楊瑾，李凱興，李培謙

（運(yùn)城學(xué)院生命科學(xué)系，山西 運(yùn)城 044000）

大豆原產(chǎn)我國，是重要的糧食作物之一，其富含油脂和蛋白質(zhì)，在國民生產(chǎn)中占有重要地位。隨著大豆進(jìn)境量的快速增長(zhǎng)，攜帶各種檢疫性病蟲草害風(fēng)險(xiǎn)不斷加大。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國進(jìn)境大豆攜帶的有害生物種類高達(dá)600 余種[1]。進(jìn)境大豆中的檢疫性病害，如大豆莖潰瘍病菌、大豆疫霉、菜豆莢斑駁病毒等檢出率逐年增高[2]。因此，了解進(jìn)境大豆病害發(fā)生及其攜帶病原情況對(duì)阻斷檢疫性病害在我國的危害和流行具有重要現(xiàn)實(shí)意義。檢疫性病害，尤其是國內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn)的病害一經(jīng)傳入，將給我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來嚴(yán)重危害[2]。大豆在貯存和運(yùn)輸過程中，不適合的溫度和濕度條件易使其產(chǎn)生霉變，而霉菌產(chǎn)生的毒素是影響大豆品質(zhì)的重要因素之一。因此，掌握進(jìn)境大豆在運(yùn)輸和貯存過程的真菌攜帶情況對(duì)保障進(jìn)境大豆質(zhì)量至關(guān)重要。

本研究采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)技術(shù)，通過形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)手段對(duì)2021 年經(jīng)南通海關(guān)進(jìn)境的美國、烏拉圭、巴西大豆種子進(jìn)行檢測(cè)鑒定，并對(duì)植物病原微生物隨大豆入境傳播的可能性進(jìn)行分析，以期為進(jìn)境大豆檢驗(yàn)檢疫工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料大豆種子：為2021 年南通海關(guān)現(xiàn)場(chǎng)檢疫采樣樣品，分別來自美國、烏拉圭和巴西。

1.1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：購自青島海博生物技術(shù)有限公司。稱取PDA 粉9.2 g 于250 mL三角瓶中，加入200 mL 超純水，115 ℃高壓滅菌15 min。

1.1.3 主要儀器材料

上海一恒電熱恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9052），上海一恒科學(xué)儀器有限公司；蘇州凈化（SW-CG-2G）超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；德國Eppendorf（5804R）離心機(jī)，上海艾研生物科技有限公司；天根基因組提取試劑盒（DP320），天根生化科技（北京）有限公司。

1.1.4 其他材料

堿基序列比對(duì)網(wǎng)站：NCBI 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子帶菌率檢測(cè)

采用分離培養(yǎng)法[3]對(duì)種子攜帶真菌情況進(jìn)行檢測(cè)。隨機(jī)選取美國、烏拉圭、巴西進(jìn)境大豆種子各100 粒，先將大豆種子在5%次氯酸鈉溶液中浸泡1 min 進(jìn)行表面消毒，再用無菌水沖洗3 次，然后均勻擺放于直徑9 cm 的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）平板上，每皿10 粒，共10 個(gè)培養(yǎng)皿。在25 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)5 d 后統(tǒng)計(jì)100 粒大豆種子帶菌情況。種子帶菌率= 帶菌種子數(shù)/檢測(cè)種子總數(shù)×100%。

1.2.2 種子表面帶菌檢測(cè)

隨機(jī)選取美國、烏拉圭和巴西進(jìn)境大豆種子各15 粒，剔除土屑和木屑，放入裝有100 mL 滅菌超純水的三角瓶中，置于超凈工作臺(tái)后用漩渦儀劇烈震蕩10 min。將震蕩后的上清液倒入滅菌離心管中，12 000 rpm/min 離心3 min。將離心后的下層液體均勻涂布在PDA 平板上，每種大豆以上步驟均3 次重復(fù)。將涂好的平板置于25 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。每天觀察大豆周圍菌落生長(zhǎng)狀況，及時(shí)挑出形態(tài)、顏色不同的菌落。將挑出的菌絲塊在新的PDA 培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)接3 代，用以純化。觀察純化后的真菌，記錄菌落特征，用顯微鏡觀察菌絲和分生孢子形態(tài)，對(duì)所有純化后的真菌對(duì)照檢索表進(jìn)行形態(tài)學(xué)[4]鑒定。純化好的菌株經(jīng)轉(zhuǎn)接后于滅菌濾紙片過夜吹干，置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.3 種皮、種內(nèi)帶菌檢測(cè)

