王銳麗,吳 燕,陳頤輝,陳 瓊

(信陽農(nóng)林學(xué)院 制藥工程學(xué)院, 河南 信陽 464000)

0 引言

漆酶(Laccase,EC1.10.3.2)是一類含銅的多酚氧化酶,廣泛存在于植物、細(xì)菌和真菌體內(nèi),白腐真菌是該酶的主要生產(chǎn)者,如毛木耳(AuriculariacorneaEhrenb)[1]、糙皮側(cè)耳(Pleurotusostreatus)[2]、血紅密孔菌(Pycnoporussanguineus)[3]、靈芝(Ganoderma)[4]、一色齒毛菌(Cerrenaunicolor)[5]等。漆酶能夠氧化酚類、苯甲酸、芳香類和多芳香族碳?xì)浠衔锏榷喾N底物,當(dāng)O2作為電子受體時,可將分子O2還原為H2O,常被作為“綠色生物催化劑”用于土壤修復(fù)[6]、生物能源[7]、染料脫色[8]、生物檢測[9]、紙漿廢棄物處理[10]等方面。因此,篩選高產(chǎn)漆酶的菌株并優(yōu)化發(fā)酵條件來提高酶產(chǎn)量或活性具有重要的現(xiàn)實意義。田嘉慧等[11]以玉米秸稈為底物,液態(tài)發(fā)酵,篩選出一株高產(chǎn)漆酶一色齒毛菌CerrenaunicolorGC.u01。LIU等[12]優(yōu)化了云芝產(chǎn)漆酶的條件。郭良昊等[13]優(yōu)化了Trametessp. LS-10C了發(fā)酵條件,提高了漆酶活力。

相比于液態(tài)發(fā)酵,真菌在固態(tài)基質(zhì)上的生長更接近于其自然狀態(tài),選用廉價、易得的工農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物、廢棄物和天然基質(zhì)作為培養(yǎng)基進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)漆酶已成為研究熱點。YULIANA等[14]采用玉米芯和稻草作為基質(zhì)培養(yǎng)靈芝產(chǎn)漆酶,提高酶活力。熊雪等[15]采用麥麩誘導(dǎo)香菇慶科R20分泌漆酶,提高了漆酶活力。近年來,伴隨我國中藥產(chǎn)業(yè)的迅猛發(fā)展,中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程中不可避免地產(chǎn)生了數(shù)千萬噸的中藥渣,中藥渣富含纖維素、木質(zhì)素類、蛋白類、礦物質(zhì)以及一些微量元素等營養(yǎng),將中藥渣資源循環(huán)利用變“廢”為“寶”,創(chuàng)造新的附加值是非常有必要的。目前研究主要集中在將中藥渣應(yīng)用于禽畜飼料生產(chǎn)、藥用活性成分提取、燃料生產(chǎn)、育苗等方面[16-17],相比之下,應(yīng)用于栽培食藥用真菌以實現(xiàn)轉(zhuǎn)化利用的相關(guān)研究還較為欠缺。

本研究以前期篩選到的真菌菌株SW2為研究對象,將中藥渣作為該菌固態(tài)發(fā)酵的主要基質(zhì)之一,優(yōu)化培養(yǎng)條件提高漆酶酶活,探究所產(chǎn)漆酶對偶氮染料的脫色能力,為實現(xiàn)中藥渣資源的綜合利用和漆酶在染料脫色中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株與材料

菌株SW2由本實驗室前期分離純化,擴(kuò)增ITS序列經(jīng)測序、比對,鑒定為無柄靈芝Ganodermaresinaceum,其GenBank登錄號為MH855781.1,該菌株保存于信陽市藥用菌工程技術(shù)研究中心。

中藥渣為河南羚銳制藥股份有限公司生產(chǎn)“解毒散結(jié)膠囊”產(chǎn)生的部分藥渣,主要成分為黃芩(ScutellariaeRadix)、丹參(SalviaemiltiorrhizaeRadix et Rhizoma)、連翹(ForsythiaeFructus)、茵陳(ArtemisiacapillarisThunb.)、虎杖(PolygonicuspidatiRhizoma et Radix)、陳皮(CitrireticulataePericarpium)等,濕物經(jīng)干燥直至恒重,粉碎備用。

