宋浩杰 宋琴 施為建 呂成偉 蔣鳳蓮 王麗 李全泳

前列腺癌是男性常見的惡性腫瘤,在歐美地區(qū)的發(fā)病率和死亡率位居男性惡性腫瘤的前三位[1]。近幾年來,我國(guó)前列腺癌的發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)上升趨勢(shì),前列腺癌發(fā)現(xiàn)時(shí)往往以中晚期為主,總體治療效果仍不理想[2],亟需探索新的治療手段。而以樹突狀細(xì)胞(dendritic cells,DC)為基礎(chǔ)的腫瘤疫苗是前列腺癌治療中極有希望取得突破的療法[3]。前列腺特異性抗原(prostate specific antigen,PSA)是前列腺癌的特異性標(biāo)志物,是一種非常理想的前列腺癌靶抗原。實(shí)驗(yàn)研究表明:以重組腺相關(guān)病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)為載體,將前列腺特異性抗原(PSA)基因負(fù)載DC,在體外能夠誘導(dǎo)較強(qiáng)的PSA抗原特異性的抗腫瘤效應(yīng)[4]。但成熟DC存在宿主自身抗原特異性免疫耐受[5],限制了DC疫苗的臨床療效。如何促進(jìn)DC成熟、共刺激和抗原遞呈能力以及打破對(duì)自身腫瘤相關(guān)抗原的免疫耐受是目前DC腫瘤疫苗成功的關(guān)鍵。細(xì)胞因子信號(hào)抑制因子1(suppressor of cytokine signaling 1,SOCS1) 是一個(gè)負(fù)性調(diào)控分子家族成員,對(duì)多種細(xì)胞因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)起負(fù)調(diào)控作用。研究表明,SOCS1可以調(diào)控DC及T細(xì)胞的分化、成熟和活化,對(duì)DC的免疫負(fù)反饋調(diào)節(jié)起重要作用[6]。我們前期的研究證實(shí):沉默人DC的SOCS1表達(dá),可以促進(jìn)DC的成熟和活化,促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的分泌,減少抑制性細(xì)胞因子的分泌,參與免疫調(diào)控,有利于促進(jìn)DC刺激Th1型免疫反應(yīng)[7]。本研究探索應(yīng)用重組腺相關(guān)病毒(rAAV)介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù),沉默人DC的 SOCS1基因的表達(dá),聯(lián)合攜帶PSA基因的rAAV/PSA感染DC提供持續(xù)的抗原提呈,制備新型DC疫苗,以期促進(jìn)DC突破宿主水平自身抗原特異性免疫耐受,從而有效激發(fā)針對(duì)前列腺癌的特異性免疫應(yīng)答,為臨床前列腺癌的免疫治療提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 淋巴細(xì)胞分層液(Ficoll-Hypaque)購(gòu)自天津血液研究所;重組人白細(xì)胞介素 2(IL-2)、重組人白細(xì)胞介素4(IL-4)、重組人白細(xì)胞介素 7(IL-7)、重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)購(gòu)自Sigma 公司;RPMI-1640培養(yǎng)基、AIM-V 培養(yǎng)基購(gòu)自Invitrogen公司;DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司;RT-PCR試劑盒購(gòu)自 Takara公司;Anti-SOCS1抗體購(gòu)自 Millipore公司。熒光標(biāo)記小鼠抗人抗體CD80-PE、CD83-FITC、CD86- FITC、CD4-FITC、CD8-FITC、CD25-PE、CD69-PE購(gòu)自BD公司;FoxP3-APC染色試劑盒購(gòu)自eBioscience公司;IL-10、IL-12p70、IFN-γ ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自eBioscience公司;LDH細(xì)胞殺傷檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Biovision公司。流式細(xì)胞儀為美國(guó) BD公司產(chǎn)品;倒置熒光顯微鏡購(gòu)自O(shè)lympus公司;美國(guó)Bio-Rad 550型酶標(biāo)儀。

