張藝　張興紅　王豐　郭沫言　孫美麗　汪漢成

摘要：為探究代森錳鋅在防控?zé)煵莅邪卟∵^程中對葉際微生態(tài)的影響，通過田間藥效試驗(yàn)評價了代森錳鋅對煙草靶斑病的防效，并采用Illumina高通量測序技術(shù)分析了代森錳鋅對煙葉葉際真菌和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性的影響。代森錳鋅200 g/667 m2處理1、3、9 d時，防效分別為65.50%、55.31%和45.03%。代森錳鋅處理1、3 d時，降低了感病部位葉際亡隔菌屬等3種真菌及假單胞屬、鞘脂單胞菌屬等6種細(xì)菌的相對豐度；增加了Symmetrospora、Sampaiozyma、莖點(diǎn)霉屬等7種真菌及甲基桿菌屬、Aureimonas 2種細(xì)菌的相對豐度。代森錳鋅處理1、3 d時，降低了健康煙葉葉際亡隔菌屬、尾孢屬等5種真菌及甲基桿菌屬、Aureimonas等4種細(xì)菌的相對豐度；但增加了Symmetrospora、鉚釘菇屬等4種真菌及假單胞屬等4種細(xì)菌的相對豐度。處理18 d時，降低了亡隔菌屬、尾孢屬等3種真菌及鞘脂單胞菌屬等5種細(xì)菌的相對豐度；但增加了Symmetrospora、鉚釘菇屬等6種真菌及基桿菌屬、Aureimonas等5種細(xì)菌的相對豐度。煙草靶斑病發(fā)生初期，代森錳鋅200 g/667 m2對煙草靶斑病具有一定的防效，代森錳鋅施用對煙葉感病與健康部位煙葉真菌和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性均有影響，且隨著時間的延長影響逐漸減弱。

關(guān)鍵詞：煙草靶斑?。淮i鋅；葉際微生態(tài)；立枯絲核菌；防效

中圖分類號：S481+.9；S435.72文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號：1002-1302（2023）17-0122-09

煙草靶斑?。╰obacco target spot）是由立枯絲核菌（Rhizoctonia solani Kühn）引起的一種真菌性病害，有性世代為瓜亡氏革菌［Thanatephorus cucumeris （Frank） Donk］，屬于擔(dān)子菌亞門（Basidiomycotina），亡革菌屬（Thanatephorus）［1］。苗期至大田成熟期均可發(fā)生。該病害主要危害煙草葉片，葉片被侵染后常出現(xiàn)圓形水漬狀斑點(diǎn)，病斑周圍有褪綠暈圈，病斑壞死部位易碎，形成穿孔，條件適宜時極易大面積流行成災(zāi)，嚴(yán)重影響煙葉產(chǎn)質(zhì)量［2-3］。目前，生產(chǎn)上常用包括代森錳鋅在內(nèi)的多種藥劑防控?zé)煵莅邪卟。?］。代森錳鋅是一種廣譜的硫代氨基甲酸酯類保護(hù)性殺菌劑，主要作用于菌體內(nèi)丙酮酸的氧化，施用后在作物表面形成1層保護(hù)膜，通過抑制病原菌孢子萌發(fā)來防止病害侵染［5-6］。

煙草葉斑類病害的發(fā)生與葉際微生物密切相關(guān)［7］，煙葉是葉際微生物的棲息地，葉際微生物是植物生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，發(fā)揮著重要的生態(tài)功能，對植物的生長發(fā)育、防御病害、固氮作用等均存在影響［8-14］。葉際微生物易受基因型、海拔、季節(jié)等生物和非生物因素的影響［15-17］。已有研究發(fā)現(xiàn)，煙草感白粉病和赤星病煙葉葉際優(yōu)勢真菌在門水平均分布于子囊菌門和擔(dān)子菌門，優(yōu)勢菌屬主要有鏈格孢屬、莖點(diǎn)霉屬和高氏白粉菌屬、曲霉屬；感赤星病煙葉葉際優(yōu)勢細(xì)菌主要為變形菌門，優(yōu)勢菌屬主要為泛菌屬、假單胞菌屬［18-20］。相較而言，作為煙草旺長期的主要葉斑類病害煙草靶斑病，人們對其危害期煙葉葉際微生物菌群結(jié)構(gòu)與多樣性卻缺乏認(rèn)識。