采用組織分離法[3]，隨機(jī)選取美國、烏拉圭和巴西進(jìn)境大豆種子各15 粒，用漩渦儀劇烈震蕩10 min，處理方法同上。用鑷子將震蕩后的大豆種子取出放入5%次氯酸鈉溶液中消毒1 min，滅菌超純水沖洗3 次后，用滅菌后的鑷子將大豆表皮撕下放在PDA 培養(yǎng)基上，將撕皮后的種子同樣放置于PDA 培養(yǎng)基上，每種大豆以上步驟均3 次重復(fù)[3]。將涂好的平板置于25 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。菌株純化及形態(tài)學(xué)鑒定同1.2.2。純化好的菌株接于濾紙片干燥后置于-20 ℃冰箱保存。1.2.4 菌株分子鑒定

用滅菌手術(shù)刀輕輕刮取培養(yǎng)基上純化后的菌絲，采用天根基因組提取試劑盒（DP320）提取菌株基因組DNA。提取后的基因組DNA 置于-20 ℃冰箱保存。利用ITS 序列引物ITS4/ITS5 進(jìn)行普通PCR 反應(yīng)。反應(yīng)體系為25 μL，其中2XEasy-LoadTMPCR Master Mix 12.5 μL；ITS4/ITS5 各1 μL；基因組模板1 μL；最后用滅菌超純水補(bǔ)足體積至25 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸40 s，變性至延伸階段32 個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠1 × TAE 緩沖液中電泳，經(jīng)核酸染料染色后于紫外燈下凝膠成像。將出現(xiàn)650 bp 長(zhǎng)度的條帶樣品送至武漢金開瑞生物工程有限公司測(cè)序。將測(cè)序獲得的序列在NCBI 網(wǎng)站進(jìn)行Blast 同源性比對(duì)分析，將比對(duì)結(jié)果結(jié)合菌絲形態(tài)學(xué)觀察對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2020 進(jìn)行計(jì)算和整理。序列比對(duì)在NCBI 數(shù)據(jù)庫上進(jìn)行。

2 結(jié)果分析

2.1 種子帶菌率檢測(cè)結(jié)果分析

由表1 可知，不同國家進(jìn)境大豆種子帶菌率不同。進(jìn)境大豆種子帶菌率表現(xiàn)為美國＞巴西＞烏拉圭。其中美國進(jìn)境大豆種子帶菌率為20.7%；巴西進(jìn)境大豆種子帶菌率為18.1%；烏拉圭進(jìn)境大豆種子帶菌率為15.4%。

表1 不同國家進(jìn)境大豆種子帶菌率檢測(cè)結(jié)果

2.2 真菌分離物初步鑒定結(jié)果分析

對(duì)來自3 個(gè)國家的進(jìn)境大豆種子分別進(jìn)行種子表面、種皮和種內(nèi)攜帶真菌分離鑒定。經(jīng)3 代純化培養(yǎng)后，共得到21 個(gè)分離物。其中美國進(jìn)境大豆上獲得6 個(gè)分離物，巴西進(jìn)境大豆上獲得11 個(gè)分離物，烏拉圭進(jìn)境大豆上獲得4 個(gè)分離物。通過菌落形態(tài)、菌絲和分生孢子觀察，初步鑒定其分屬青霉屬（Penicillium spp.）、曲霉屬（Aspergillus spp.）和殼球孢屬（Macrophomina spp.）。

2.3 菌株分子鑒定結(jié)果分析

通過引物ITS4/ITS5 對(duì)病原菌rDNA 區(qū)段的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，將凝膠結(jié)果中顯示為650 bp 長(zhǎng)度的單條帶序列進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)NCBI 網(wǎng)站進(jìn)行序列比對(duì)分析，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察，將菌株鑒定到種（見表2）。

表2 不同國家進(jìn)境大豆種子菌株分子鑒定結(jié)果

由表2 可知，經(jīng)鑒定，21 個(gè)分離物中曲霉屬（Aspergillus spp.）真菌分離率最高，共獲得12 個(gè)，占比達(dá)57%。其主要為紅曲霉（A.ruber）、黃曲霉（A.flavus）、冠突曲霉（A.cristatus）和偽青曲霉（A.pseudoglaucus）。其中烏拉圭進(jìn)境大豆種子分離得到黃曲霉（A.flavus）和菜豆殼球孢（M.phaseolina）；巴西進(jìn)境大豆種子分離得到菜豆殼球孢（M.phaseolina）、偽青曲霉（A.pseudoglaucus）、黃曲霉（A.flavus）和共青霉（P.commune）；美國進(jìn)境大豆種子分離得到紅曲霉（A.ruber）、冠突曲霉（A.cristatus）和共青霉（P.commune）。

