王曉燕 孟建輝

糖尿病心肌病(Diabetic cardiomyopathy, DCM)是糖尿病患者在沒有冠心病、高血壓和心臟瓣膜病等情況下,存在的心臟結構和功能異常[1-3]。DCM主要以心肌細胞凋亡、心肌間質纖維化、左心室舒張和收縮功能障礙等為特征[4,5]。DCM是糖尿病患者心源性猝死和死亡的主要原因[6]。因此,DCM的預防和治療是亟待解決的難題。目前DCM的發(fā)病機制仍不清楚,心肌細胞凋亡是促進DCM進展的主要危險因素[7],抑制心肌細胞凋亡有可能成為改善心功能的有效治療方法。MicroRNAs (miRNAs)是長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA,通過抑制翻譯或裂解靶RNA來調節(jié)轉錄后的基因表達。以往的研究表明miRNAs參與了多種生物學過程,包括細胞增殖、分化、轉移、凋亡、糖代謝和脂肪代謝等。近期有研究表明miRNAs在DCM中的表達水平發(fā)生改變[8],并形成復雜的網絡[9,10],miRNAs通過參與轉錄和轉錄后調節(jié)影響DCM的心臟功能和重構。目前miR-29家族在糖尿病、心血管疾病中的研究日益增多,這些研究主要集中在糖尿病胰島素抵抗、糖代謝異常、脂代謝異常和全身炎性反應等方面。筆者發(fā)現miR-29a是否通過心肌細胞凋亡途徑參與了糖尿病心肌病的發(fā)病機制,尚不清楚。研究起始時間為2020年10月,本研究采用高糖高脂飲食聯合腹腔注射鏈脲霉素(streptozotocin, STZ)的方法,成功建立DCM大鼠模型,探討miR-29a在DCM大鼠心肌細胞凋亡中的作用及其對心功能的影響,從而為DCM的診治提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑 miR-29引物、ReverAid First Strand cDNA Synthesis由廣州銳博公司合成。Rrizol Reagent 購于美國Invitrogen公司。RNAiso Plus、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒、蛋白分子量標準購于TaKaRa公司。RIPA蛋白抽提試劑盒購于碧云天生物研究所。磷酸酶抑制劑混合物、蛋白酶抑制劑混合物購于凱基生物公司。FITC Annexin V細胞凋亡檢測試劑盒I購于美國BD公司。羊抗鼠IgG-HRP購于北京中杉金橋生物公司。GAPDH抗體購于北京賽諾博生物技術中心。Bcl-2、Mcl-1、Bax、Caspase-3和Bak1 抗體均購于Cell signaling Technology Inc。

1.2 實驗動物 雄性、10周齡、Sprague-Dawley(SD)大鼠(體重200±15 g),由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供。常規(guī)喂大鼠飼料和飲用水,室溫保持在(24±1.0)℃,濕度50%～60%。所有動物使用符合河北醫(yī)科大學動物管理委員會的要求。

1.3 實驗一

1.3.1 動物分組及DCM模型的成功建立:20只SD大鼠隨機分為對照組(n=10)和DCM組(n=10)。參考DCM大鼠造模方法[11],模型組大鼠給予高糖高脂飼料(20%蔗糖、10%豬油、基礎飼料),于第4、5周末,禁食12 h,2次腹腔注射1%鏈脲佐菌素(30 mg/kg, STZ),STZ溶液現用現配;對照組大鼠喂正常飼料,于相同時間腹腔注射等量檸檬酸緩沖液。72 h后采集尾靜脈血測定空腹血糖水平(禁食12 h),大鼠連續(xù)2次血糖>16.7 mmol/L被納入DCM組,血糖不達標的被排除。2組大鼠繼續(xù)喂養(yǎng)10周。

1.3.2 觀察指標及方法:觀察測定2組大鼠體重、尿量、血壓、血糖和HbA1c水平。采用實時定量聚合酶鏈反應(Quantitative real-time PCR, qRT-PCR)法測定2組心肌組織中miR-29a的表達水平。第14周末,采用10%水合氯醛將大鼠麻醉后,開胸取心臟,取心肌組織,每100毫克心肌組織加入1 ml TRIzol試劑,逐步提取總RNAs,Nanodrop 2000鑒定RNAs的濃度和純度。取原始樣品的RNAs合成cDNA。使用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒檢測基因表達水平,在7500定量PCR分析儀上進行qRT-PCR檢測,采用相對定量2-△△Ct法分別計算2組心肌組織中miR-29a-3p的表達水平。PCR反應條件:95℃ 預變性10 min,95℃ 變性10 s,60℃ 退火1 min,共40循環(huán)。