目前，化學(xué)防治是對包括煙草靶斑病在內(nèi)的植物病害防控的主要方式之一。病害的防控通常注重調(diào)查藥劑使用后病斑的增加情況，通過病情指數(shù)的增長來評價藥劑的防控效果，是基于肉眼觀察的宏觀評價。然而，藥劑在應(yīng)用后對煙葉葉際微生物的微觀影響卻鮮有關(guān)注。本研究通過田間藥效試驗(yàn)評價了代森錳鋅對煙草靶斑病的防效，并采用高通量測序技術(shù)分析了代森錳鋅不同施藥時間后，健康煙葉與感靶斑病煙葉葉際真菌和細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)與多樣性，旨在揭示代森錳鋅的持效期及其防控?zé)煵莅邪卟〉奈⑸鷳B(tài)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試品種為云煙87，為貴州省煙區(qū)的主栽烤煙品種。80%代森錳鋅可濕性粉劑（WP），由美國陶氏益農(nóng)有限公司生產(chǎn)。DNA抽提試劑盒（Fast DNA Spin Kit for Soil），由MP Biomedicals生物醫(yī)學(xué)公司生產(chǎn)；GeneJET膠回收試劑盒和Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建庫試劑盒，均由Thermo Scientific公司生產(chǎn)。

1.2 代森錳鋅對煙草靶斑病的防效研究

田間藥劑試驗(yàn)于2020年8月中旬在貴州省畢節(jié)市金沙縣煙區(qū)進(jìn)行。選取煙株長勢一致的煙田劃分小區(qū)，隨機(jī)排列，每小區(qū)20株煙株，小區(qū)設(shè)3次重復(fù)。于煙葉底部葉片零星出現(xiàn)病斑時開始用藥，代森錳鋅的田間用量為200 g/667 m2，用水量為 60 L/667 m2，采用多功能噴霧施肥器均勻噴施于葉片表面，直至液滴流失。以噴施等量清水處理為對照，小區(qū)間設(shè)保護(hù)行。在施藥前各處理隨機(jī)選擇相同部位、相同成熟度的葉片，分別標(biāo)記8個病斑，測量病斑直徑。施藥后1、3、9 d，分別測量各標(biāo)記病斑直徑，計算藥劑處理對病害擴(kuò)展的抑制率［21］。同時，各小區(qū)隨機(jī)選擇8株煙株，參照煙草靶斑病病害分級標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查各處理1、3、9 d的病情指數(shù)［22］，并計算代森錳鋅對煙草靶斑病的防效。

1.3 代森錳鋅對煙葉葉際微生態(tài)的影響

1.3.1 樣品采集

于施藥前0 d及施藥后1、3、9、18 d分別對試驗(yàn)小區(qū)煙葉取樣，用于后續(xù)試驗(yàn)。采用消毒剪刀剪取同一張葉片的感靶斑病部位和健康部位煙葉樣品，轉(zhuǎn)移至50 mL無菌離心管中，重復(fù)取樣5次。將所取樣品放入低溫保存箱，帶回實(shí)驗(yàn)室后-80 ℃保存?zhèn)溆?。樣品編號信息見?，因后期部分標(biāo)記煙葉被采烤，可供采集樣品的葉片數(shù)量有限，藥后9 d的感病和健康煙葉樣品及藥后18 d的健康煙葉樣品均為混合樣品。

1.3.2 代森錳鋅對煙葉葉際微生物群落結(jié)構(gòu)與多樣性的影響

采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取各樣本煙葉葉際微生物基因組DNA，使用NanoDrop 2 000測定提取的DNA濃度和純度，純度D260 nm/D280 nm值需在1.8～2.0之間，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳対DNA樣品進(jìn)行檢測，檢測合格后用于構(gòu)建文庫。

以上述樣品的總DNA為模板，以真菌引物ITS1-5F-F（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）和ITS1-1F-R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）對葉際微生物基因組DNA ITS1區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增［23］。以細(xì)菌引物515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）對樣品煙葉葉際微生物基因組DNA 16S-V4區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增［24］。PCR擴(kuò)增體系與反應(yīng)程序參照文獻(xiàn)［23-24］的方法進(jìn)行。擴(kuò)增產(chǎn)物回收后，使用Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建庫試劑盒進(jìn)行文庫的構(gòu)建，采用Illumina測序平臺（Illumina Novaseq 6 000，Illumina公司，San Diego，CA，美國）對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙端測序分析，以上分析均在北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

1.3.3 測序數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析

采用Excel 2019對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計算代森錳鋅對煙草靶斑病的防效。測序數(shù)據(jù)通過Flash和Trimmomatie軟件進(jìn)行過濾優(yōu)化和雙端序列連接。高質(zhì)量序列使用UPARSE軟件（version 7.1）對相似度≥97%序列進(jìn)行OTU（operational taxonomic units）聚類，并在聚類過程去除單序列和嵌合體。真菌和細(xì)菌分別通過Unit（7.2）和SILVA132的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行注釋。采用Qime（version19.1）軟件計算α多樣性指數(shù)，運(yùn)用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對真菌和細(xì)菌的α多樣性指數(shù)進(jìn)行差異顯著性分析。計算Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)和Goods_coverage指數(shù)，分析煙葉葉際微生物群落的多樣性、豐富度以及覆蓋度。利用R語言工具統(tǒng)計并繪制相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析圖、門屬水平相對豐度圖、功能預(yù)測圖，分析樣品微生物群落結(jié)構(gòu)與多樣性、互作關(guān)系等。