通過對(duì)種子表面、種皮和種內(nèi)3 個(gè)不同部位帶菌情況進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)種子表面帶菌情況與種內(nèi)、種皮帶菌情況存在較大差別。來自3 個(gè)國家進(jìn)境大豆種子表面均可分離得到真菌，但美國和烏拉圭進(jìn)境大豆種子種皮均未分離得到真菌。其中美國進(jìn)境大豆種子表面分離物與種內(nèi)分離物不同；烏拉圭進(jìn)境大豆種子表面分離得到菜豆殼球孢，而種內(nèi)未分離得到該真菌；巴西進(jìn)境大豆種子表面分離得到菜豆殼球孢，但在種皮和種內(nèi)均未分離到該真菌（見表2）。

3 結(jié)論與討論

本研究對(duì)2021 年經(jīng)南通海關(guān)進(jìn)境的美國、烏拉圭和巴西進(jìn)境大豆種子帶菌情況進(jìn)行檢測(cè)，共得到21 個(gè)分離物，其中曲霉屬（Aspergillus spp.）真菌分離率最高，占比為57%；其次為青霉屬真菌和菜豆殼球孢。魏思楠等[3]對(duì)我國不同地區(qū)大豆主栽品種種子攜帶真菌進(jìn)行研究表明，我國大豆種子中青霉屬的分離率最高，其次是曲霉屬。其中青霉屬真菌多為貯藏期病害病原菌，對(duì)植物生育期的生長(zhǎng)發(fā)育影響不大。王勇等[5]對(duì)浙江省舟山口岸進(jìn)境大豆攜帶常見真菌進(jìn)行檢測(cè)表明，青霉屬和曲霉屬真菌檢出率最高。

大豆在運(yùn)輸和貯存過程中易發(fā)生霉變，霉變后產(chǎn)生的霉菌毒素可嚴(yán)重危害人體健康。黃曲霉毒素（A.flatoxins）由曲霉屬（Aspergillus spp.）真菌產(chǎn)生，是最常見也是毒性最強(qiáng)的霉菌毒素之一。曲霉屬在自然界中分布較廣，可侵染飼料、花生和油料等。黃曲霉侵染食物后產(chǎn)生的黃曲霉毒素是化合物中毒性和致癌性最強(qiáng)的有害物質(zhì)之一[6]。其中花生種子為最易感染黃曲霉的作物之一，由黃曲霉毒素產(chǎn)生的污染已成為制約花生國際競(jìng)爭(zhēng)力的關(guān)鍵因素[7]。自1960 年發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素后，國內(nèi)及出入境大豆種子及其制品中黃曲霉毒素監(jiān)測(cè)成為重要關(guān)注領(lǐng)域。對(duì)于進(jìn)境大豆攜帶的貯存期病原真菌可采用熏蒸處理，殺死運(yùn)輸過程或貯存中產(chǎn)生的青霉和曲霉。此外，還可采用干熱方法處理帶菌大豆[9]。

菜豆殼球孢（M.phaseolina）是一種常見土傳性病原菌，可侵染500 多種植物。由其引起的大豆炭腐病為影響美國大豆生產(chǎn)的第三大病害，其廣泛發(fā)生于世界主要大豆生產(chǎn)區(qū)，可造成大豆嚴(yán)重減產(chǎn)[10-12]。本研究中，在烏拉圭和巴西進(jìn)境大豆中均分離得到了該真菌。間座殼屬（Diaporthe novem）真菌是一種常見檢疫性病害，該病菌可引起大豆莖稈潰瘍及種子腐爛，對(duì)大豆產(chǎn)生嚴(yán)重危害[13]，本研究未檢測(cè)到該檢疫性病原。

本研究通過對(duì)大豆種子表面、種皮和種內(nèi)不同部位帶菌情況進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，不同部位真菌分離情況差別較大。種皮和種內(nèi)帶菌不同的原因可能是真菌侵染大豆種子后，種子較為干燥，真菌無法繼續(xù)擴(kuò)展，因此只在表面或種皮分離得到。此外，試驗(yàn)中由于純化技術(shù)的限制也會(huì)導(dǎo)致某些真菌無法分離得到。因此在進(jìn)行種子帶菌檢測(cè)時(shí)，不能僅單一地進(jìn)行表面分離物的鑒定，還應(yīng)從不同部位全面取樣進(jìn)行鑒定才能準(zhǔn)確反映種子帶菌情況。

致謝：感謝中華人民共和國南通海關(guān)朱林為本試驗(yàn)提供大豆種子，在此表示衷心感謝！