朱 濤,李蕾蕾,郭劉艷,2,葉延欣,李濤濤,陳艷艷*

(1． 河南城建學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院, 河南 平頂山 467000;2. 洛陽市新安縣南李村鎮(zhèn)人民政府, 河南 新安 471800)

0 引言

石斛(Dendrobiumnobilelindl.,DNL)為蘭科石斛屬多年生附生草本植物,是蘭科和被子植物中最大的種類之一[1]。迄今為止,中國已經(jīng)記載的石斛屬植物有81種、變種2種、特有種18種。石斛屬植物是植物界中注重觀賞價值和藥用價值的一種典型代表植物,被稱作“四大觀賞洋蘭”,還具有多重藥用價值[2]。

石斛的藥用價值極為廣泛,其入藥始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,被列為上品[3],具有抗癌、防老、潤肺、明目、養(yǎng)陰生津等多重功效,可用于治療熱病傷津、口干煩渴、病后虛熱、舌光少苔、食少干嘔、目暗不明等癥[4]。石斛新鮮或干燥的莖是其主要藥用部分,更是復(fù)方中藥的重要組成成分。民間將其稱作“救命仙草”,此外還因其稀少瀕危、價值昂貴,也被稱為“植物軟黃金”[5]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對其主要化學(xué)成分研究發(fā)現(xiàn),該屬植物富含多糖、生物堿、菲類、酚類、香豆素、維生素、氨基酸、揮發(fā)油等成分,且具有較好的藥理學(xué)活性[6],尤其是富含豐富的石斛總堿(Dendrobiumnobilelindl. alkaloid,DNLA)[7]。研究表明,DNLA具有較好的抗氧化、抗炎、保肝、抗神經(jīng)變性等作用。最新報道發(fā)現(xiàn)DNLA具有較強的抗自由基損傷作用,對離體缺血、缺氧細胞具有降低凋亡基因表達的功能[8-9]。

近年來,受價格高和工業(yè)人工種植鏈滯后的影響,野生石斛遭到過度采摘和挖掘,使得野生石斛資源受到嚴重破壞。如今石斛已被列入中國《國家一級保護植物名錄》《瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約》附錄Ⅱ及《世界自然保護聯(lián)盟瀕危物種紅色名錄》,保護級別為易危。因此,迫切需要對該屬植物資源進行保護。然而,目前研究主要集中在保護、應(yīng)用和培育方面,如薛凱等[10]對石斛屬植物進行了介紹;饒毅等[11]對近年來石斛的藥用價值及鑒別方法進行了總結(jié);BHOWMIK等[12]通過體外發(fā)育的假鱗莖培養(yǎng)對商業(yè)上重要的蘭科石斛屬植物進行微繁殖;NIU等[13]發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中增加水楊酸可以增加石斛幼苗中生物堿、多糖和類黃酮等生物活性成分的積累;CHEN等[14]通過轉(zhuǎn)錄組分析檢測到41個可能參與自交不親和的基因,為石斛遺傳機制的研究提供了基礎(chǔ);DESWINIYANTI等[15]對野生蘭科石斛的離體繁殖進行了研究,為石斛屬的培育提供了科學(xué)依據(jù)。但是,石斛屬植物種類眾多,傳統(tǒng)的石斛鑒定方法多為形態(tài)學(xué)鑒定及顯微鑒定,具有一定的主觀性,給比較形態(tài)學(xué)的分類鑒定帶來了一定的困難[16]。因此,對石斛屬植物的研究逐漸傾向分子學(xué)方面。謝析穎等[17]對霍山石斛轉(zhuǎn)錄因子MYB1R1偏好性的研究表明,MYB1R1密碼子的使用方式存在明顯的偏好性,編碼方式偏好以堿基A/U結(jié)尾,偏好性程度較低,但顯示它的密碼子使用方式更偏向于雙子葉植物類群。PERWITASARI等[18]利用rbcL和ITS基因?qū)λ幱锰m科石斛屬變色石斛DNA條形碼研究;而在袁左清等[19]的研究中曾嘗試對10個石斛品種的植物rbcL基因進行測序并分析,為石斛屬植物的系統(tǒng)發(fā)育研究提供分子研究方向的證據(jù)。但由于樣本的局限性和單基因信息的有限性,僅闡明了部分石斛之間的親緣關(guān)系,大部分石斛之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系仍不清晰。

本研究擬對已報道全葉綠體組的43種石斛之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系及其葉綠體組的差異進行研究,以期為石斛屬植物資源的開發(fā)利用、物種鑒定及保護提供分子學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

