趙娜 周靈雪 楊向榮

子宮平滑肌瘤,是女性中最常見的盆腔腫瘤,通常會引起嚴重的不規(guī)則的長期經(jīng)期出血,導(dǎo)致不育和流產(chǎn)[1];非手術(shù)治療主要是使用GnRH激動劑來抑制E2和孕酮的循環(huán)水平[2]。在選擇治療方案時,重要的是要考慮該程序?qū)β殉矁涞臐撛谟绊?因為卵巢功能障礙可導(dǎo)致更年期發(fā)作加快和生育能力下降[3]。評估卵巢儲備的方法包括超聲檢查基質(zhì)血流和竇性卵泡計數(shù)以及測量血清FSH、E2和AMH的水平[4]。桂枝茯苓方的主要作用是補血,化瘀和消腫[5]。該配方的常用制劑是丸劑,膠囊劑,片劑和湯劑。對現(xiàn)代文獻進行的文獻計量學(xué)研究分析了桂枝茯苓靈丸治療的疾病名稱,發(fā)現(xiàn)中藥發(fā)病率最高的是腹部腫塊,西藥疾病的最高發(fā)病率是子宮肌瘤[6]。舍瑞林是黃體生成素釋放激素的合成十肽類似物,起激動劑的作用,刺激垂體[7]。臨床上戈舍瑞林用于治療患有前列腺癌,乳腺癌和各種良性婦科疾病(子宮內(nèi)膜異位,子宮肌瘤,子宮內(nèi)膜變薄和輔助生殖)的患者[8]。本項研究通過建立子宮肌瘤大鼠模型,探討桂枝茯苓膠囊聯(lián)合戈舍瑞林對大鼠卵巢儲備的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗大鼠:從河北北方學(xué)院實驗動物研究所(土耳其馬拉蒂亞)獲得的40只健康成年雌性Wistar品系大鼠(3～4月齡)用于實驗。大鼠飼養(yǎng)在標準實驗室條件下[室溫為(22±2)℃;光照/黑暗周期為12 h,上午7∶00點亮]。隨意提供自來水和食物顆粒。實驗程序和實驗方案已獲得地方動物倫理委員會的批準。

1.1.2 子宮肌瘤模型和分組:實驗大鼠正常喂養(yǎng)1周。適應(yīng)后,根據(jù)建立模型的隨機數(shù)表分組,對照組(n=10)標準條件下飼養(yǎng)的實驗大鼠,模型組(n=20)腹腔注射苯甲酸E2(0.5 mg/kg),1次/d,連續(xù)25 d,腹腔注射黃體酮(4 mg/kg),1次/d,連續(xù)5 d。治療組(n=10)在模型大鼠的基礎(chǔ)上,用桂枝茯苓膠囊(江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司)用蒸餾水溶解,配制成0.10 g/ml的溶液,動物劑量為0.70 g·kg-1·d-1;戈舍瑞林(英國,阿斯利康),用蒸餾水溶解,制成0.5 mg/ml的溶液,劑量為1.25 mg·kg-1·d-1,對大鼠進行聯(lián)合膠囊溶劑治療,持續(xù)6周。正常組和模型對照組每天0.9%氯化鈉溶液灌胃4周。給藥后,將大鼠禁食12 h,過夜,不限制飲水量,稱重。用30%(V/V)水合氯醛(3 ml/kg)進行腹腔麻醉,取出每只大鼠的子宮進行測試。所有實驗方案按照美國國家衛(wèi)生與醫(yī)學(xué)研究委員會的實驗動物護理指南進行。

1.2 方法

1.2.1 組織樣本采集與稱重:實驗結(jié)束時,將所有大鼠麻醉(2.5 mg/kg Alfazyne和12.5 mg/kg Ketalar),稱重,并通過心臟穿刺獲得血樣。立即分離血清和血漿,并保持在20℃進行后續(xù)分析。采集血液樣本后,迅速將大鼠的2個卵巢取出并清洗和稱重。左卵巢固定在10%中性甲醛緩沖液中以進行光學(xué)顯微組織處理,而右卵巢的一半固定在2.5%戊二醛中以通過電子顯微鏡進行超微結(jié)構(gòu)評估。將右卵巢的另一半迅速冷凍在40℃進行生化分析。用組織勻漿器在PBS(1/10;重量/體積)中將組織勻漿。將樣品離心并收集上清液以進行分析。

1.2.2 激素測定:使用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒定量測定大鼠血清樣品中的E2,FSH,黃體生成素(Luteinizing hormone,LH)和AMH (中國浙江)。