1.4 實驗二

1.4.1 動物分組:將16只SD大鼠隨機分為對照組(n=4),DCM組(n=12),DCM大鼠均按實驗一方法造模成功(n=12)。將12只DCM大鼠再隨機分為:DCM組(n=4),DCM+NC mimics組(n=4)和DCM+miR-29a mimics組(n=4)。分別給予DCM+NC mimics組、DCM+miR-29a mimics組大鼠心肌局部注射攜帶NC mimics慢病毒(4×107個)和攜帶miR-29a-3p mimics慢病毒(4×107個),并喂養(yǎng)4組大鼠至滿14周。

1.4.2 觀察指標:①觀察大鼠的心功能:于第14周末大鼠稱重后,腹腔注射1%巴比妥鈉進行麻醉。大鼠仰臥位固定,剃胸毛。M型超聲心動圖檢測4組大鼠的心功能。②檢測指標包括:左心室射血分數(left ventricular ejection fraction, LVEF)、左心室短軸縮窄率(Left ventricular fractional shortening, LVFS)、舒張早期心室充盈最大速度(E)、舒張晚期心室充盈最大速度(A)、E/A比值、左心室收縮末內徑(left ventricular internal dimensions at end systole, LVIDS)、左心室舒張末內徑(left ventricular internal dimensions at end diastole, LVIDD)、左心室收縮末期容積(left ventricular end-systolic volume, LVESV)和左心室舒張末期容積(left ventricular end-diastolic volume, LVEDV)。

1.4.3 觀察心肌組織病理學形態(tài)及心肌細胞大小:采用HE(hematoxylin and eosin, HE)染色檢測并比較心肌細胞大小。 按實驗一中的方法給予大鼠麻醉及開胸,取出心肌組織,以多聚甲醛浸泡24 h,石蠟包埋,切片。根據HE染色試劑盒的說明書步驟要求對組織切片進行HE染色。最后在光學顯微鏡下進行組織病理學檢查。

1.4.4 檢測心肌細胞凋亡:取心肌組織,經PBS洗滌2次后,大鼠心肌細胞在結合緩沖液中重懸,依據Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒說明步驟,加入熒光探針FITC標記的Annexin V 5 μl和碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)10 μl,輕輕混勻,室溫避光下孵育10～20 min,進行染色。流式細胞儀檢測細胞凋亡。Annexin V-FITC為綠色熒光,PI為紅色熒光。

1.4.5 檢測心肌細胞凋亡蛋白的表達:采用蛋白免疫印跡(Western blot)法檢測凋亡蛋白的表達水平。RIPA細胞裂解液提取大鼠心肌組織細胞總蛋白。取變性的蛋白質樣品用SDS/PAGE(12%凝膠),電泳分離蛋白質,轉移到PVDF膜上,用5%脫脂奶粉封存。加入Bcl-2、Mcl-1、Bax、Caspase-3和Bak1一抗(均以1∶1 000稀釋)在4℃孵育過夜,然后與羊抗鼠二抗(以1∶10 000稀釋)在室溫孵育1 h。滴加ECL化學發(fā)光液于暗室顯影曝光,采用凝膠成像系統(tǒng)掃描和分析條帶。蛋白的相對表達量為蛋白條帶灰度值與內參GAPDH灰度值之比。

2 結果

2.1 實驗一結果

2.1.1 DCM大鼠模型的建立及一般資料比較:7只DCM大鼠造模成功,1只死亡,2只血糖未達標被排除實驗。10只對照組大鼠均存活。DCM組大鼠的血糖水平、HbAlc水平、收縮壓、舒張壓和尿量均明顯高于對照組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與對照組大鼠相比,DCM大鼠早期體重增加明顯(P<0.01),而成模時體重下降,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表1、2。

表1 2組大鼠一般資料比較

表2 2組大鼠體重情況比較 g,

2.1.2 2組大鼠心肌中miR-29a的表達:qRT-PCR結果所示,與對照組心肌中miR-29a的相對表達量(1.08±0.13)相比,DCM組大鼠心肌細胞中miR-29a的相對表達量顯著下調(0.39±0.06),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

