC Buffer I 25 μL，ddH2O 13.5 μL。PCR 擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性 1 min；94 ℃變性 30 s，58 ℃退火 30 s，72 ℃延伸100 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸 7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1% (質(zhì)量分?jǐn)?shù)) 瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后，根據(jù)DNA 膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)回收目的產(chǎn)物片段。

生物信息學(xué)分析軟件及網(wǎng)站：氨基酸序列分析采用NCBI 的BLAST 功能，信號(hào)肽序列分析用SignalP 5.0 在線服務(wù)器 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)，蛋白質(zhì)同源序列比對(duì)采用DNAMAN 軟件，保守域的分析采用NCBI 的CD-search 工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)，理論分子量和等電點(diǎn)的預(yù)測(cè)采用ExPASy 的ProtParam 工具 (http://web.expasy.org/protparam/)。

1.3.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建

將目的基因連接至pMD19-T 載體，之后轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α 感受態(tài)細(xì)胞中。根據(jù)菌落PCR 鑒定結(jié)果，挑選陽(yáng)性克隆子送至北京擎科生物科技有限公司測(cè)定目的基因序列。將測(cè)序正確的基因序列和pET-28a 表達(dá)載體分別用NdeI 和Hind III 雙酶切，回收目的基因片段和酶切質(zhì)粒，用T4 DNA 連接酶連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化至E.coliBL21 (DE3) 感受態(tài)細(xì)胞中。

1.3.3 重組幾丁質(zhì)酶的誘導(dǎo)表達(dá)和分離純化

將含有目的基因的重組菌接種到含50 μg·mL-1卡那霉素的Luria-Bertani (LB) 液體培基中，在37 ℃、180 r·min-1下振蕩培養(yǎng)至菌液OD600nm為0.8 時(shí)，加入終濃度為0.2 mmol·L-1的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG)，在16 ℃、180 r·min-1下誘導(dǎo)培養(yǎng)16 h。誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)束后，離心 (4 ℃,6 000 r·min-1,5 min) 收集菌體，用0.85% (質(zhì)量分?jǐn)?shù)) 的生理鹽水清洗后用pH 7.0 的磷酸鹽緩沖液重懸，之后置于冰水浴中超聲破碎 (功率350 W，工作 2 s，間隔5 s)。超聲破碎結(jié)束后在4 ℃、6000 r·min-1下離心15 min，上清液即為粗酶液。將粗酶液上樣于鎳親和層析色譜柱進(jìn)行分離純化，并利用SDSPAGE 分析蛋白的純度和分子量。

1.3.4 膠體幾丁質(zhì)的制備

參照Pan 等[24]的方法制備膠體幾丁質(zhì)，略有改動(dòng)。稱取10 g α-幾丁質(zhì)粉末，緩慢加入到200 mL預(yù)冷的濃鹽酸中 (邊加邊攪拌)，在4 ℃冰箱中靜置至溶液呈黃色。之后，向上述混合物中加入2 L預(yù)冷的50% (體積分?jǐn)?shù)) 乙醇，快速攪拌后于4 ℃下放置過(guò)夜。然后在4 ℃、4 000 r·min-1下離心15 min，并收集沉淀部分。用大量去離子水反復(fù)沖洗沉淀部分至中性，離心 (10 000 r·min-1,10 min) 后獲得的沉淀物即為膠體幾丁質(zhì)。