2,2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(2,2’-Azinobis(3-ethylbenzothiazoline -6-sulfonic Acid) Ammonium Salt,ABTS)(純度≥98%)、愈創(chuàng)木酚(純度≥98%)、亞甲基藍(lán)(純度≥90%)、酸性橙7(純度>85%)、氨基黑10B(純度≥98%)均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器

Nanodrop one超微量紫外分光光度計,賽默飛世爾科技(中國)有限公司;XFH-75CA型電熱式高壓滅菌鍋,浙江新豐醫(yī)療器械有限公司;Milli-Q Advantage A10超純水系統(tǒng),蘇州賽恩斯儀器有限公司;Avanti JXN-26型高效離心機(jī),貝克曼庫爾特商貿(mào)(中國)有限公司;GHA-300Y型全溫?fù)u床,杭州綠博儀器有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,瓊脂15 g,溶于1000 mL蒸餾水,pH自然。

種子液培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,蛋白胨5 g ,MgSO4·7H2O 1 g ,KH2PO42 g ,VB150 mg ,溶于1000 mL蒸餾水,pH自然。

固態(tài)發(fā)酵初始培養(yǎng)基:粒徑為0.4 mm中藥渣15 g,麥麩15 g,蒸餾水 45 mL,pH自然。

以上培養(yǎng)基于高壓滅菌鍋內(nèi)121 ℃,滅菌30 min,備用。

1.4 實驗方法

1.4.1 愈創(chuàng)木酚平板顯色試驗

采用愈創(chuàng)木酚平板顯色法[4]初步驗證菌株的產(chǎn)漆酶能力。將經(jīng)活化處理過的SW2(直徑大約5 mm)菌塊轉(zhuǎn)接到含體積分?jǐn)?shù)0.05%愈創(chuàng)木酚的PDA培養(yǎng)基(G-PDA)中央,平板置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中,1 d后倒置培養(yǎng),將置于PDA培養(yǎng)基上菌株作為對照組,觀察菌落周邊的顯色圈狀況。

1.4.2 粗酶液的制備

將活化菌塊(大約5 mm3)轉(zhuǎn)接到種子液培養(yǎng)基中,25 ℃、150 r/min培養(yǎng)5 d后,待液體培養(yǎng)基中有大量菌絲球出現(xiàn),加入無菌玻璃球振蕩1 d,將菌絲球充分打碎,制成均勻的種子液,再將種子液以10%的接種量轉(zhuǎn)入到中藥渣固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中,25 ℃培養(yǎng)14 d。待固態(tài)發(fā)酵結(jié)束后,取5 g固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)物將其剪碎,加入50 mL 0.2 mol/L的乙酸鈉-乙酸緩沖液(pH3.8),置于25 ℃、120 r/min搖床上浸提4 h。再用4層紗布過濾,于10 000 r/min條件下離心15 min,所得上清液即為漆酶粗酶液。

1.4.3 漆酶活性的測定

3 mL反應(yīng)體系中加入1 mmol/L ABTS 0.5 mL、0.2 mol/L的乙酸鈉-乙酸緩沖液(pH3.8)2.4 mL 和100 μL適當(dāng)稀釋的酶液,混合均勻,置于28 ℃水浴鍋中反應(yīng)5 min后,冰浴終止反應(yīng),測定在420 nm (ε420=3.6×104L/(mol · cm))處的吸光度。用100 μL去離子水代替反應(yīng)體系中的酶液作為對照組。一定的反應(yīng)條件下,1 min內(nèi)氧化1 μmol的ABTS所需要的酶量定義為1個酶活力單位(U)。

1.4.4 發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.4.4.1 單因素試驗

在固態(tài)發(fā)酵初始培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,以漆酶酶活為指標(biāo),進(jìn)行單因素試驗,分別考察原料比(7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7)、中藥渣粒徑(0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mm)、初始含水質(zhì)量分?jǐn)?shù)(50%、55%、60%、65%、70%、75%)、初始pH值(4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5)、接種量質(zhì)量分?jǐn)?shù)(4%、6%、8%、10%、12%、14%)、碳源種類(葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、淀粉、糊精)及質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%)、氮源種類(蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、硫酸銨、硝酸鈉、尿素)及質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%)、金屬離子種類(CuSO4、MgSO4、CaSO4、MnSO4、FeSO4、ZnSO4)及濃度(1、2、3、4、5、6 mmol/L)對靈芝固態(tài)發(fā)酵中藥渣產(chǎn)漆酶的影響。