1.2 重組腺相關(guān)病毒和細(xì)胞株 攜帶PSA基因的rAAV/PSA由美國(guó)阿肯色大學(xué)醫(yī)學(xué)院基因治療中心劉勇教授惠贈(zèng),病毒滴度為1×1011eg/ml。表達(dá)shRNA-SOCS1和綠色熒光蛋白的重組腺相關(guān)病毒(rAAV-shRNA-SOCS1)已在前期研究中構(gòu)建制備完成[8],病毒滴度為1×1012eg/ml,保存于-80℃。shRNA-SOCS1序列為:F 5’-TCGACCTGGTTGTTGTAGCAGCTTAAA AGCTTAAGCTGCTACAACAACCAGTTTTTT-3’;R 5’-CTAGAAAAAACTGGTTGTTGTAGCAGCTTAAGCTTTT AAGCTGCTACAACAACCAGG-3’。人前列腺癌細(xì)胞株LNCaP (HLA-A2+,PSA+)由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 方法

1.3.1 人外周血DC的培養(yǎng):無菌抽取HLA-A2陽性健康志愿者外周血50 ml,肝素抗凝,采用Ficoll密度梯度法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC),培養(yǎng)于6孔板,貼壁5 h后,輕輕洗去懸浮的淋巴細(xì)胞,剩余貼壁的細(xì)胞即為DC前體細(xì)胞,每孔加2.5 ml含GM-CSF(800 U/ml)的 AIM-V培養(yǎng)基,隔天半量換液,從培養(yǎng)第2天起加入IL-4(1 000 U/ml)。在DC培養(yǎng)第3天,用rAAV-shRNA-SOCS1感染未成熟DC,感染復(fù)數(shù)MOI為100,實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和RNA干擾組,感染8 h后除去含病毒的培養(yǎng)基,以新鮮的AIM-V培養(yǎng)基取代之,并于第5天起給予TNF-α(20 ng/ml)刺激DC成熟,第7天收集懸浮細(xì)胞,即為成熟的DC。

1.3.2 Western blot檢測(cè)DC的SOCS1蛋白的表達(dá):重組腺相關(guān)病毒感染96 h后收集各組細(xì)胞進(jìn)行總蛋白提取,BCA法測(cè)定總蛋白濃度,樣品蛋白SDS-PAGE電泳分離,電轉(zhuǎn)至PVDF 膜上,封閉液中孵育,加入SOCS1小鼠抗人單克隆一抗(1∶1 000),4℃孵育過夜。TBST洗滌后加入山羊抗鼠二抗(1∶1 000)室溫下?lián)u床孵育2 h,TBST洗滌后用化學(xué)發(fā)光試劑孵育1 min,用X線片曝光顯影。以β-actin為內(nèi)參照驗(yàn)證蛋白的含量。

1.3.3 重組腺相關(guān)病毒感染DC:按照1.2.1方法培養(yǎng)的DC至第3天,重組腺相關(guān)病毒rAAV-shRNA-SOCS1和rAAV/PSA感染未成熟DC,按照不同處理方式將DC分為3組,Control-DC組(空白對(duì)照組DC),rAAV/PSA-DC組(rAAV/PSA感染DC),SOCS1(-)+rAAV/PSA-DC組(沉默SOCS1聯(lián)合rAAV/PSA感染DC)。從第5天起給予TNF-α (20 ng/ml)刺激DC成熟。隔天半量換液。第7天收集懸浮細(xì)胞,即為成熟的DC,計(jì)數(shù)。

1.3.4 ELISA法檢測(cè)DC分泌細(xì)胞因子的水平:收集3組DC培養(yǎng)第7天的上清液,用ELISA試劑盒檢測(cè)上清液中細(xì)胞因子IL-10、IL-12 p70的含量。反應(yīng)終止后0.5 h內(nèi)用酶標(biāo)儀檢測(cè) 450 nm吸光度,按標(biāo)準(zhǔn)品濃度與吸光值關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所測(cè)細(xì)胞因子的含量。