2 結(jié)果與分析

2.1 代森錳鋅對煙草靶斑病的防效

由表2可知，代森錳鋅200 g/667 m2處理降低了煙草靶斑病的嚴(yán)重程度，對煙草靶斑病具有一定的防控效果?；诓“呙娣e和病情指數(shù)調(diào)查的防控效果較為一致，隨著用藥時間的延長，防效均逐漸減弱?；诓“呙娣e的評價發(fā)現(xiàn)，施藥1、3、9 d后的防效分別為69.49%、60.79%、53.33%；基于病情指數(shù)的評價發(fā)現(xiàn)，施藥1、3、9 d后的防效分別為65.50%、55.31%、45.03%。

2.2 代森錳鋅對煙草靶斑病葉際微生態(tài)的影響

2.2.1 代森錳鋅對煙葉微生物α多樣性的影響

由表3可知，真菌群落中，代森錳鋅處理前后的感病煙葉與健康煙葉的覆蓋度指數(shù)在0.96及以上；細(xì)菌群落中，代森錳鋅處理前后感靶斑病煙葉樣品組與健康煙葉樣品組的覆蓋度指數(shù)在0.99以上，二者均表明樣本中序列被檢測出的概率高，測序結(jié)果能夠表示樣本中實(shí)際的真菌和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。對煙葉微生物多樣性進(jìn)行評估可知，真菌群落中，施藥前的感病煙葉與健康煙葉的豐富度和多樣性指數(shù)相同，無差異顯著。感病煙葉，代森錳鋅處理1、3 d時，Shannon、Chao1和ACE指數(shù)均比施藥前高；Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)與施藥前無顯著性差異。健康煙葉，代森錳鋅處理1、3、18 d時，Shannon、Chao1和ACE指數(shù)均比施藥前高；Shannon指數(shù)與施藥前存在顯著性差異，Chao1指數(shù)與施藥前無顯著差異。

細(xì)菌群落中，代森錳鋅處理前的感病煙葉的多樣性和豐富度均高于施藥前的健康煙葉，二者在多樣性上無差異顯著。代森錳鋅處理感病煙葉1、3 d時，Shannon、Chao1和ACE指數(shù)均比施藥前高，代森錳鋅處理健康煙葉1、18 d時，Shannon指數(shù)比施藥前高，而施藥3 d Shannon指數(shù)低于施藥前，均無顯著性差異；代森錳鋅處理1和 3 d 的Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)比施藥前低，18 d時高于施藥前，均無顯著性差異。

2.2.2 代森錳鋅對煙葉微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

由圖1和表4可知，真菌群落在門水平上，代森錳鋅處理前后，感靶斑病煙葉與健康煙葉的優(yōu)勢菌群均為擔(dān)子菌門（Basidiomycota）和子囊菌門（Ascomycota），健康煙葉還有被孢霉門（Mortierellomycota）。施藥前感靶斑病煙葉中擔(dān)子菌門相對豐度（88.50%）高于健康煙葉（56.71%）。代森錳鋅處理感靶斑病煙葉1、3 d時，擔(dān)子菌門相對豐度降低，分別降低47.0、79.1百分點(diǎn)。代森錳鋅處理健康煙葉1、3、18 d時，擔(dān)子菌門相對豐度均降低，分別降低29.56、44.09、10.39百分點(diǎn)。