1.4.4.2 PB試驗分析

選用N=12的Plackett-Burman(PB)試驗設(shè)計考察原料比、中藥渣粒徑、初始含水質(zhì)量分?jǐn)?shù)、初始pH值、接種量、蔗糖濃度、酵母粉濃度、Mg2+濃度等8個因素對漆酶酶活力的影響,PB試驗設(shè)計的因素和水平如表1,設(shè)3個虛擬項,篩選出對漆酶活性影響顯著的主要因素。

表1 PB試驗因素與水平設(shè)計Tab. 1 Factors and levels for PB design

1.4.4.3 正交試驗優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗和PB試驗結(jié)果,選擇發(fā)酵培養(yǎng)基中對漆酶酶活力影響最大的原料比、初始含水質(zhì)量分?jǐn)?shù)、接種量、酵母粉濃度等4個主要因素,設(shè)計正交試驗因素與水平如表2。

表2 正交試驗因素及水平Tab. 2 Factors and levels of orthogonal experiments

1.4.5 漆酶對偶氮染料的脫色

脫色反應(yīng)體系總體積為5 mL,包括0.2 mol/L乙酸鈉-乙酸緩沖液(pH4.0)4 mL ,200 mg/L經(jīng)膜過濾偶氮染料(亞甲基藍(lán)、酸性橙7、氨基黑10B)0.4 mL ,漆酶酶液(終濃度2 U/mL)0.5 mL和介體0.5 mmol/L ABTS 0.1 mL,于35 ℃條件下振蕩反應(yīng),定時取樣分別于染料最大吸收峰處(664、484、620 nm)測定吸光值。以添加等量滅活酶液的脫色體系作為對照組。按公式(1)計算染料脫色率。

(1)

式中:Ae為反應(yīng)體系脫色后于染料最大吸收波長處的吸光值,Ac為對照組的吸光值。

1.4.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

單因素試驗方差分析及圖表制作使用 IBM SPSS Statistics 26軟件和Origin 22軟件,采用Duncan法檢驗差異顯著性,使用Design Expert 10軟件對PB試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株產(chǎn)漆酶能力的鑒定

由圖1可知,相比在PDA平板上的生長情況,菌株在含0.05%愈創(chuàng)木酚的PDA(G-PDA)平板上生長稍慢,這可能是由愈創(chuàng)木酚的抑菌作用所致[20]。愈創(chuàng)木酚作為特征底物發(fā)生了氧化反應(yīng),菌落周邊及底部形成了明顯的棕紅色顯色圈,顯色圈的直徑大于菌絲延伸生長的范圍,說明該菌株具有產(chǎn)漆酶能力。

圖1 菌株在PDA(左)和G-PDA(右)平板上的生長情況Fig. 1 Growth performance of the strain on the PDA (left) and G-PDA (right) medium

2.2 單因素試驗

2.2.1 原料比、中藥渣粒徑和初始含水質(zhì)量分?jǐn)?shù)對靈芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)漆酶的影響

隨著中藥渣占比逐漸降低,漆酶酶活變化趨勢如圖2a)所示,當(dāng)原料比為6∶4時,酶活達(dá)到(16.83±0.34) U/g。選用不同粒徑的中藥渣,其可作用表面積不同,同時原料之間的透氣性也不同,決定著菌株在發(fā)酵過程有效利用原料的程度不同,進(jìn)而直接影響著菌株的產(chǎn)漆酶能力。如圖2b)所示,中藥渣粒徑為0.4 mm時,漆酶酶活最高,為(12.56±0.77) U/g。適宜的水分含量有利于營養(yǎng)物質(zhì)的溶解,有助于透氣和散熱,對菌體生長和代謝都是至關(guān)重要的,由圖2c)可知,隨著初始含水質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,漆酶酶活呈先增大后減小的趨勢,當(dāng)含水質(zhì)量分?jǐn)?shù)為65%時,漆酶酶活達(dá)到最大值(16.37±0.54) U/g。