1.3.5 重組幾丁質(zhì)酶的酶活力測(cè)定

以膠體幾丁質(zhì)作為底物，采用3,5-二硝基水楊酸 (DNS) 法測(cè)定還原糖產(chǎn)量[25]。用0～5 μmol·L-1的GlcNAc 制作還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.122 6x-0.030 9，R2=0.990 8。酶活測(cè)定方法如下：將膠體幾丁質(zhì)加入至pH 7.0 的Tris-HCl 緩沖液中，混合均勻后制成終質(zhì)量濃度為50 mg·mL-1的膠體幾丁質(zhì)混懸液。取0.5 mL 上述膠體幾丁質(zhì)混懸液與0.5 mL 酶液混合，于50 ℃水浴中磁力攪拌反應(yīng)30 min。反應(yīng)結(jié)束后離心 (10 000 r·min-1,2 min)，獲得上清液。取0.5 mL 上清液，加入0.5 mL DNS 溶液，搖勻后煮沸5 min 進(jìn)行顯色反應(yīng)，用酶標(biāo)儀于540 nm 處測(cè)定吸光值，根據(jù)還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算還原糖產(chǎn)量。同時(shí)，以加熱滅活的酶液作為空白對(duì)照組。酶活力單位定義為：在上述反應(yīng)條件下，每分鐘催化膠體幾丁質(zhì)產(chǎn)生1 μmol GlcNAc所需要的酶量，用U 表示。

1.3.6 重組幾丁質(zhì)酶的蛋白濃度測(cè)定

采用Bradford 法[26]測(cè)定重組酶的蛋白濃度。以0～0.1 mg·mL-1的牛血清白蛋白制作蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=4.579 1x-0.002，R2=0.990 7。根據(jù)吸光值和標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算待測(cè)樣的蛋白濃度。

1.3.7 重組幾丁質(zhì)酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

1) 最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性研究。取等量的酶液，在不同反應(yīng)溫度 (25～65 ℃) 下按照標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定重組幾丁質(zhì)酶的酶活。將最適反應(yīng)溫度下的相對(duì)酶活定義為100%。為了測(cè)定重組幾丁質(zhì)酶的熱穩(wěn)定性，將酶液置于不同溫度 (40～60 ℃) 下孵育1 h 后取樣，按標(biāo)準(zhǔn)方法，在最適反應(yīng)溫度下測(cè)定殘余酶活。將孵育前幾丁質(zhì)酶的酶活定義為100%。

2) 最適反應(yīng)pH 及pH 穩(wěn)定性研究。取等量的酶液，在不同pH 的緩沖液 (50 mmol·L-1，pH 3.0～5.0 為檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液；pH 5.0～8.0 為磷酸鹽緩沖液；pH 7.0～9.0 為T(mén)ris-HCl 緩沖液；pH 9.0～10.0 為甘氨酸-NaOH 緩沖液) 中按照標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定重組幾丁質(zhì)酶的酶活。將最適反應(yīng)pH 下的相對(duì)酶活力定義為100%。為了測(cè)定重組幾丁質(zhì)酶的pH 穩(wěn)定性，將酶液加入到不同pH 的緩沖液(50 mmol·L-1，pH 3.0～4.0 為檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液；pH 5.0～6.0 為磷酸鹽緩沖液；pH 7.0～8.0 為T(mén)ris-HCl 緩沖液；pH 9.0～10.0 為甘氨酸-NaOH 緩沖液) 中，在4 ℃下孵育1 h。之后，在最適反應(yīng)溫度和pH 條件下，按照標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定殘余酶活。孵育前重組幾丁質(zhì)酶的酶活被定義為100%。

3) 化學(xué)試劑和金屬離子對(duì)酶活力的影響。為了研究化學(xué)試劑對(duì)重組幾丁質(zhì)酶酶活力的影響，向反應(yīng)體系中分別加入不同的化學(xué)試劑，包括尿素(終濃度200 mmol·L-1)，十二烷基硫酸鈉 (SDS，終濃度10 mmol·L-1)，乙二胺四乙酸 (EDTA，終濃度10 mmol·L-1)，吐溫 (Tween 20、40、60、80，終體積分?jǐn)?shù)1%) 和曲拉通X-100 (終體積分?jǐn)?shù)1%)，在最適反應(yīng)溫度和pH 條件下，按照標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定重組酶MaChi3 的酶活力。為了研究金屬離子對(duì)重組幾丁質(zhì)酶酶活力的影響，向反應(yīng)體系中分別加入終濃度1 mmol·L-1的鉀離子 (K+)、鎂離子 (Mg2+)、亞鐵離子 (Fe2+)、鈣離子 (Ca2+)、鈷離子 (Co2+)、鐵離子 (Fe3+)、鋇離子 (Ba2+)、鋅離子 (Zn2+)、銅離子 (Cu2+) 和銀離子 (Ag+)，在最適反應(yīng)溫度和pH 條件下，按照標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定重組酶MaChi3 的酶活力。將未添加任何化學(xué)試劑和金屬離子時(shí)的相對(duì)酶活定義為100%。