真菌群落在屬水平上，代森錳鋅處理前后，感靶斑病煙葉與健康煙葉的主要菌屬有亡隔菌屬（Thanatephorus）、Symmetrospora、鉚釘菇屬（Gomphidius）、尾孢屬（Cercospora）、鏈格孢屬（Alternaria）、Sampaiozyma、鐮刀菌屬（Fusarium）、莖點(diǎn)霉屬（Phoma）、Plectosphaerella、枝孢霉屬（Cladosporiun）。代森錳鋅處理前，感靶斑病煙葉與健康煙葉的優(yōu)勢菌屬均為亡隔菌屬，施藥前感靶斑病煙葉中亡隔菌屬相對豐度（88.13%）高于健康煙葉（54.67%）。代森錳鋅處理感靶斑病煙葉1、3 d時，亡隔菌屬相對豐度均降低，分別降低了50.1、85.84百分點(diǎn)。代森錳鋅處理健康煙葉1、3 d時，亡隔菌屬相對豐度也降低了47.13、51.33百分點(diǎn)，感病煙葉施藥1 d時亡隔菌屬與表4中其他9個菌屬的相對豐度存在顯著性差異，健康煙葉施藥1、3 d時亡隔菌屬與其他菌屬不存在顯著性差異。此外，Symmetrospora、Sampaiozyma、鉚釘菇屬、尾孢屬、莖點(diǎn)霉屬也是葉際微生物群落的重要組成部分。代森錳鋅處理感靶斑病煙葉1、3 d時，Plectosphaerella相對豐度降低，而Sampaiozyma、Symmetrospora、莖點(diǎn)霉屬、鉚釘菇屬相對豐度升高。代森錳鋅處理健康煙葉1、3、18 d時，Symmetrospora、鉚釘菇屬相對豐度升高，亡隔菌屬和尾孢屬相對豐度降低。Sampaiozyma、莖點(diǎn)霉屬相對豐度在施藥 3 d 時先降低，18 d時再升高（圖1、表4）。

細(xì)菌群落在門水平上，代森錳鋅處理前后感靶斑病煙葉與健康煙葉的主要菌群有變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、互養(yǎng)菌門（Synergistetes）、酸桿菌門（Acidobacteria）、異常球菌-棲熱菌門（Deinococcus-Thermus）、廣域古菌門（Euryarchaeota），健康煙葉中獨(dú)有的菌群有綠彎菌門（Chloroflexi）。施藥前感靶斑病煙葉與健康煙葉的優(yōu)勢菌門均為變形菌門，施藥前感靶斑病煙葉中變形菌門相對豐度（26.99%）高于健康煙葉（8.07%），其余菌群相對豐度較小。代森錳鋅處理感病煙葉1、3 d時，變形菌門相對豐度升高，分別升高了10.81%、9.44%。代森錳鋅處理健康煙葉1、18 d時，變形菌門相對豐度也升高，分別升高了1.62%、25.66%。施藥3 d時，相對豐度降低，比施藥前降低了3.18%（圖1、表4）。

細(xì)菌群落在屬水平上，代森錳鋅處理前后感靶斑病煙葉與健康煙葉的主要菌群有甲基桿菌屬（Methylobacterium）、假單胞屬（Pesudomonas）、Aureimonas、不明根瘤菌屬（Unidentified_Rhizobiaceae）、鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）、馬賽菌屬（Massilia）、Unidentified_Christensenellaceae、微桿菌屬（Microbacterium）、冷桿菌屬（Frigoribacterium）、泛菌屬（Pantoea）。施藥前感靶斑病煙葉與健康煙葉的優(yōu)勢菌屬均為甲基桿菌屬，施藥前感病煙葉中甲基桿菌屬的相對豐度（5.01%）高于健康煙葉（4.63%）。代森錳鋅處理感靶斑病煙葉1、3 d時，甲基桿菌屬相對豐度升高，分別升高了16.51%、22.39%。施藥1 d時，除假單胞屬以外，甲基桿菌屬與其他8個菌屬的相對豐度存在顯著性差異，施藥3 d時，甲基桿菌屬與其他9個菌屬之間均存在顯著性差異。代森錳鋅處理健康煙葉1、3 d時，甲基桿菌屬相對豐度降低，分別降低了0.10百分點(diǎn)、1.44百分點(diǎn)；施藥18 d時，相對豐度升高，比施藥前升高了24.26百分點(diǎn)。此外，代森錳鋅處理感靶斑病煙葉1、3 d時，假單胞屬、不明根瘤菌屬、鞘脂單胞菌屬、馬賽菌屬、微桿菌屬、冷桿菌屬相對豐度下降，而Aureimonas相對豐度升高。施藥后健康煙葉主要菌屬的相對豐度變化為：假單胞屬在施藥1、3、18 d時升高，Aureimonas在施藥1、18 d 時升高，3 d時降低；馬賽菌屬在施藥1、3、18 d時的相對豐度均減少。健康煙葉施藥前和施藥后 3 d，甲基桿菌屬與表4中其他9個菌屬的相對豐度存在顯著性差異，而施藥1、18 d時，甲基桿菌屬與其他菌屬之間不存在顯著性差異（圖1、表4）。