2.2 實驗二結果

2.2.1 miR-29a對大鼠的心功能的影響:與對照組大鼠相比,DCM大鼠LVEF、LVFS、E/A比值和心率水平降低(P<0.05),LVIDS、LVIDD、LVESV和LVEDV明顯升高(P<0.05);心肌注射miR-29a mimics的DCM大鼠,LVEF和LVFS明顯提高(P<0.01),心率水平得到提高(P<0.05),而LVIDS、LVIDD、LVESV和LVEDV明顯降低(均為P<0.01);注射NC mimics的DCM大鼠沒有這些改變。見表3。

2.2.2 大鼠心肌組織形態(tài)學檢測:與對照組心肌細胞(14.09±0.45)μm相比,DCM組和DCM+NC組大鼠出現細胞肥大,分別為(21.81±1.84)μm和(23.26±1.05)μm,差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.01),細胞排列混亂,細胞核稀疏,細胞結構破壞等。而DCM+miR-29a mimics組心肌細胞這種病理變化較輕,細胞肥大也減輕(18.33±0.53)μm,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 大鼠橫截面心臟組織切片(HE染色×200);A 對照組;B DCM組; C DCM+NC組; D DCM+miR-29amimics組

2.2.3 miR-29a對DCM大鼠心肌細胞凋亡的影響:流式細胞術檢測顯示,DCM組心肌細胞凋亡率(19.93±2.71)%和DCM+NC組大鼠心肌細胞凋亡率(19.28±1.89)%較對照組心肌細胞凋亡率(2.39±0.34)%比較均明顯增加(P<0.01)。與DCM組相比,DCM+miR-29a mimics組大鼠心肌細胞凋亡率(13.02±0.58)%明顯降低(P<0.01)。

2.2.4 大鼠心肌細胞凋亡相關蛋白表達的檢測:Western blot檢測顯示,與對照組相比,DCM組和DCM+NC mimics組大鼠心肌細胞凋亡蛋白Bax、Caspase-3和Bak1表達水平增加,抗凋亡蛋白Bcl-2和Mcl-1表達水平降低;上調miR-29a抑制了DCM大鼠心肌細胞凋亡蛋白Bax、caspase-3和Bak1的表達水平,提高了Bcl-2和Mcl-1的表達水平。見表4。

表4 大鼠凋亡蛋白的相對表達量比較 n=4,

3 討論

糖尿病是一種進展性代謝紊亂疾病,其發(fā)病率和死亡率每年都在快速增長。DCM是糖尿病患者較嚴重的心血管并發(fā)癥,增加了DM患者的死亡率。其原因在于DCM在大多數患者中往往表現出較長的亞臨床期,早期不易被發(fā)現,很容易進展為心力衰竭,甚至死亡。目前為止,DCM的確切發(fā)病機制尚不清楚,進一步明確DCM的發(fā)病機制,早期對DCM進行診斷和干預其發(fā)病的進程,具有重要的臨床意義。

目前臨床上很難得到DCM患者的心肌組織和細胞,因此動物模型被廣泛應用于DCM機制的研究[12]。本研究采用高糖高脂飲食配合低劑量STZ腹腔注射,來成功建立DCM大鼠模型。與對照組大鼠相比,DCM大鼠逐漸出現萎靡不振、多飲、多食和多尿等糖尿病癥狀;體重表現為早期增長,實驗后期下降的特點;檢測血糖水平、HbA1c水平、收縮壓和舒張壓值均明顯升高。這些實驗結果與以往研究結果[13]一致。此外,DCM組大鼠的心功能較正常大鼠明顯下降。心肌組織HE染色結果也證實了DCM模型大鼠存在嚴重的DCM相關病理特征。