4) 底物特異性及動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定。將酶液分別與終質(zhì)量濃度為2 mg·mL-1的α-幾丁質(zhì)、膠體幾丁質(zhì)、蝦殼粉、淀粉、纖維素、不同脫乙酰度的殼聚糖 (脫乙酰度50%、70%、80%、85%、90%、95%) 進(jìn)行反應(yīng)，在最適反應(yīng)溫度和pH 條件下，測(cè)定重組酶MaChi3 的酶活力，研究該重組酶對(duì)不同底物的特異性。

在含有不同質(zhì)量濃度 (1～8 mg·mL-1) 膠體幾丁質(zhì)的反應(yīng)體系中，在最適反應(yīng)溫度和pH 條件下測(cè)定重組酶MaChi3 的酶活力。采用雙倒數(shù)作圖法，利用Origin 8.5 軟件進(jìn)行線性擬合，根據(jù)擬合公式計(jì)算MaChi3 的動(dòng)力學(xué)參數(shù)米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速率Vmax值。

1.3.8 幾丁質(zhì)的SEM 表征

將10 mg α-幾丁質(zhì)和膠體幾丁質(zhì)分別加入到50 mmol·L-1pH 7.0 的Tris-HCl 緩沖液中，均勻分散后加入2 mL 酶液，于55 ℃下振蕩孵育24 h。孵育結(jié)束后，在10 000 r·min-1下離心10 min，收集底物樣品，在60 ℃下干燥24 h。采用SEM 對(duì)孵育前后的α-幾丁質(zhì)和膠體幾丁質(zhì)的表面微觀形態(tài)進(jìn)行觀察。觀察前用導(dǎo)電雙面膠帶將樣品固定在樣品臺(tái)上，在真空環(huán)境下進(jìn)行鍍金處理，物料表面被一層薄薄的金覆蓋形成導(dǎo)電膜以獲得導(dǎo)電性。使用SEM 的顆粒表面分析系統(tǒng)觀察樣品的表面形態(tài)，加速電壓為10 kV，放大倍數(shù)為2500 倍[27]。

1.3.9 N,N-二乙酰基殼二糖的制備

將10 mg 膠體幾丁質(zhì)加入到50 mmol·L-1pH 7.0 的Tris-HCl 緩沖液中，均勻分散后加入5 mL 酶液，于55 ℃下振蕩反應(yīng)。定時(shí)從反應(yīng)瓶中取樣 (0、2、4、6、8、10、12、24 h)，在沸水浴中孵育10 min 后離心 (10 000 r·min-1,5 min)，取上清液用0.22 μm 濾頭過(guò)濾，濾液用于HPLC 檢測(cè)分析。檢測(cè)條件：安捷倫1260 高效液相色譜儀，配備Asahipak NH2P-504E (250 mm×4.6 mm，Shodex，日本) 色譜柱。流動(dòng)相為75% (體積分?jǐn)?shù)) 乙腈，流速為0.5 mL·min-1，柱溫箱溫度設(shè)定為25 ℃，檢測(cè)器溫度為25 ℃，進(jìn)樣量為10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm。(GlcNAc)1-6的保留時(shí)間依次為13.2、18.0、25.3、34.1、49.7 和77.3 min。

1.3.10 數(shù)據(jù)處理

采用Origin Pro 2018 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，每組實(shí)驗(yàn)做3 次平行。