2.2.3 代森錳鋅對煙葉微生態(tài)相關(guān)性的影響

本研究對真菌和細(xì)菌屬水平top100的物種數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。由圖2可知，施藥前后在真菌群落中，擔(dān)子菌門和子囊菌門中的菌屬較多，占據(jù)主要位置，擔(dān)子菌門中的Symmetrospora與亡隔菌屬之間呈正相關(guān)（P<0.05，R>0.1），亡隔菌屬與子囊菌門中的鐮刀菌屬之間呈正相關(guān)，鐮刀菌屬與鉚釘菇屬之間呈正相關(guān)，其余菌屬之間均呈負(fù)相關(guān)。在細(xì)菌群落中，變形菌門中的菌屬高于其他菌門，占據(jù)主要位置，所有菌屬之間均呈負(fù)相關(guān)，其中厚壁菌門中的腸球菌屬僅與酸桿菌門中的Candidatus_Solibacter， 變形菌門中的Alealigenes僅與薩特氏菌屬之間呈負(fù)相關(guān)。

2.2.4 代森錳鋅對煙葉微生物群落FUNGuild與PICRUSt功能預(yù)測

真菌群落FUNGuild功能預(yù)測結(jié)果（圖3-A）表明，施藥前感靶斑病煙葉的OTU中，優(yōu)勢功能群是植物病原類群。施藥前健康煙葉的OTU中，優(yōu)勢功能群是未定義類群。感靶斑病煙葉施藥1、3、9、18 d后植物病原類群占比均小于施藥前，而未定義類群占比高于施藥前。健康煙葉施藥1、3 d后，未定義類群占比小于施藥前，而植物病原類群占比大于施藥前； 9、18 d后未定義的類群占比大于施藥前，而植物病原類型占比小于施藥前。此外，感靶斑病煙葉的OTU中，動物病原內(nèi)生菌、植物病原木材腐生菌類群、植物病原木材腐生菌類型、內(nèi)生植物病原、寄生真菌-未定義的腐生菌、未定義的腐生生物類型、外生菌根寄生真菌類群、植物病原類群占比次之，其他菌群占比較少，但也有不可忽視的作用。健康煙葉OTU中，外生菌根寄生真菌類型、植物病原木材腐生菌類型、內(nèi)生植物病原類型占比次之，其他菌群占比較小。

利用KEGG Orthology（KO）數(shù)據(jù)庫和COG數(shù)據(jù)庫比對感靶斑病煙葉與健康煙葉細(xì)菌OTU對應(yīng)的基因，進(jìn)行PICRUSt基因預(yù)測。由圖3-B可知，感靶斑病煙葉與健康煙葉施藥前后共獲得6類生物代謝通路功能類群，其中包括代謝類群、遺傳信息處理類群、環(huán)境信息處理類群、細(xì)胞過程類群、人類疾病類群、有機(jī)系統(tǒng)類群。其中，代謝、遺傳信息處理和環(huán)境信息處理類群為主要類群。

3 結(jié)論與討論

本研究基于病斑面積與病情指數(shù)的評價發(fā)現(xiàn)，代森錳鋅施藥后9 d的防效分別為55.33%和45.03%，且防效隨間隔時間的增加而逐漸降低，均低于70%，表明煙草靶斑病發(fā)生初期，代森錳鋅在200 g/667 m2使用劑量下1次使用時的防控效果并不理想。為此，其在防控?zé)煵莅邪卟r應(yīng)考慮增加藥劑劑量或增加藥劑使用次數(shù)，間隔期宜<9 d。

葉際微生物是一個龐大且多樣性豐富的群體［25］，煙草葉部病害與葉際微生物群落結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，不同葉部病害發(fā)生時其葉際優(yōu)勢菌群間存在差異。已有研究發(fā)現(xiàn)，煙草亞隔孢葉斑病危害期其葉際優(yōu)勢真菌有Boeremia、Meyerozyma、莖點(diǎn)霉屬和鏈格孢屬，優(yōu)勢細(xì)菌有假單胞菌屬和泛菌屬［26］；煙草赤星病危害期其葉際優(yōu)勢真菌有鏈格孢屬和莖點(diǎn)霉屬，優(yōu)勢細(xì)菌有泛菌屬和假單胞菌屬［19-20］。煙葉霉?fàn)€病危害期其葉際優(yōu)勢真菌有曲霉屬、鏈格孢屬、尾孢屬和莖點(diǎn)霉屬，優(yōu)勢細(xì)菌有假單胞菌屬和泛菌屬［27］。本研究發(fā)現(xiàn)，靶斑病感病煙葉與健康煙葉的優(yōu)勢真菌屬均為亡隔菌屬，占比較多的真菌還有Symmetrospora、Sampaiozyma、鉚釘菇屬、尾孢屬、莖點(diǎn)霉屬；鐮刀菌屬、Plectosphaerella和鏈格孢屬占比較少。結(jié)果與前人研究的優(yōu)勢菌屬均為其致病菌的結(jié)果［28］一致，同時赤星病、亞格孢殼屬、白粉病煙葉上均未檢測到亡隔菌屬真菌，推測亡隔菌屬并不是煙葉葉際習(xí)居菌，煙草靶斑病的初始侵染源可能來自于其他寄主或者環(huán)境。