1.3.5 FACS檢測(cè)DC表面分子表型:DC培養(yǎng)第7天,分別收集3組成熟的DC,將細(xì)胞懸液濃度調(diào)至1× 106/ml,PBS洗滌2遍后,100 μl PBS重懸細(xì)胞,分別加入CD80、CD83、CD86熒光標(biāo)記的單克隆抗體及同型對(duì)照抗體,混勻后4℃避光孵育30 min,PBS 緩沖液洗滌后,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC表面分子表型的表達(dá)情況。

1.3.6 成熟DC誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)和IFN-γ含量測(cè)定:在6孔板內(nèi),按DC∶T細(xì)胞=1∶20的比例混合細(xì)胞,在含GM-CSF(800 U/ml)、IL-2(20 U/ml)、IL-7(20 ng/ml)的 AIM-V 培養(yǎng)基中培養(yǎng),隔天半量換液,共培養(yǎng)7 d,收獲活化的細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)。收集DC與T細(xì)胞共育第7天的上清液,用ELISA試劑盒檢測(cè)上清液中IFN-γ的含量。

1.3.7 FACS分析CTL細(xì)胞的免疫表型:3組DC與T淋巴細(xì)胞混合反應(yīng)后,分別收集各組CTL細(xì)胞,經(jīng)處理后置于流式細(xì)胞儀專用測(cè)試管中,分別加入熒光素標(biāo)記的鼠源性單抗及同型對(duì)照抗體,4℃避光孵育30 min,用PBS溶液洗滌2次,流式細(xì)胞儀分析CTL細(xì)胞的免疫表型CD4+、CD8+、CD8+CD69+和CD4+CD25+FoxP3+Treg的表達(dá)情況。

1.3.8 LDH 法檢測(cè)CTL對(duì)PSA陽性靶細(xì)胞的殺傷效應(yīng):CD8+細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)反應(yīng)采用 LDH 法檢測(cè)。收集3組DC誘導(dǎo)的CTL作為效應(yīng)細(xì)胞,收獲對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PSA陽性前列腺癌細(xì)胞株LNCaP作為靶細(xì)胞,按效靶比 20∶1 的比例分別加入96孔板中,置 37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h。同時(shí)設(shè)4個(gè)對(duì)照:靶細(xì)胞最大釋放組、體積校正對(duì)照組、背景對(duì)照組和自然釋放組。按LDH-Cytotoxicity 試劑盒說明書操作。 細(xì)胞殺傷率=[(實(shí)驗(yàn)組釋放-效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放-靶細(xì)胞自發(fā)釋放)/(靶細(xì)胞最大釋放-靶細(xì)胞自發(fā)釋放)]×100%。同時(shí)取PSA陰性的K562、SW480細(xì)胞為靶細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)以分析CTL的非特異殺傷活性。

2 結(jié)果

2.1 Western blot檢測(cè)DC的SOCS1基因沉默效果 Western blot檢測(cè)重組腺相關(guān)病毒感染DC 96 h后各組DC細(xì)胞SOCS1蛋白的表達(dá)情況,結(jié)果為RNA干擾組SOCS1蛋白的表達(dá)較陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組顯著下降(P<0.05)。陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1,表1。

表1 Western blot 檢測(cè)DC的SOCS1蛋白表達(dá) n=3,

圖1 Western blot 檢測(cè)DC的SOCS1蛋白表達(dá);1空白對(duì)照組;2陰性對(duì)照組;3RNA干擾組

2.2 DC分泌細(xì)胞因子IL-10、IL-12 p70的水平 ELISA檢測(cè)顯示,與Control-DC組和rAAV/PSA-DC組比較,SOCS1(-)+rAAV/PSA-DC組成熟DC培養(yǎng)上清液中IL-12 p70的分泌水平顯著升高,而IL-10的分泌水平顯著下降,3組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 3組DC分泌細(xì)胞因子IL-12 p70、IL-10水平比較 n=3,%,

2.3 DC表面分子表型的表達(dá) FACS 檢測(cè)顯示:3組成熟 DC均高表達(dá) CD80、CD83和CD86;SOCS1(-)+rAAV/PSA-DC組各表面分子表型標(biāo)志的表達(dá)水平最高,與Control-DC組和rAAV/PSA-DC組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見表3。