2 結(jié)果

2.1 幾丁質(zhì)酶基因的克隆及生物信息學(xué)分析

以本實(shí)驗(yàn)室保存的橙黃小單孢菌的基因組DNA 為模板，利用特異性引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，獲得一條大約1 400 bp 的基因條帶 (圖1-a)。將測(cè)序結(jié)果提交至NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST 分析，發(fā)現(xiàn)其與查找到的幾丁質(zhì)酶基因序列一致性達(dá)到100%(NCBI 登錄號(hào)WP_013285221)，表明已成功從M.aurantiaca的基因組DNA 中克隆到幾丁質(zhì)酶基因，并將其記為Machi3。Machi3基因的全長(zhǎng)為1 371 bp，編碼456 個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)的蛋白理論相對(duì)分子質(zhì)量和pI 分別為47.44 kD 和7.55。信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果表明，在MaChi3 的N 端含有信號(hào)肽，信號(hào)肽的切割位點(diǎn)在第33—第34 個(gè)氨基酸之間。MaChi3 含有一個(gè)Glyco_18 結(jié)構(gòu)域 (位于40—305位氨基酸殘基) 和一個(gè)具有碳水化合物結(jié)合作用的RICIN 結(jié)構(gòu)域 (位于331—455 位氨基酸殘基，圖1-b)。將MaChi3 的氨基酸序列提交至NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST 分析，發(fā)現(xiàn)其與來(lái)源于那拉提瓦小單孢菌 (M.narathiwatensis) (NCBI 登錄號(hào)WP_091195038)、邱氏疣孢菌 (Verrucosisporasioxanthis)(NCBI 登錄號(hào)WP_164447165) 和石渣球孢菌 (Allocatelliglobosisporascoriae) (NCBI 登錄號(hào)WP_184833644) 的幾丁質(zhì)酶序列一致性分別為87.3%、83.5%和78.3%。但是，上述幾丁質(zhì)酶均為未經(jīng)驗(yàn)證的假定幾丁質(zhì)酶。因此，將MaChi3 的氨基酸序列提交至PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)，結(jié)果表明該酶與來(lái)源于約氏黃桿菌 (Flavobacteriumjohnsoniae) UW101 的GH18 家族幾丁質(zhì)酶具有32%的一致性。GH18 家族幾丁質(zhì)酶具有保守序列DxDxE 和SxGG，DxDxE基序?yàn)閹锥≠|(zhì)酶的催化中心，而SxGG 基序負(fù)責(zé)酶與底物的結(jié)合。在催化過(guò)程中，SxGG 基序中的絲氨酸對(duì)DxDxE 基序中第一個(gè)天冬氨酸上產(chǎn)生的暫時(shí)過(guò)剩的負(fù)電荷起穩(wěn)定作用[28-29]。如圖1-c 所示，在MaChi3 的催化域中含有符合上述保守基序的145DMDWE149序列，但是SxGG 基序中的絲氨酸殘基被丙氨酸殘基 (103AVGG106) 所代替，這一發(fā)現(xiàn)與Vaaje-Kolstad 等[30]報(bào)道的來(lái)源于乳酸乳球菌乳酸亞種 (Lactococcuslactisssp.Lactis) 的LlChi18A相一致。事實(shí)上，除了SxGG 基序中的絲氨酸外，酪氨酸也具有穩(wěn)定電荷的作用。盡管MaChi3 缺乏絲氨酸殘基，但卻含有酪氨酸殘基 (Y45，相當(dāng)于LlChi18A 的Y48)。另外，Vaaje-Kolstad 等[30]研究發(fā)現(xiàn)，在與LlChi18A 催化域相似性較高的50 個(gè)不同來(lái)源的GH18 家族幾丁質(zhì)酶的催化域中，約有一半蛋白質(zhì)的絲氨酸或酪氨酸殘基被替代，但是這兩個(gè)保守氨基酸殘基不會(huì)被同時(shí)替代。總之，以上序列分析結(jié)果表明，MaChi3 是一種新型的GH18 家族幾丁質(zhì)酶。