代森錳鋅在當(dāng)?shù)匚醋鳛榉乐螣煵萑~斑病類病害的主要藥劑，因此病原菌對于該藥劑的抗藥性較低。該藥劑的使用對所有葉際真菌和細(xì)菌菌屬均產(chǎn)生了影響。感病煙葉施藥后葉際真菌亡隔菌屬、Plectosphaerella的相對豐度降低； Symmetrospora、 莖點(diǎn)霉屬、鉚釘菇屬的相對豐度均增加。健康煙葉施藥后，葉際真菌亡隔菌屬、尾孢屬相對豐度均降低；Symmetrospora、鉚釘菇屬、Sampaiozyma相對豐度均升高。在細(xì)菌群落屬水平上， 感病煙葉與健康煙葉的優(yōu)勢細(xì)菌菌屬均為甲基桿菌屬和假單胞屬，占比較少的細(xì)菌菌屬有Aureimonas、不明根瘤菌屬、鞘脂單胞菌屬、馬賽菌屬、Unidentified_Christensenellaceae、微桿菌屬、冷桿菌屬、泛菌屬。推測甲基桿菌屬為煙葉葉際優(yōu)勢習(xí)居菌。施用代森錳鋅后各細(xì)菌菌群相對豐度均發(fā)生變化。感病煙葉施藥后假單胞屬、不明根瘤菌屬、鞘脂單胞菌屬、馬賽菌屬、微桿菌屬、冷桿菌屬的相對豐度均降低；甲基桿菌屬、Aureimonas的相對豐度均升高。健康煙葉施藥后甲基桿菌屬、馬賽菌屬、Aureimonas的相對豐度均降低；假單胞屬、冷桿菌屬相對豐度均升高。為此，本研究發(fā)現(xiàn)代森錳鋅會影響煙葉包括亡隔菌屬在內(nèi)的多種病原菌及包括假單胞屬在內(nèi)的多種非致病菌菌群結(jié)構(gòu)的變化，進(jìn)一步驗(yàn)證了代森錳鋅的廣譜性。已有研究發(fā)現(xiàn)，藥劑的使用會改變煙葉葉際微生物群落結(jié)構(gòu)，Chen等研究發(fā)現(xiàn)，施用菌核凈會使煙葉葉際細(xì)菌中鞘脂單胞菌屬、黃色桿菌屬和沙雷氏菌屬的相對豐度降低［29］。以上研究結(jié)果均與本研究結(jié)果類似。除靶標(biāo)病原菌外，本研究發(fā)現(xiàn)煙葉葉際部分真菌與細(xì)菌的菌屬相對豐度也有所降低，說明代森錳鋅對靶斑病外的其他病害也具有一定的抑制作用；同時，發(fā)現(xiàn)部分菌屬的相對豐度升高，推測這些菌屬也參與了煙草靶斑病的發(fā)生或危害，代森錳鋅對這些菌屬的抑制活性較弱。煙草感靶斑病煙葉與健康煙葉葉際微生物群落結(jié)構(gòu)與自然環(huán)境條件關(guān)系密切，目前環(huán)境因子對葉際微生物的影響也缺乏一定的認(rèn)識，試驗(yàn)下一步將從環(huán)境因子（溫度、濕度、降水量等）和病情指數(shù)等方面對煙草感靶斑病煙葉和健康煙葉葉際生態(tài)的影響進(jìn)行分析驗(yàn)證。

菌群相關(guān)性結(jié)果表明，在真菌門水平下，擔(dān)子菌門和子囊菌門的菌屬占比較大；在細(xì)菌門水平下，變形菌門的菌屬占比較大，進(jìn)一步驗(yàn)證了高通量測序結(jié)果。真菌群落中的菌屬之間主要呈負(fù)相關(guān)，僅有少部分菌屬之間呈正相關(guān)，其中，擔(dān)子菌門中的Symmetrospora菌屬與亡隔菌屬之間呈正相關(guān)，亡隔菌屬與子囊菌門中的鐮刀菌屬之間呈正相關(guān)，鐮刀菌屬與鉚釘菇屬之間呈正相關(guān)，推測它們之間存在互利共生關(guān)系，或它們有相同的營養(yǎng)所需，其余菌屬以及細(xì)菌各菌屬之間呈負(fù)相關(guān)。前人研究表明，真菌和細(xì)菌各屬之間對資源存在著潛在的競爭［30］，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)施藥前后大量菌屬之間呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，推測由于藥劑的使用增加了各菌屬之間的潛在競爭。