1.2.3 組織學(xué)和卵泡計數(shù):為了評估卵巢結(jié)構(gòu)和卵泡數(shù)量,蘇木精-伊紅染色在卵巢的第10個部分進行,以使每個部分與下一個第10個部分相隔約50～60 μm的距離。根據(jù)以下定義對卵泡進行計數(shù):原始卵泡;被薄層,單層的所謂濾泡上皮細胞包圍。初級卵泡;卵母細胞周圍的單層或多層濾泡上皮變成等棱形或高度棱柱形。次級卵泡;卵泡中卵母細胞被兩層以上的顆粒細胞覆蓋,并且開始形成胃竇。Graafian(第三級)卵泡;卵泡,卵泡具有充滿卵泡液的單個大竇腔,其中顆粒細胞圍繞竇腔,卵母細胞被一些顆粒細胞(卵丘細胞)包圍。卵泡濾泡顆粒細胞中的退化性透明帶或卵母細胞以及融合。竇腔內(nèi)有顆粒細胞和細胞碎片。所有切片均用光學(xué)顯微鏡(Leica DM 1000)進行評估,并用連接的數(shù)碼相機(Leica DMC 2900)進行監(jiān)控。

1.2.4 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標記(TUNEL)分析:TUNEL測定法用于檢測DNA損傷。按照制造商的說明進行測定程序(S7101;Apoptag Plus過氧化物酶原位細胞凋亡試劑盒,默克密理博,德國達姆施塔特,德國)。將取自每組卵巢中央水平的切片在甲苯中脫蠟,并通過一系列分級的乙醇和雙蒸餾水進行復(fù)水。載玻片用PBS沖洗并保存在蛋白酶K(圣路易斯,密蘇里州)中進行抗原回收。將切片與3%H2O2(默克公司,德國達姆施塔特,德國)一起孵育5 min,漂洗,在室溫下與1×平衡緩沖液一起孵育10 min。將TdT(末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶)反應(yīng)溶液在37℃下應(yīng)用1 h,不同的是使用蒸餾水代替TdT酶作為陰性對照。將切片在室溫下置于停止/洗滌緩沖液中10 min。將抗洋地黃毒苷-過氧化物酶綴合物應(yīng)用于切片。將DAB用作色原后,將切片用甲基綠(Trevigen的TM)復(fù)染。在所有類型的卵泡中,TUNEL(+)細胞占總細胞數(shù)的百分比均記錄為凋亡指數(shù)。

1.2.5 生化分析氧化應(yīng)激:使用Teflon玻璃勻漿器在150 mmol/L KCl(pH 7.4)中以整個勻漿的1∶10(w/v)稀釋液對組織進行勻漿。將勻漿液在18 000×g和4℃下離心30 min,以確定MDA和GSH濃度以及SOD和CAT活性。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡分析:通過Bradford試劑測定均質(zhì)樣品中的蛋白質(zhì)濃度。之后,將40 μg蛋白質(zhì)在12%SDS-PAGE上分離并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(sc-3718,圣克魯斯生物技術(shù))。用在Tris緩沖鹽水(TBS)中的5%脫脂脫脂奶粉(Sigma,70166)封閉膜。將膜在TBST(含0.1%Tween-20的TBS)中洗滌2次,并與一抗(1∶500單克隆大鼠抗caspase-3,sc-7148,caspase-1,sc-47778,Santa Cruz)孵育過夜生物技術(shù))。將膜與結(jié)合了HRP的二抗(1∶1 000山羊抗小鼠IgG1-HRP)一起溫育2 h。用試劑盒試劑(sc-2048,圣克魯斯生物技術(shù)試劑盒)顯影印跡。使用Image J OD分析軟件分析數(shù)據(jù)。關(guān)于β-肌動蛋白將信號標準化。

1.2.7 組織病理學(xué)檢查:固定后,將樣品包埋在石蠟中。使用Leica RM2125RTS從5 μm的石蠟塊上切下切片,并用蘇木精和曙紅染色。在光學(xué)顯微鏡(東京,日本)下檢查所有載玻片。卵巢損傷的標準是間質(zhì)性水腫,擴張,出血,多形核白細胞浸潤(PNL)和濾泡細胞變性(顆粒細胞)。對于每個樣本,標準的評分為0～3分(0 =無;1 =輕度;2 =中等;3 =嚴重)。卵泡根據(jù)平均直徑分為幾類:原始的(<20 μm),竇前的(20～220 μm),小肛門的(221～310 μm)和大肛門的(311～370 μm)。卵巢切片由同一位病理學(xué)家檢查,他們對測試組不知情。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件,采用單向方差分析和事后Tukey的顯著差異檢驗對生化值進行分析,采用Kruskal-Wallis方差分析比較組織學(xué)結(jié)果,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 治療干預(yù)降低體重和卵巢的重量 模型組較對照組的身重和器官卵巢重量升高(P<0.05),治療組較模型組降低(P<0.05),說明桂枝茯苓膠囊聯(lián)合戈舍瑞林治療降低子宮肌瘤大鼠的體重。見表1。