2.2 MaChi3 的誘導(dǎo)表達(dá)

重組菌經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后，利用鎳親和層析色譜柱對(duì)粗酶液進(jìn)行純化，在大約47 kD 處出現(xiàn)一條蛋白條帶 (圖2)，與推測(cè)的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量 (47.44 kD)基本吻合，表明重組酶MaChi3 已成功在大腸桿菌中表達(dá)。

圖2 重組酶 MaChi3 的 SDS-PAGE 分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of purified recombinant chitinase MaChi3

2.3 MaChi3 的酶學(xué)性質(zhì)研究

2.3.1 MaChi3 的最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性

為了測(cè)定重組幾丁質(zhì)酶MaChi3 的最適反應(yīng)溫度，以膠體幾丁質(zhì)作為底物，在25～65 ℃下進(jìn)行反應(yīng)。結(jié)果顯示，MaChi3 的最適反應(yīng)溫度為55 ℃，并且在50～60 ℃范圍內(nèi)具有較高的相對(duì)酶活力 (＞90.4%)。當(dāng)反應(yīng)溫度提高至65 ℃時(shí)，相對(duì)酶活力急劇下降，僅為23.5% (圖3-a)。為了測(cè)定MaChi3 的溫度穩(wěn)定性，將其置于40～60 ℃水浴中孵育1 h，然后在最適反應(yīng)溫度下測(cè)定其殘余酶活力。由圖3-b 可知，MaChi3 的溫度穩(wěn)定性良好，在50 ℃下孵育1 h 后殘余酶活力超過(guò)70%，在其最適反應(yīng)溫度55 ℃下孵育1 h 后殘余酶活力保持在67.3%。

圖3 重組幾丁質(zhì)酶MaChi3的最適反應(yīng)溫度 (a) 及熱穩(wěn)定性 (b)Fig.3 Optimal temperature (a) and thermal stability (b) of recombinant chitinase MaChi3

2.3.2 MaChi3 的最適反應(yīng)pH 及pH 穩(wěn)定性

重組幾丁質(zhì)酶MaChi3 的最適反應(yīng)pH 為7.0，并且在pH 6.0～9.0 范圍內(nèi)表現(xiàn)出較好的酶活力 ，相對(duì)酶活力高于64% (圖4-a)。為了測(cè)定MaChi3的pH 穩(wěn)定性，將該酶置于pH 3.0～10.0 的緩沖液中孵育，之后在最適反應(yīng)溫度和pH 條件下測(cè)定其殘余酶活力。MaChi3 在pH 6.0～9.0 范圍內(nèi)孵育1 h后殘余酶活力保持在80%以上，展現(xiàn)出了較好的穩(wěn)定性 (圖4-b)。此外，在其最適反應(yīng)pH (pH 7.0)下孵育1 h 后對(duì)其酶活力基本無(wú)影響，殘余酶活力為98%。

圖4 重組幾丁質(zhì)酶 MaChi3 的最適反應(yīng)pH (a) 及pH穩(wěn)定性 (b)Fig.4 Optimal pH (a) and pH stability (b) of recombinant chitinase MaChi3

2.3.3 化學(xué)試劑和金屬離子對(duì)MaChi3 的影響

如表1 所示，Triton X-100 和EDTA 對(duì)Ma-Chi3 的酶活力無(wú)顯著影響。尿素、SDS、吐溫 20和吐溫60 對(duì)MaChi3 具有不同程度的抑制作用，相對(duì)酶活力為58.1%～90.4%。吐溫40 和吐溫80 對(duì)MaChi3 的酶活力有輕微的促進(jìn)作用，相對(duì)酶活力分別為104.1%和108.4%。不同的金屬離子對(duì)Ma-Chi3 表現(xiàn)為不同程度的激活或抑制作用。Mg2+和Ca2+對(duì)其酶活力具有激活作用，相對(duì)酶活力分別為117.7% 和107.3%。Zn2+和Ba2+對(duì)MaChi3的酶活力幾乎無(wú)影響。而K+、Ag+、Co2+、Fe2+、Cu2+和Fe3+對(duì)MaChi3 的酶活力呈現(xiàn)出不同程度的抑制作用，相對(duì)酶活力降低至43.3%～87.2%(表1)。