定植于煙葉葉際的微生物通常都具有一定的生物功能［31-33］，前人研究發(fā)現(xiàn)，煙葉霉?fàn)€病發(fā)生期葉際真菌主要為植物病原類［27］；亞隔孢殼屬葉斑病發(fā)生期葉際真菌主要為植物病原菌和植物病原菌-未定義的腐生菌類群，葉際細(xì)菌代謝通路功能主要為代謝、遺傳信息處理和環(huán)境信息處理類群［26］，本研究發(fā)現(xiàn)煙草靶斑病煙葉真菌群落在施藥前后優(yōu)勢菌群均分布于植物病原類，代森錳鋅施用后可顯著降低該功能類群的豐度，隨著施藥時間的增加，其豐度降低；相較而言，健康煙葉施藥前的葉際優(yōu)勢真菌主要分布于未定義類群，代森錳鋅施藥降低了其相對豐度，同時也降低了葉際植物病原類的豐度，隨著施藥時間的增加，其相對豐度在施藥1、3 d時增加，隨后降低，可能是由于一開始其他功能類群對該藥劑較敏感，抑制了其他功能類群生長，從而病原菌獲得了更多資源。也有可能是感病煙葉葉際病原菌已經(jīng)降落到健康煙葉上，藥劑無法短時間將其消除。葉際細(xì)菌群落在施藥前后優(yōu)勢菌群均分布于代謝類，代森錳鋅施用后可降低該功能群的豐度，隨著施藥時間的增加，其豐度降低，但遺傳信息處理類及環(huán)境信息處理類的相對豐度增加。綜上，推測代森錳鋅能有效影響煙葉葉際真菌與細(xì)菌功能的持效期均在9 d左右。因此，建議使用代森錳鋅防控?zé)煵莅邪卟r，其間隔期宜<9 d。

參考文獻(xiàn)：

［1］吳元華，王左斌，劉志恒，等. 我國煙草新病害——靶斑病［J］. 中國煙草學(xué)報，2006，12（6）：22.

［2］吳元華，趙艷琴，趙秀香，等. 煙草靶斑病原鑒定及生物學(xué)特性研究［J］. 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2012，43（5）：521-527.

［3］伏 穎，吳元華，穆凌霄，等. 煙草靶斑病室內(nèi)藥劑篩選［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（3）：153-155.

［4］王左斌，吳元華，趙秀香，等. “嘧肽菌凈” 對煙草靶斑病的抑茵作用及田間藥效試驗(yàn)［J］. 煙草科技，2007，40（9）：61-64.

［5］Graham S L，Hansen W H，Davis K J，et al. Effects of one-year administration of ethylenethiourea upon the thyroid of the rat［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry，1973，21（3）：324-329.

［6］Lindow S E，Brandl M T. Microbiology of the phyllosphere［J］. Applied and Environmental Microbiology，2003，69（4）：1875-1883.

［7］Huang Z D，Wang P，Pu Z X，et al. Effects of mancozeb on citrus rhizosphere bacterial community［J］. Microbial Pathogenesis，2021，154：104845.

［8］Vorholt J A.Microbial life in the phyllosphere［J］. Nature Reviews Microbiology，2012，10（12）：828-840.

［9］Leveau J，Lindow S E. Appetite of an epiphyte：quantitative monitoring of bacterial sugar consumption in the phyllosphere［J］. PNAS，2001，98（6）：3446-3453.

［10］Pati B R，Sengupta S，Chandra A K.Role of nitrogen fixing bacteria on the phyllosphere of wheat seedlings［J］. Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica，1995，42（4）：427-433.

［11］Nair J R，Singh G，Sekar V.Isolation and characterization of a novel Bacillus strain from coffee phyllosphere showing antifungal activity［J］. Journal of Applied Microbiology，2002，93（5）：772-780.

［12］Krechel A，F(xiàn)aupel A，Hallmann J，et al. Potato-associated bacteria and their antagonistic potential towards plant-pathogenic fungi and the plant-parasitic nematode Meloidogyne incognita （Kofoid & White） Chitwood［J］. Canadian Journal of Microbiology，2002，48（9）：772-786.

［13］Azevedo J，Maccheroni W，Pereira J，et al. Endophytic microorganisms：a review on insect control and recent advances on tropical plants［J］. Electronic Journal of Biotechnology，2000，3（1）：15-16.[HJ2mm]

［14］Sandhu A，Halverson L J，Beattie G A. Bacterial degradation of airborne phenol in the phyllosphere［J］. Environmental Microbiology，2007，9（2）：383-392.