表1 大鼠體重和器官稱重 g,

2.2 激素水平檢測 使用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒對各實驗組大鼠進行血清激素水平檢測,模型組較對照組E2和AMH水平降低,而FSH和LH水平升高(P<0.05),治療組較模型組E2和AMH水平升高,FSH和LH水平降低(P<0.05)。見表2。

表2 大鼠血清激素水平檢測

2.3 大鼠卵泡計數(shù)分析 通過組織學(xué)分析大鼠卵巢卵泡的發(fā)育情況,模型組較對照組原始卵泡、Graafian卵泡及黃體數(shù)量減少,次級卵泡和卵泡濾泡增多(P<0.05),治療組較模型組原始卵泡、Graafian卵泡及黃體數(shù)量增多,次級卵泡和卵泡濾泡減少(P<0.05)。見表3。

表3 大鼠卵泡計數(shù)分析

2.4 TUNEL方法評估顆粒細胞 在電鏡下觀察發(fā)現(xiàn),與對照組相比,PCOS組卵泡顆粒細胞凋亡(黑色箭頭表示)指數(shù)增加(P<0.05)。模型組的凋亡主要出現(xiàn)在Graafian卵泡顆粒細胞中。與模型組相比,治療組TUNEL(+)顆粒細胞數(shù)量減少(P<0.05)。見圖1。

圖1 TUNEL方法評估顆粒細胞凋亡(蘇木精染色×200)

2.5 大鼠卵巢氧化應(yīng)激水平分析 對大鼠卵巢勻漿稀釋液進行氧化應(yīng)激水平分析,模型組較對照組MDA和CAT水平升高,GSH和SOD水平降低(P<0.05),治療組較模型組MDA和CAT水平降低,GSH和SOD水平升高(P<0.05),數(shù)據(jù)表明干預(yù)治療后能降低子宮肌瘤大鼠卵巢中的氧化應(yīng)激水平。見表4。

表4 大鼠卵巢氧化應(yīng)激水平分析

2.6 干預(yù)治療抑制凋亡蛋白的表達 通過蛋白印跡分析大鼠卵巢Caspase-3和Caspase-1的表達,模型組較對照組Caspase-3和Caspase-1的表達升高(P<0.05),治療組較模型組Caspase-3和Caspase-1的表達降低(P<0.05)。見圖2,表5。

圖2 Caspase-3和Caspase-1蛋白印跡分析

表5 Caspase-3和Caspase-1蛋白質(zhì)表達水平

2.7 卵巢組織損傷評分 模型組較對照組的水腫、擴張、出血和白細胞浸潤評分升高(P<0.05),治療組較模型組降低(P<0.05),說明桂枝茯苓膠囊聯(lián)合戈舍瑞林保護子宮肌瘤大鼠的卵巢損傷。在對照組中觀察到正常的卵泡和黃體,模型組顯示血管擴張(粗箭頭),出血(細箭頭),濾泡變性(箭頭頸)和多形核淋巴細胞浸潤(星形)。治療組中觀察到輕度出血(細箭頭),血管擴張(粗箭頭),濾泡變性(箭頭頸)和多形核淋巴細胞浸潤(星形),較模型組損傷減輕(P<0.05)。見表6,圖3。

圖3 大鼠卵巢顯微鏡外觀(HE×100)

表6 大鼠卵巢組織病理學(xué)評估 分,

3 討論

子宮肌瘤的發(fā)生隨著年齡增加而增加,在絕經(jīng)年齡左右最高,此后會減少,癥狀取決于腫瘤的大小和位置[9]。然而,絕大多數(shù)的腫瘤無癥狀,并且是常規(guī)婦科檢查(雙手或超聲檢查)中偶然發(fā)現(xiàn)的[10]。肌瘤最常見的體征和癥狀包括月經(jīng)周期紊亂大出血和月經(jīng)疼痛,與盆腔疼痛相關(guān)的盆腔腫塊,泌尿問題或便秘[10]。子宮肌瘤,尤其是黏膜下和壁內(nèi)肌瘤也可能引起不孕和復(fù)發(fā)性流產(chǎn)[11]。對于肌瘤的治療,有多種治療選擇,包括手術(shù)治療,非手術(shù)替代方法和藥物治療[12]。最初,子宮切除術(shù)被認為是有癥狀肌瘤的一種治療選擇[13]。如今,由于人們越來越關(guān)注患者的生活質(zhì)量和個性化的治療期望,治療的選擇取決于患者的年齡以及意愿。