注：不同小寫字母表示菌體生物量顯著性差異(P<0.05);不同大寫字母表示黃酮產(chǎn)量顯著性差異(P<0.05),下同。

2.2.2 初始pH和接種量對靈芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)漆酶的影響

初始pH值對發(fā)酵產(chǎn)漆酶的影響如圖3a)所示,pH值在4.0～6.5之間時,漆酶酶活為10.48～14.56 U/g。在偏酸性的環(huán)境下,pH對漆酶酶活的影響,差異性不是很顯著。當(dāng)初始pH值為5.5時,漆酶酶活為(14.56±0.22) U/g。適宜的接種量可縮短菌群生長的遲緩期進(jìn)而縮短發(fā)酵周期,提升菌體發(fā)酵能力,如圖3b)所示,在接種量在4%～12%區(qū)間時,漆酶酶活逐漸增大,且變化趨勢很明顯。當(dāng)接種量為12%時,漆酶酶活達(dá)到(15.13±0.43) U/g,為最大值。繼續(xù)增大接種量,漆酶酶活反而受到負(fù)影響,可能是因為在有限的營養(yǎng)物環(huán)境中,隨著接種量的增大,菌株未能達(dá)到穩(wěn)定期而提前衰亡。

圖3 初始pH a)和接種量 b)對漆酶酶活的影響Fig. 3 Effects of initial pH a) and inoculation quantity b) on laccase activity

2.2.3 碳、氮源種類及添加濃度對靈芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)漆酶的影響

基質(zhì)中藥渣和麥麩能提供部分碳氮源,在此基礎(chǔ)上,篩選添加其他的碳源和氮源,考察其對菌株產(chǎn)漆酶的影響。如圖4a)所示,在初始培養(yǎng)基中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的不同碳源,所得漆酶酶活有著明顯的差異。當(dāng)蔗糖作為碳源時,對產(chǎn)酶能力的影響明顯高于其他5種碳源,漆酶酶活可達(dá)(18.56±0.22) U/g。隨著蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大,漆酶酶活呈先增大后降低的變化趨勢。賈晨波等[18]在對端梗霉Z45產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化時,確定了基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中蔗糖為最佳碳源。由圖4b)可知,當(dāng)蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%時,漆酶酶活達(dá)到最大,為(21.39±0.48) U/g。在初始培養(yǎng)基中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的不同氮源,對漆酶酶活的影響如圖4c)所示,相比于無機(jī)鹽作為氮源,蛋白胨、牛肉膏、酵母粉這類有機(jī)氮更利于漆酶的積累,說明靈芝對成分豐富的天然有機(jī)營養(yǎng)物質(zhì)的利用率明顯高于其他,其中酵母粉的促進(jìn)作用最佳,故選擇酵母粉作為高產(chǎn)漆酶發(fā)酵培養(yǎng)基中的最佳碳源,與尚潔等[19]對一色齒毛菌產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基的氮源篩選結(jié)果一致。由圖4d)可知,當(dāng)酵母粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%時,漆酶酶活達(dá)到最大,為(25.72±0.23) U/g。

圖4 碳源種類 a)及質(zhì)量分?jǐn)?shù) b)、氮源種類 c)及質(zhì)量分?jǐn)?shù) d)對漆酶酶活的影響Fig. 4 Effects of carbon source type a) and concentration b), nitrogen source type c) and concentration d) on laccase activity

2.2.4 金屬離子對靈芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)漆酶的影響

將不同的1 mmol/L金屬鹽添加到初始培養(yǎng)基中,考察其對靈芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)漆酶的影響。如圖5a)所示,Cu2+和Mg2+的添加明顯促進(jìn)漆酶的產(chǎn)生,相對于未添加金屬離子,漆酶酶活分別提高了23.64%和34.51%。漆酶是一類含銅的多酚氧化酶,大部分研究表明,培養(yǎng)基中適宜濃度的Cu2+是產(chǎn)漆酶良好的誘導(dǎo)劑,ZHOU等[20]通過Cu2+的添加能使P.ostreatusHAUCC 162胞外漆酶活性有所增加。Mg2+的促進(jìn)作用也存在于刺芹側(cè)耳發(fā)酵產(chǎn)漆酶過程中[21]。由圖5b)可知,當(dāng)Mg2+添加濃度為3 mmol/L時,漆酶酶活達(dá)到(17.69±0.12)U/g。而Fe2+的添加對產(chǎn)酶能力有抑制作用,對漆酶酶活的抑制率為25.45%,這與沈柯宇等[22]在考察重金屬對靈芝漆酶活性的研究結(jié)果相似。Ca2+、Mn2+和Zn2+對漆酶酶活的影響不明顯。