表3 3組DC表面分子表型的表達(dá)水平 n=3,%,

2.4 CTL細(xì)胞釋放IFN-γ水平檢測(cè) ELISA檢測(cè)顯示,與Control-DC組和rAAV/PSA-DC組比較,SOCS1(-)+rAAV/PSA-DC組成熟DC誘導(dǎo)的CTL釋放IFN-γ的水平顯著升高,3組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 3組CTL細(xì)胞釋放IFN-γ水平比較 n=3,%,

2.5 FACS分析CTL細(xì)胞的免疫表型 FACS檢測(cè)結(jié)果顯示:與Control-DC組和rAAV/PSA-DC組比較,SOCS1(-)+rAAV/PSA-DC組成熟DC誘導(dǎo)的CTL細(xì)胞免疫表型中,CD8+、CD8+CD69+T細(xì)胞的比例均明顯增高;而CD4+、CD4+CD25+FoxP3+Treg細(xì)胞的比例均顯著降低,3組間比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表5。

表5 3組CTL細(xì)胞的免疫表型 n=3,%,

2.6 3組DC誘導(dǎo)的 CTL細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷活性和抗原特異性 與Control-DC組和rAAV/PSA-DC組比較,SOCS1(-)+rAAV/PSA-DC組成熟DC誘導(dǎo)的CTL細(xì)胞對(duì)PSA陽性前列腺癌細(xì)胞株LNCaP有明顯的殺傷作用,Control-DC組對(duì)LNCaP細(xì)胞無明顯殺傷作用,3組間比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而以上3組CTL細(xì)胞對(duì)PSA陰性的K562、SW480細(xì)胞均無明顯殺傷作用。見表6。

表6 3組CTL細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷活性 n=3,%,

3 討論

DC是體內(nèi)功能最強(qiáng)的專職抗原提呈細(xì)胞,在誘導(dǎo)特異性抗腫瘤細(xì)胞免疫中起關(guān)鍵作用,DC疫苗被認(rèn)為是一種最具潛能的腫瘤免疫治療手段[9]。在DC腫瘤疫苗制備過程中,如何激發(fā)高效、強(qiáng)大的自身腫瘤相關(guān)抗原特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)是實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵之一,研究證實(shí),采用AAV載體攜帶抗原基因轉(zhuǎn)染DC可使抗原基因在DC內(nèi)穩(wěn)定表達(dá),在體外誘導(dǎo)特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)[10,11]。然而,由于DC自身存在免疫負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制,限制了DC的能力,使DC腫瘤疫苗的臨床療效不能有效發(fā)揮,如何突破宿主水平的自身免疫耐受亦是實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn),SOCS1 是多種細(xì)胞因子如 IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-7及IL-12 P70的負(fù)調(diào)控信號(hào),是 DC內(nèi)存在的免疫負(fù)反饋調(diào)節(jié)點(diǎn)[12,13], SOCS1的表達(dá)使成熟的DC能誘導(dǎo)免疫耐受[14]。沉默SOCS1可以顯著促進(jìn)DC成熟、提呈抗原、啟動(dòng)T 細(xì)胞免疫的能力,有效增強(qiáng)DC的抗腫瘤免疫反應(yīng)[15]。Shen等[16]采用RNAi技術(shù)抑制DC的SOCS1表達(dá),提高DC的抗原提呈能力及抗原特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)。在一項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中證實(shí),SOCS1雜合性缺失的小鼠幾乎不出現(xiàn)自身免疫現(xiàn)象,而SOCS1 純合性缺失的小鼠會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的自身免疫現(xiàn)象[17]。由此可得出結(jié)論,應(yīng)用 RNAi技術(shù)部分沉默 DC 的SOCS1基因表達(dá),一方面可以抑制其負(fù)反饋調(diào)節(jié),另一方面又不會(huì)引起自身免疫疾病。