從美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center of Biotechnology Information,NCBI)數(shù)據(jù)庫中下載已經(jīng)發(fā)布的石斛葉綠體基因序列,共43種,其對應(yīng)物種名稱,序列號詳細信息如表1。

表1 43種石斛信息和葉綠體基因序的登錄號Fig. 1 Forty-three dendrobium species information and GenBank accession numbers for species chloroplast gene sequence

1.2 數(shù)據(jù)分析

首先,利用BioEdit軟件將從GeneBank中下載的43種石斛全葉綠體序列進行比對及人工校正,將比對好的序列存為fasta格式文件;其次,使用MEGA6.0[20]軟件計算序列堿基組成含量、變異位點以及遺傳距離;最后,分別采用最大似然法(Maximum Likelihood, ML)和貝葉斯法(Bayesian inference, BI)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

使用Mrbayes v3.1.2[21]構(gòu)建貝葉斯樹,使用jModelTest 2.0.1[22]軟件計算最適核苷酸的替換模型,得到最適模型為TPM3uf+I+G。貝葉斯分析以隨機種子作為起始樹進行搜索,在默認值(heating values)條件下,4條馬爾可夫鏈(Markov chains)同時運行2×107代,每100代對系統(tǒng)樹進行一次抽樣,且默認每隔1000代計算一次分裂頻率平均標準差(Average standard deviation of split frequencies)。當分裂頻率平均標準差≤0.01時,說明2個獨立運行的馬爾可夫鏈收斂到同一穩(wěn)態(tài)分布上,結(jié)果趨于一致,可終止運算。由于運算初期所得系統(tǒng)發(fā)育樹不可靠,需要檢驗似然值是否趨于穩(wěn)定來確定將被舍棄的樹的數(shù)量(Burnin值),計算方式一般為(循環(huán)代數(shù)/抽樣頻率)×1/4,之后對參數(shù)進行總結(jié)。通過分析每枝的后驗概率(Posterior probabilities)來確定分枝的可靠性,通常情況下,認為后驗概率≥0.95,表明該分枝得到較可靠的數(shù)據(jù)支持。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠體基因組特征及堿基組成

植物葉綠體基因組通過母系遺傳給后代,結(jié)構(gòu)簡單,分子量小,序列保守,使得其被廣泛用于物種鑒定、系統(tǒng)進化及分子進化研究中[23]。在本次研究所使用的石斛屬葉綠體中,葉綠體基因的大小多數(shù)在150 kb左右,包含編碼基因、tRNA和rRNA,不同石斛所包含的數(shù)量不等。利用MEGA6.0軟件對43種石斛的葉綠體基因序列進行堿基含量的分析,結(jié)果顯示T、C、A、G堿基平均含量分別是31.8%、19.0%、30.7%、18.5%。嘧啶的平均含量略高于嘌呤含量,這表明葉綠體基因在堿基組成上具有偏向性。各種石斛的T、C、A、G堿基含量都處于平均含量,有輕微上下波動,符合葉綠體堿基組成的一般特征。堿基轉(zhuǎn)換/顛換(Ti/Tv)的比值平均約為0.74,轉(zhuǎn)換數(shù)低于顛換數(shù),如表2所示。

表2 葉綠體基因序列堿基轉(zhuǎn)換顛換情況Fig. 2 The transversion/transition ratio of chloroplast gene sequence

2.2 變異位點及遺傳距離分析

選取的43種石斛的葉綠體基因組序列中共檢測到變異位點10 618個。鐵皮石斛、黃石斛、始興石斛和鐵皮石斛中科院Ⅳ號等4種植物的遺傳距離最小,為0,說明這4種可能為同一母本起源;廣東石斛和梵凈山石斛遺傳距離為0.001,霍山石斛和梵凈山石斛遺傳距離為0.001,霍山石斛和廣東石斛遺傳距離為0.001,由此可見,這3對石斛親緣關(guān)系比較近。梳唇石斛和少花石斛的遺傳距離為0.019,梳唇石斛和針葉石斛的遺傳距離也為0.019,說明梳唇石斛與這兩個物種具有較遠親緣關(guān)系。竹枝石斛和梳唇石斛的遺傳距離最大,為0.021,說明這二者具有較遠的親緣關(guān)系。從表2中也可以看出,劍葉石斛與其他石斛的遺傳距離為0.010～0.012。景洪石斛與其他石斛的遺傳距離范圍是0.011～0.013,較遠。花石斛與其他石斛的遺傳距離大多為0.010～0.013,距離較遠,除了其與劍葉石斛的遺傳距離為0.006。梳唇石斛與其他石斛的遺傳距離在0.014～0.019之間。針葉石斛與其他石斛的遺傳距離在0.011～0.019之間。竹枝石斛與其他石斛的遺傳距離在0.013～0.021之間,最大遺傳距離就是竹枝石斛與梳唇石斛的遺傳距離。這6種石斛與其他石斛的遺傳距離相對來說比較遠。所選取的石斛屬植物其他種類的遺傳距離,均在0～0.021這個范圍內(nèi)。