卵巢儲備是個體生殖潛能的量度,理解為剩余卵母細胞的數(shù)量和質(zhì)量[14]。卵巢儲備主要用于預(yù)測對卵巢刺激的反應(yīng)。降低的卵巢儲備有時被稱為原發(fā)性卵巢功能不全,不同于更年期和卵巢早衰[15]。據(jù)認為,卵巢儲備降低導(dǎo)致卵巢反應(yīng)差(卵泡數(shù)量減少,胚胎數(shù)量減少和消除率增加)以及受精能力降低。但是,筆者發(fā)現(xiàn)目前尚無統(tǒng)一的卵巢儲備降低定義。生化和超聲檢查可以間接評估卵巢儲備。生化測試包括FSH、E2、抑制素B和AMH以及克羅米芬檸檬酸鹽激發(fā)試驗。竇卵泡計數(shù)和卵巢體積是用于評估卵巢儲備的超聲檢查[16]。根據(jù)目前的指南,FSH是降低卵巢儲備的最常用篩查方法,但卵泡計數(shù)和AMH是最有前途的預(yù)測指標。許多因素,例如化學(xué)療法或放射療法子宮肌瘤以及吸煙可能會對卵巢儲備產(chǎn)生負面影響。

研究對卵巢功能的影響依賴于血清激素水平,特別是FSH,E2和AMH的分析[17]。FSH從垂體釋放,刺激未成熟卵泡的生長[18]。當(dāng)卵巢儲備(以剩余卵泡的數(shù)量來衡量)減少或減少時,由于抑制素B(垂體卵泡釋放的激素)對垂體的負反饋減少,FSH升高[19]。因此,在月經(jīng)周期第3天測得的FSH水平升高(410 mU/ml),表明卵巢儲備下降。E2從竇狀卵泡釋放;因此,在較高的FSH水平的影響下較低的E2水平表明卵巢儲備減少。AMH也從竇腔卵泡中釋放,因此較低的AMH水平是卵巢儲備減少的標志[20]。超聲檢查也可用于測量卵巢體積,竇房卵泡計數(shù),卵巢間質(zhì)血流量,卵巢動脈灌注和卵巢動脈抵抗指數(shù)。血清激素測試可提供有關(guān)剩余卵巢儲備的信息,并且可以用來推斷卵巢的功能。

在這項研究發(fā)現(xiàn),藥物誘導(dǎo)子宮肌瘤會導(dǎo)致卵巢儲備減少,這與組織氧化應(yīng)激增加,荷爾蒙變化受損和組織學(xué)損害增加有關(guān)。模型誘導(dǎo)后,大鼠的體重和卵巢重量增加,E2和AMH水平降低,而FSH和LH水平升高,這對卵巢功能尤其是儲備特別不利,并且卵巢組織具有超出對照組的氧化應(yīng)激。相比之下,接受桂枝茯苓膠囊和戈舍瑞林藥物治療的大鼠的組織氧化應(yīng)激參數(shù),卵巢儲備標志物和組織病理學(xué)變化得到了明顯改善。MDA是脂質(zhì)過氧化作用的最終產(chǎn)物,含量增加反映了氧化應(yīng)激。相反,谷胱甘肽水平的升高以及SOD,CAT和GPx的活性表明氧化損傷后組織的愈合。氧化應(yīng)激通過抑制卵母細胞的核和細胞質(zhì)成熟并誘導(dǎo)凋亡而導(dǎo)致卵巢衰竭。本研究結(jié)果還表明,子宮肌瘤病變誘導(dǎo)的卵巢功能不全后,桂枝茯苓膠囊和戈舍瑞林可以改善卵巢儲備標志物。與模型組相比,治療組的AMH和E2水平增加,而FSH和LH水平則下降。同時表明聯(lián)合治療可改善子宮肌瘤卵巢組織中的組織學(xué)參數(shù),例如出血,血管充血和單核細胞浸潤。另一方面,Caspase-3和Caspase-1是caspase級聯(lián)反應(yīng)的重要組成部分,已與細胞凋亡依賴性信號通路相關(guān)。在本研究中,通過免疫印跡法檢測Caspase-3和Caspase-1蛋白的表達,聯(lián)合治療抵消卵巢細胞的凋亡,還通過測量卵泡計數(shù)評估了聯(lián)合治療對卵巢儲備的保護作用,觀察到竇前和較小的肛門卵泡的損失較小。

綜上所述,桂枝茯苓膠囊聯(lián)合戈舍瑞林可降低子宮肌瘤大鼠卵巢組織氧化應(yīng)激和組織病理參數(shù),改善激素水平,提高卵巢儲備。