表1 化學(xué)試劑和金屬離子對(duì)重組酶 MaChi3 酶活力的影響Table 1 Effects of metal ions and chemical reagents on activity of recombinant chitinase MaChi3

2.3.4 MaChi3 的底物特異性和動(dòng)力學(xué)參數(shù)

分別以α-幾丁質(zhì)、膠體幾丁質(zhì)、淀粉、纖維素、蝦殼粉和不同脫乙酰度的殼聚糖作為底物，研究重組幾丁質(zhì)酶MaChi3 的底物特異性。如圖5 所示，MaChi3 在催化膠體幾丁質(zhì)水解時(shí)表現(xiàn)出了最高的酶活力 (2.24 U·mg-1)。但是，以α-幾丁質(zhì)粉末作為底物時(shí)，酶活力僅為0.59 U·mg-1，前者約是后者的3.8 倍。當(dāng)MaChi3 以蝦殼粉為底物時(shí)，酶活力為0.84 U·mg-1，與其催化α-幾丁質(zhì)水解的活性相當(dāng)。以50%脫乙酰度的殼聚糖為底物時(shí)，MaChi3展現(xiàn)了較高的水解能力 (1.66 U·mg-1)。但是，隨著脫乙酰度的增加水解效率逐漸降低。以淀粉和纖維素為底物時(shí)，酶活力均較低，分別為0.40 和0.39 U·mg-1。此外，以膠體幾丁質(zhì)作為底物，MaChi3 的Km和Vmax值分別為5.93 mg·mL-1和8.58 μmol·(min·mg)-1。

圖5 重組酶 MaChi3 的底物特異性Fig.5 Substrate specificity of recombinant chitinase MaChi3

2.3.5 SEM 分析

為了進(jìn)一步驗(yàn)證重組幾丁質(zhì)酶MaChi3 對(duì)幾丁質(zhì)底物的水解能力，對(duì)酶解前及酶解后的α-幾丁質(zhì)和膠體幾丁質(zhì)進(jìn)行SEM 觀察。α-幾丁質(zhì)的纖維結(jié)構(gòu)緊密、表面略光滑 (圖6-a)。經(jīng)MaChi3 酶解后，表面微觀結(jié)構(gòu)被破壞，變得粗糙、不平整，并出現(xiàn)大小不均勻的碎片附著在表面 (圖6-b)。α-幾丁質(zhì)被制成膠體幾丁質(zhì)后，纖維結(jié)構(gòu)變得松散(圖6-c)，暴露出更多的酶切位點(diǎn)，因而經(jīng)MaChi3酶解后，表面變得更加粗糙和褶皺，有更多的小碎片附著在表面 (圖6-d)。以上結(jié)果表明，重組幾丁質(zhì)酶MaChi3 對(duì)幾丁質(zhì)具有水解活力，并對(duì)膠體幾丁質(zhì)的水解活力更高，該結(jié)論與底物特異性結(jié)果(圖5) 一致。

圖6 α-幾丁質(zhì) (a) 和膠體幾丁質(zhì) (b) 以及MaChi3酶解后的α-幾丁質(zhì) (c) 和膠體幾丁質(zhì) (d) SEM圖Fig.6 SEM images of α-chitin (a),colloidal chitin (b),MaChi3-hydrolyzed α-chitin (c) and MaChi3-hydrolyzed colloidal chitin (d)

2.3.6 N,N-二乙?；鶜ざ堑闹苽?/p>

如圖7-a 所示，在反應(yīng)初始階段，重組幾丁質(zhì)酶MaChi3 快速地將膠體幾丁質(zhì)水解為 (GlcNAc)2，同時(shí)生成了少量的GlcNAc。反應(yīng)24 h 后，(GlcNAc)2的產(chǎn)率基本保持穩(wěn)定，為285.5 mg·g-1幾丁質(zhì)，GlcNAc 的產(chǎn)率為39.8 mg·g-1幾丁質(zhì)，考慮到Ma-Chi3 的熱穩(wěn)定性 (圖3-b)，此時(shí)幾丁質(zhì)酶可能已經(jīng)失去了活性。