DCM的發(fā)病機制尚不明確,經典的發(fā)病機制包括了炎癥反應、心肌纖維化、心肌細胞凋亡、代謝紊亂、線粒體功能異常[14]和氧化應激[15,16]。研究表明心肌細胞凋亡是炎性反應和氧化應激的結果,心肌細胞凋亡所導致的心臟結構和功能異常是DCM發(fā)生的重要環(huán)節(jié)[17]。在細胞凋亡調控基因中,最受關注的是參與線粒體凋亡通路的Bcl-2家族和caspase家族。Bcl-2家族由控制線粒體完整性的抗凋亡因子和促凋亡因子組成,它們在抑制或促進促凋亡蛋白的作用中發(fā)揮重要作用。促凋亡蛋白Bax和Bak1通過在線粒體外膜上形成孔介導細胞色素釋放,而抗凋亡蛋白Bcl-2主要抑制Bax和Bak1的激活;caspase-3是caspase家族最重要的因子。 本研究中Western blot結果顯示,STZ誘導上調了大鼠心肌細胞凋亡蛋白Bax、caspase3和Bak1的表達水平,下調了抗凋亡蛋白Bcl-2和Mcl-1的表達水平;同時流式細胞術檢測顯示DCM大鼠的細胞總凋亡率明顯增加,說明DCM大鼠確實發(fā)生了心肌細胞凋亡,而這種心肌細的損傷是通過上調心肌細胞中Bax、caspase3和Bak1的表達水平及下調Bcl-2和Mcl-1的表達水平來實現的。

研究表明,miRNAs普遍存在于真核生物中,參與多種生物過程,包括細胞增殖、分化、轉移、凋亡、葡萄糖代謝、脂肪代謝等[18,19]。miRNAs通過與靶基因的3'-UTR區(qū)域結合來調控靶基因的表達,一種miRNA可能調控多個靶基因,同時一種靶基因可能又受多個miRNAs的調控,它們形成了非常復雜而龐大的的網絡系統(tǒng)。miR-29家族在血管內皮細胞、主動脈組織、心肌組織和心肌細胞、心臟代謝等多個部位均具有調節(jié)作用[20]。MicroRNA-29a在2型糖尿病中與IGF1結合調控心肌微血管內皮細胞增殖和遷移[21];MiR-29在心肌梗死心肌重塑中發(fā)揮重要作用[22];Sun等[23]研究表明,miR-29通過外泌體以TRAF-3依賴的方式促進循環(huán)單核細胞和巨噬細胞的招募和激活,促進炎癥和糖尿病的發(fā)生。目前關于疾病針對RNA靶點的干預治療是新的熱點。

為了闡明miR-29a與DCM發(fā)病的可能關系,本研究實驗一首先分析了miR-29a在大鼠心肌組織中的表達水平的變化情況。實驗一結果顯示,DCM大鼠心肌組織中miR-29a的表達水平顯著下調。那么miR-29a表達下調提示,miR-29a過表達可能成為一種潛在的DCM治療方法。 因此,本研究實驗二探討了miR-29a模擬劑對DCM大鼠的可能治療作用。實驗結果提示miR-29a對大鼠心肌的保護作用可能是通過影響心肌細胞凋亡相關因子來實現的。DCM大鼠心肌組織注射攜帶miR-29a mimics慢病毒后,流式細胞術結果顯示大鼠的心肌細胞凋亡得到了緩解。進一步Western blot結果表明,miR-29a的上調明顯抑制了凋亡相關蛋白Bax、caspase3和Bakl表達水平的增加,并上調了抗凋亡蛋白Bcl-2和Mcl-1的表達水平。miR-29a可能通過影響多個細胞凋亡相關因子參與了DCM的發(fā)病機制;同時,HE染色表明,miR-29a模擬劑治療可以減輕DCM大鼠的心肌細胞肥大情況,緩解心肌組織的相關病理特征。心臟超聲多普勒成像是檢測DCM的有效方法[24],LVEF、LVFS是評價心臟收縮功能的指標,E/A比值用來反映心臟舒張功能。同時本研究結果顯示,心肌注射攜帶miR-29a mimics慢病毒治療10周后,LVEF和LVFS得到了明顯提高,而LVIDS、LVIDD、LVESV和LVEDV明顯降低,說明 miR-29a模擬劑治療可以改善DCM大鼠的心功能,上調心肌細胞miR-29a的水平對DCM大鼠的心肌損傷具有保護作用。過表達miR-29a可以通過降低凋亡蛋白Bax、caspase3和Bakl的表達水平,并升高抗凋亡蛋白Bcl-2和Mcl-1的表達水平來緩解DCM大鼠的心肌細胞凋亡,從而改善其心臟功能。

綜述所述,DCM大鼠心肌細胞中miR-29a的表達水平降低,上調miR-29a可能通過調控心肌細胞凋亡相關因子減輕DCM大鼠心肌細胞凋亡水平,從而起到改善心功能的作用。本研究可能為DCM的治療提供新的靶點。