基于以上研究,為研發(fā)新型DC腫瘤疫苗提供了一個(gè)新的思路,我們采用RNAi技術(shù)沉默DC的SOCS1的表達(dá),提高DC提呈抗原的能力,再負(fù)載PSA抗原基因,從而有效激發(fā)針對(duì)前列腺癌的特異性免疫應(yīng)答。本研究中采用rAAV-shRNA-SOCS1可高效感染DC,行Western blot檢測(cè),DC的SOCS1蛋白的表達(dá)水平明顯降低,基因沉默效率達(dá)82.5%。這表明rAAV-shRNA-SOCS1可有效沉默人DC的SOCS1的表達(dá)。我們進(jìn)一步研究觀察SOCS1基因沉默DC的生物學(xué)特性和免疫功能。為了驗(yàn)證沉默SOCS1基因?qū)C成熟的影響,我們檢測(cè)了DC分子表型的變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組比較,SOCS1基因沉默的成熟DC高表達(dá)CD80、CD83和CD86,表面共刺激分子(CD80、CD83及CD86)是DC功能成熟的表面標(biāo)志,隨著DC成熟這些分子表達(dá)水平會(huì)隨之增高。

DC 在成熟過程表達(dá)并分泌大量的IL-1β、IL-12、IFN-γ、TNF-α等多種炎性細(xì)胞因子,這類細(xì)胞因子能有效誘導(dǎo)并增強(qiáng)免疫反應(yīng),在機(jī)體免疫反應(yīng)過程中發(fā)揮了重要作用。與對(duì)照組比較,SOCS1基因沉默的DC可以促進(jìn)炎性細(xì)胞因子IL-12 p70的釋放,減少抑制性細(xì)胞因子IL-10的釋放,從而減弱抑制因子信號(hào),可以進(jìn)一步促進(jìn)DC成熟,提高DC的抗原提呈能力,從而參與免疫調(diào)控,增強(qiáng)DC的免疫功能。本研究中,與對(duì)照組比較,SOCS1(-)+rAAV/PSA-DC組成熟DC誘導(dǎo)的CTL可顯著促進(jìn)Th1類細(xì)胞因子IFN-γ的釋放,高表達(dá)CD8(殺傷型T細(xì)胞標(biāo)志)、CD69 (T細(xì)胞早期活化的標(biāo)志),而低表達(dá)CD4(輔助型T細(xì)胞標(biāo)志)、CD25、 FoxP3(抑制性T細(xì)胞標(biāo)志)。以上結(jié)果表明,沉默SOCS1聯(lián)合rAAV/PSA感染的DC能夠明顯促進(jìn)T細(xì)胞的增殖和活化,促進(jìn)Th1型免疫反應(yīng)發(fā)生,減少Treg細(xì)胞的生成,有助于突破腫瘤免疫耐受,抑制腫瘤免疫逃逸,其抗原遞呈途徑主要為MHCⅠ類途徑,識(shí)別CD8+T細(xì)胞并活化,從而誘發(fā)更強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫反應(yīng)。

制備DC腫瘤疫苗的核心是所誘導(dǎo)CTL能特異識(shí)別并殺傷抗原陽性的靶細(xì)胞,本研究中,與對(duì)照組比較,SOCS1(-)+rAAV/PSA-DC組成熟DC所誘導(dǎo)CTL對(duì)PSA陽性LNCaP靶細(xì)胞具有明顯的殺傷活性,殺傷活性明顯優(yōu)于單純r(jià)AAV/PSA-DC所誘導(dǎo)的CTL,并且此殺傷活性具有抗原特異性。這與國(guó)內(nèi)外的研究結(jié)論[18,19]相似。

綜上所述,rAAV/PSA感染DC,能夠誘導(dǎo)針對(duì)PSA抗原的特異性免疫反應(yīng),而沉默SOCS1基因進(jìn)一步增強(qiáng)了DC的免疫功能,兩種方法聯(lián)合制備的新型前列腺癌DC疫苗能夠進(jìn)一步增強(qiáng)其免疫活性,產(chǎn)生高效而特異性的抗前列腺癌免疫效應(yīng),為臨床制備更高效、更特異前列腺癌DC疫苗奠定基礎(chǔ)。