2.3 43種石斛的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析

基于43種石斛所構(gòu)建的BI樹和ML樹拓撲結(jié)構(gòu)一致結(jié)果均顯示石斛屬是一個單系群(兩種樹整合一起呈現(xiàn)),且大多數(shù)分支的自展值大于80,說明分析可信度很高。如圖1所示,在本研究所涉及的43種石斛中,梳唇石斛最先分化出來,位于系統(tǒng)發(fā)育樹的基部,其次是竹枝石斛;而鐵皮石斛和中科院Ⅳ號鐵皮石斛聚為一支且支持率為100%,分化出來的最晚,在系統(tǒng)發(fā)育樹的頂部,親緣關(guān)系比較近。

圖1 利用最大似然法和貝葉斯法對43種石斛構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 1 The Maximum Likelihood (ML) and Bayesian inference (BI) tree constructed based on complete chloroplast gene sequence of 43 Dendrobium species

在本研究中梵凈山石斛和西疇石斛位于同一小支,且具有較高自展值,為100;霍山石斛和細莖石斛為一支,自展值為100;大苞鞘石斛和腫節(jié)石斛為一支,自展值為100,可信度較高;兜唇石斛和美花石斛為一支,自展值為100;報春石斛和紫瓣石斛為一支,自展值較高為100;羅河石斛、疏花石斛為一支,自展值為100;玫瑰石斛與束花石斛為一支,自展值為100;疊鞘石斛、流蘇石斛為一支,自展值為100;反瓣石斛和高山石斛為一支,自展值為100;球花石斛、王氏石斛為一支,自展值100,具有較高可信度;劍葉石斛與少花石斛為一支,自展值為100;景洪石斛與針葉石斛為一支,自展值較高為100,可信度高。此外,在該發(fā)育樹中,始興石斛、曲莖石斛、廣西石斛、春石斛、鉤狀石斛也自成一小支;串珠石斛、杓唇扁石斛、齒瓣石斛也自成一小支;基本確定了43種石斛的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

3 討論

目前對于石斛屬部分種分類存在比較大的爭議,且鐵皮石斛與細莖石斛、霍山石斛、廣東石斛這些石斛之間沒有明確的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,本研究明確了這幾種石斛之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。在兩種發(fā)育樹中均顯示,細莖石斛、霍山石斛、廣東石斛具有較近的親緣關(guān)系,而鐵皮石斛的分化位于發(fā)育樹頂部,與另外幾種石斛親緣關(guān)系較遠。有研究認為霍山石斛與小黃花石斛親緣關(guān)系比較遠,但與大多數(shù)石斛親緣關(guān)系都近[26],與本研究的結(jié)果一致。王曉雙等[27]研究表明鼓槌石斛和竹枝石斛與其他石斛的親緣關(guān)系較遠,本研究顯示了竹枝石斛自成一支,與其他石斛親緣關(guān)系遠,支持了這一結(jié)果,但鼓槌石斛與疊鞘石斛、流蘇石斛位于一個大的分支,親緣關(guān)系較近。寧靜等[28]認為黃石斛、大苞鞘石斛、長蘇石斛、流蘇石斛、細莖石斛、串珠石斛、兜唇石斛和鼓槌石斛親緣關(guān)系比較近,而石斛屬中的鐵皮石斛則自稱一支。在此次的對比中,鐵皮石斛卻與許多種石斛都有比較親密的關(guān)系,而其他幾種石斛在此次研究中,也顯示了較遠的親緣關(guān)系。本研究基本確定了所選取的43種石斛的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,為存在分類爭議的物種提供分子學(xué)依據(jù)。

4 結(jié)束語

通過對已報道全葉綠體基因組的43種石斛屬植物進行系統(tǒng)發(fā)育分析,確定了43種石斛屬植物之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,解決了單個條形碼基因無法確定的種間關(guān)系問題。但是由于僅選取測得43種石斛的全葉綠體,后期將對更多的石斛進行研究,以期為石斛屬植物的種質(zhì)資源的開發(fā)利用、物種鑒定及保護提供分子學(xué)基礎(chǔ),并為石斛屬物種間進化機制的研究提供一定的參考依據(jù)。