圖7 膠體幾丁質(zhì)水解產(chǎn)物分析 (a) 和 (GlcNAc)1-6 標(biāo)準(zhǔn)品及水解產(chǎn)物的HPLC圖 (b)Fig.7 Hydrolysis products of colloidal chitin (a) and HPLC spectra of (GlcNAc)1-6 stands and hydrolysis products (b)

3 討論

蝦、蟹等甲殼類(lèi)動(dòng)物在生產(chǎn)加工過(guò)程中會(huì)生成大量的廢棄物，其中，外殼占廢物干質(zhì)量的20%～58%。這些外殼中富含蛋白質(zhì) (20%～40%)、礦物質(zhì)(30%～60%) 和幾丁質(zhì) (20%～40%) 等成分。在工業(yè)上，蝦、蟹的外殼是生產(chǎn)幾丁質(zhì)的主要原料。幾丁質(zhì)經(jīng)水解后得到的N-乙酰殼寡糖和單糖具有多種生物活性，已被應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域。因此，從甲殼類(lèi)動(dòng)物的殼中提取幾丁質(zhì)并將其轉(zhuǎn)化為更具有應(yīng)用價(jià)值的水解產(chǎn)物 [ 如(GlcNAc)2] 是緩解廢棄物污染問(wèn)題的有效途徑。

在原核生物中，放線菌是最好的幾丁質(zhì)分解者之一，其體內(nèi)含有豐富的幾丁質(zhì)降解酶系[31]，可以利用幾丁質(zhì)作為唯一的碳源和氮源。本研究從放線菌橙黃小單孢菌的基因組DNA 中克隆到了一條幾丁質(zhì)酶基因Machi3，經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)分析得知，MaChi3 屬于GH18 家族幾丁質(zhì)酶。為了簡(jiǎn)化酶的分離純化過(guò)程，并提高酶的產(chǎn)量[32]，本研究將幾丁質(zhì)酶基因Machi3在E.coliBL21 (DE3) 中重組表達(dá)，經(jīng)過(guò)純化獲得了電泳純的重組幾丁質(zhì)酶。