［15］Sapkota R，Knorr K，Jrgensen L N，et al. Host genotype is an important determinant of the cereal phyllosphere mycobiome［J］. New Phytologist，2015，207（4）：1134-1144.

［16］Zhang Y G，Cong J，Lu H，et al. Soil bacterial diversity patterns and drivers along an elevational gradient on Shennongjia Mountain，China［J］. Microbial Biotechnology，2015，8（4）：739-746.

［17］Copeland J K，Yuan L J，Layeghifard M，et al. Seasonal community succession of the phyllosphere microbiome［J］. Molecular Plant-Microbe Interactions，2015，28（3）：274-285.

［18］黃 宇，汪漢成，陳乾麗，等. 感染白粉病煙株典型病級葉際真菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性分析［J］. 煙草科技，2021，54（4）：8-14.

［19］劉 暢，汪漢成，謝紅煉，等. 感染赤星病煙草葉際細(xì)菌的多樣性分析［J］. 煙草科技，2020，53（2）：8-14.

［20］劉 暢，汪漢成，謝紅煉，等. 感赤星病煙葉的真菌群落結(jié)構(gòu)分析［J］. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（7）：54-59.

［21］譚舒心. 蜘蛛蘭褐斑病及其病原菌鑒定與病害的藥劑控制試驗(yàn)［D］. 重慶：西南大學(xué)，2009.

［22］周建全，張忠光，董 雪，等. 不同藥劑對煙草靶斑病的抑菌作用及田間藥效研究［J］. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（25）：96-97，99.

［23］Mboowa G，Sserwadda I，Amujal M，et al. Human genomic loci important in common infectious diseases：role of high-throughput sequencing and genome-wide association studies［J］. Canadian Journal of Infectious Diseases and Medical Microbiology，2018，2018（6010）：1-9.

［24］謝紅煉，汪漢成，蔡劉體，等. 煙草種子內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性［J］. 微生物學(xué)報，2020，60（3）：601-616.

［25］Stone B W G，Weingarten E A，Jackson C R.The role of the phyllosphere microbiome in plant health and function［J］. Annual Plant Reviews Online，2018，1（2）：533-556.

［26］Huang Y，Wang H C，Cai L T，et al. Phyllospheric microbial composition and diversity of the tobacco leaves infected by Didymella segeticola［J］. Frontiers in Microbiology，2021，12：699699.

［27］陳乾麗，李 忠，汪漢成，等. 烤后不同霉變程度煙葉際真菌群落組成與多樣性分析［J］. 微生物學(xué)報，2019，59（12）：2401-2409.

［28］Sun M L，Shi C H，Wang H C，et al. Effect of disease severity on the structure and diversity of the phyllosphere microbial community in tobacco［J］. Frontiers in Microbiology，2023，13：1081576.

［29］Chen Q L，Cai L，Wang H C，et al. Fungal composition and diversity of the tobacco leaf phyllosphere during curing of leaves［J］. Frontiers in Microbiology，2020，11：554051.

［30］Leopold D R，Busby P E. Host genotype and colonist arrival order jointly govern plant microbiome composition and function［J］. Current Biology，2020，30（16）：3260-3266.

［31］梁宗琦，韓燕峰，梁建東，等. 從細(xì)胞內(nèi)共生到多尺度共生：回顧與展望［J］. 菌物學(xué)報，2020，39（12）：2202-2217.

［32］Liang Z Q，Han Y F，Liang J D，et al. From intracellular symbiosis to multiscale symbiosis：review and prospect［J］. Mycosystema，2020，39（12）：2202-2217.

［33］Scharnagl K. The scale of symbiosis［J］. Symbiosis，2019，78（1）：7-17.

收稿日期：2022-11-11

項(xiàng)目基金：國家自然科學(xué)基金（編號：31960550、32160522）；貴州省科技基金項(xiàng)目（編號：黔科合基礎(chǔ)-ZK［2021］重點(diǎn)036）；中國煙草總公司科技項(xiàng)目［編號：110202001035（LS-04）、110202101048（LS-08）］；貴州省“百層次”創(chuàng)新型人才項(xiàng)目（編號：黔科合平臺人才-GCC［2022］028-1）。

作者簡介：張 藝（1996—），女，貴州遵義人，碩士研究生，主要從事作物栽培學(xué)與耕作學(xué)研究。E-mail：1158852415@qq.com。

通信作者：王 豐，博士，研究員，主要從事微生物研究，E-mail：yancaowangfeng@163.com；汪漢成，研究員，主要從事煙草植保及微生態(tài)研究，E-mail：xiaobaiyang126@hotmail.com。