圖5 金屬離子種類 a)和濃度 b)對漆酶酶活的影響Fig. 5 Effects of metal ion type a) and concentration b) on laccase activity

2.3 PB試驗結(jié)果

表3 PB試驗設(shè)計及試驗結(jié)果Tab. 3 Design of PB test and corresponding results

表4 PB試驗顯著因子分析Tab. 4 Analysis of significance of PB test

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中的原料比(X1)、初始含水質(zhì)量分?jǐn)?shù)(X3)、酵母粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)(X7)及接種量質(zhì)量分?jǐn)?shù)(X5)對靈芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)漆酶的影響極顯著(P<0.01),故把X1、X3、X5、X7等4個因素視為影響漆酶酶活的主要因素,進(jìn)行正交試驗優(yōu)化。其余因素影響不顯著,取單因素試驗確定的最佳水平用于后續(xù)試驗。

2.4 正交試驗優(yōu)化結(jié)果

靈芝利用初始培養(yǎng)基固態(tài)發(fā)酵所得漆酶酶活為(15.49±0.73) U/g,采用L9(34)設(shè)計正交試驗,由表5可知,菌株產(chǎn)漆酶培養(yǎng)條件的最優(yōu)組合為A2B1C2D3,即原料比(中藥渣與麥麩比例)為6∶4,初始含水量質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%,接種量質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%,酵母粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%。在最優(yōu)產(chǎn)漆酶條件進(jìn)行3次平行驗證試驗,得到漆酶酶活為(56.13±1.20)U/g,是優(yōu)化前的3.62倍,說明該組合條件適用于促進(jìn)菌株高產(chǎn)漆酶。結(jié)合PB試驗顯著因子分析(表4)和正交試驗極差分析(表5)的結(jié)果比較可知RD>RB>RC>RA,即酵母粉添加濃度對產(chǎn)漆酶能力的影響最大,其次是初始含水量和接種量,原料比的影響較小。

表5 正交試驗結(jié)果與極差分析Tab. 5 Results of orthogonal experiment and range analysis

2.5 漆酶對染料的脫色作用

由圖6可知,漆酶對3種偶氮染料的脫色率隨時間的延長呈先增大而后逐漸平穩(wěn)的趨勢。對亞甲基藍(lán)、酸性橙7和氨基黑10B的最大脫色率分別為 46.7%、84.6%和61.1%。對不同染料的脫色速度不同,亞甲基藍(lán)在6 h即脫色完成,而酸性橙7和氨基黑10B達(dá)到最大脫色率需要9 h。

圖6 脫色率隨時間變化趨勢Fig. 6 Change of decolorization rate of dyes with time

3 結(jié)束語

用中藥渣和麥麩作為無柄靈芝固態(tài)發(fā)酵基質(zhì),經(jīng)發(fā)酵條件的優(yōu)化處理發(fā)酵14 d后,漆酶酶活為(56.13±1.20) U/g,表明該菌能利用中藥渣這類廢棄物實現(xiàn)資源的再利用和轉(zhuǎn)化,但對其的利用率還有待進(jìn)一步研究。此外,該菌所產(chǎn)漆酶在有介體ABTS存在時,對偶氮染料亞甲基藍(lán)、酸性橙7和氨基黑10B均有脫色能力,為實現(xiàn)漆酶在染料脫色上的應(yīng)用提供實驗依據(jù)。本研究在脫色體系中添加的為未經(jīng)純化處理的粗酶液,對染料的脫色率相對較低。為進(jìn)一步開發(fā)利用該菌漆酶,下一步將以漆酶的分離純化、漆酶的固定化以及漆酶的異源高效表達(dá)等作為研究方向。由于工業(yè)生產(chǎn)排出的染料廢水成分復(fù)雜,欲將該酶用于實際生產(chǎn)還需要更多的研究。