不同微生物來(lái)源的幾丁質(zhì)酶對(duì)溫度表現(xiàn)出不同的敏感性，如來(lái)源于橙色假交替單胞菌(Pseudoalteromonasaurantia) 的幾丁質(zhì)酶最適反應(yīng)溫度為60 ℃[33]，而來(lái)源于冷喜幾丁質(zhì)節(jié)桿菌(Chitiniphilusshinanonensis) 的幾丁質(zhì)酶最適反應(yīng)溫度為50 ℃[34]。Huo 等[35]克隆表達(dá)了來(lái)源于維氏氣單胞菌 (Aeromonasveronii) B565 的幾丁質(zhì)酶，該重組酶的最適反應(yīng)溫度為40 ℃，在50 ℃下孵育1 h 后殘余酶活力僅為20%。相比之下，本研究克隆表達(dá)的重組幾丁質(zhì)酶MaChi3 具有較高的最適反應(yīng)溫度和良好的熱穩(wěn)定性，為拓寬幾丁質(zhì)酶的應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。同時(shí)，不同來(lái)源的幾丁質(zhì)酶對(duì)酸堿適應(yīng)性差異較大，已報(bào)道的幾丁質(zhì)酶最佳pH 值范圍為3.0～10.0[36-37]。由于幾丁質(zhì)酶在不同的氫離子(H+)濃度下解離程度不同，其高級(jí)結(jié)構(gòu)中S-S 鍵、疏水鍵及氫鍵受到影響，從而影響幾丁質(zhì)酶構(gòu)象的變化而表現(xiàn)出不同的活性。Wang 等[38]克隆、表達(dá)了假交替單胞菌 (Pseudoalteromonassp.) DL-6 來(lái)源的幾丁質(zhì)酶ChiA，其最適反應(yīng)pH 為9.0，在堿性條件下 (pH 8.0～12.0) 較穩(wěn)定。Chen 等[39]研究發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌 (Pseudomonasaeruginosa) 幾丁質(zhì)酶的最適pH 為4.5，在酸性條件下 (pH 4.5～6.0) 較穩(wěn)定。而本研究的重組幾丁質(zhì)酶MaChi3 是一種中性酶，并且在中性pH 附近 (pH 6.0～9.0) 具有較好的穩(wěn)定性。由表1 可知，金屬離子螯合劑EDTA 對(duì)MaChi3 的酶活性無(wú)顯著影響，說(shuō)明MaChi3 為非金屬依賴性蛋白酶。除了SDS 外，MaChi3 對(duì)所測(cè)試的化學(xué)試劑表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抵抗力。據(jù)報(bào)道，SDS 能夠破壞蛋白質(zhì)分子間和分子內(nèi)的氫鍵，從而破壞蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)[40]。MaChi3 與大多數(shù)幾丁質(zhì)酶相似，表現(xiàn)出嚴(yán)格的底物特異性[41-42]，對(duì)膠體幾丁質(zhì)的酶活力高于其他底物，這可能與底物的物理形態(tài)和脫乙酰度有關(guān)。此外，本研究對(duì)MaChi3 降解膠體幾丁質(zhì)的產(chǎn)物進(jìn)行了分析。在反應(yīng)過(guò)程中 (GlcNAc)2為主要產(chǎn)物，GlcNAc 為唯一副產(chǎn)物，產(chǎn)物類(lèi)型簡(jiǎn)單，有利于后續(xù)的分離純化。(GlcNAc)2已被廣泛用作藥用生物活性物質(zhì)以及抗菌劑和螯合劑。因此，MaChi3 在制備 (GlcNAc)2方面具有潛在應(yīng)用價(jià)值。

4 結(jié)論

本研究從海洋微生物橙黃小單孢菌的基因組DNA 中克隆到了一條幾丁質(zhì)酶基因Machi3，并成功在大腸桿菌中表達(dá)。MaChi3 的相對(duì)分子質(zhì)量為47 kD，為新型的GH18 家族幾丁質(zhì)酶。MaChi3 的最適反應(yīng)溫度為55 ℃，最適反應(yīng)pH 為7.0。在體外的穩(wěn)定性較好，在55 ℃下孵育1 h 后仍能保持大部分的酶活力 (67%)，在pH 6.0～9.0 范圍內(nèi)孵育1 h 后殘余酶活力超過(guò)80%。吐溫40、吐溫80、Ca2+和Mg2+對(duì)MaChi3 的酶活力有輕微的促進(jìn)作用，Triton X-100、EDTA、Zn2+和Ba2+對(duì)MaChi3無(wú)顯著性影響，其他化學(xué)試劑和金屬離子對(duì)MaChi3表現(xiàn)為不同程度的抑制作用。該酶對(duì)α-幾丁質(zhì)、膠體幾丁質(zhì)、蝦殼粉、不同脫乙酰度 (50%～95%)的殼聚糖、淀粉以及纖維素均有一定的水解活力，其中膠體幾丁質(zhì)是MaChi3 的最適底物，酶活力為2.24 U·mg-1。α-幾丁質(zhì)被制備成膠體幾丁質(zhì)后，纖維結(jié)構(gòu)變的更加松散，因而更有利于MaChi3 的水解作用。以膠體幾丁質(zhì)為底物時(shí)，MaChi3 的Km和Vmax值分別為5.93 mg·mL-1和8.58 μmol·(min·mg)-1。此外，膠體幾丁質(zhì)經(jīng)MaChi3 水解后主要產(chǎn)物為(GlcNAc)2，反應(yīng)24 h 后產(chǎn)率為285.5 mg·g-1幾丁質(zhì)，同時(shí)生成了少量的GlcNAc。MaChi3 優(yōu)良的酶學(xué)特性使其在 (GlcNAc)2制備方面有一定的應(yīng)用前景。