許雅麗 李篤妙 吳強(qiáng) 林俊山 （福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒外科，臺江 350005）

神經(jīng)母細(xì)胞瘤（neuroblastoma，NB）是兒童中最常見的惡性腫瘤［1］。免疫抑制在腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展中起著重要作用，NB的發(fā)生會影響機(jī)體T淋巴細(xì)胞亞群并抑制細(xì)胞免疫，而免疫抑制與癌癥的免疫逃逸機(jī)制有關(guān)，使腫瘤細(xì)胞可以免受機(jī)體細(xì)胞免疫的清除，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞浸潤［2］。泛素特異性蛋白酶22（ubiquitin-specific protease 22，USP22）可以催化組蛋白H2A和H2B的去泛素化，是調(diào)控細(xì)胞周期的關(guān)鍵蛋白。研究顯示沉默USP22會抑制NB細(xì)胞的增殖［3］。新近研究顯示USP22的抑制以免疫系統(tǒng)依賴性的方式抑制肝癌的生長，增加了腫瘤的免疫原性和腫瘤浸潤的淋巴細(xì)胞，并且可以提高鉑類化合物的治療效果［4］。但USP22對NB轉(zhuǎn)移和免疫抑制的影響尚不清楚。微小RNA（micro-RNA，miRNA）是一種內(nèi)源性的、長度為22～25個核苷酸長度的RNA，雖然miRNA不具備編碼能力，但是miRNA可靶向結(jié)合信使RNA（message RNA，mRNA）的3'端的非翻譯區(qū)域（3'-untranslated region，3'-UTR）使其降解［5］。miR-588是近年來發(fā)現(xiàn)的與NB腫瘤有關(guān)的miRNA，最新研究顯示miR-588在乳腺癌組織中下調(diào)，并且與不良預(yù)后有關(guān)［6］。也有研究發(fā)現(xiàn)miR-588可以抑制NB細(xì)胞的遷移和侵襲，但其在NB中的作用仍不清楚［7］。本文主要分析miR-588通過靶向調(diào)控USP22的表達(dá)對NB細(xì)胞增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移的影響，并初步探究作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人正常神經(jīng)細(xì)胞視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞株、NB細(xì)胞系SK-N-SH細(xì)胞株（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海細(xì)胞庫）；BALB/c裸鼠（4～5周齡，SPF級，上海斯萊克實驗動物中心，中國）；DMEM培養(yǎng)基、谷氨酰胺培養(yǎng)基、血清和抗體，LipofectamineTM2000（Invitrogen公司，美國）；細(xì)胞培養(yǎng)箱、化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒（Thermo Fisher公司，美國）；miR-588類似物（mimic）、USP22過表達(dá)質(zhì)粒及相應(yīng)的陰性對照（negative control，NC）（GenePharma公司，中國）；pMIR-REPORT 雙熒光素酶試劑盒、1000 Assay System檢測系統(tǒng)（Thermo Fisher公司，美國）；MiScript試劑盒（GmbH公司，德國）；PrimeScript-RT和SYBR Premix Ex Taq試劑盒（TaKaRa公司，日本）；anti-USP22和山羊抗兔IgG H&L（HRP）二抗（Abcam公司，美國）；PVDF膜（Bio-Rad公司，美國）；CCK-8試劑盒（Beyotime研究所，中國）；Transwell小室（Becton Dickinson公司，美國）；ELISA試劑盒（碧云天公司，中國）；光學(xué)顯微鏡（奧林巴斯公司，日本）。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析雙熒光素酶報告驗證實驗 根據(jù)工具網(wǎng)站Starbase預(yù)測miR-588與USP22 mRNA 3'-UTR區(qū)域的結(jié)合位點，根據(jù)結(jié)合部分的序列分別構(gòu)建野生型（wt-）和突變型的（mut-）的USP22 mRNA，將USP22 mRNA序列和mimic或NC序列克隆到pMIR-REPORT熒光素酶載體中。使用Lipofectamine 2000將細(xì)胞用兩種載體轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。使用雙熒光素酶報告基因1000 Assay System分析系統(tǒng)評估熒光素酶活性。當(dāng)miR-588與USP22結(jié)合后，熒光素酶活性會降低。

1.2.2 細(xì)胞分組和轉(zhuǎn)染 將DMEM培養(yǎng)基中處于對數(shù)生長期的SK-N-SH細(xì)胞分為4組：NC組、miR-588組、miR-588+USP22組和USP22組。miR-588組和USP22組通過Lipofectamine 2000分別轉(zhuǎn)染50 nmol/L miR-588 mimic和USP22質(zhì)粒來過表達(dá)miR-588和USP22。miR-588+USP22組同時轉(zhuǎn)染上述兩種質(zhì)粒。NC組轉(zhuǎn)染等量的NC空載質(zhì)粒作為對照組，轉(zhuǎn)染條件為37 ℃、5%CO2、48 h。

1.2.3 檢測指標(biāo)和方法

1.2.3.1 RT-qPCR檢測miR-588和USP22 mRNA 通過TRIzol獲得細(xì)胞中總RNA，對于miR-588，通過miScript試劑盒合成互補(bǔ)DNA（7 ℃ 60 min，95 ℃5 min，4 ℃下保存），利用MiScript SYBR-Green PCR試劑盒檢測互補(bǔ)DNA（95 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃30 s，40個循環(huán)），U6用作miR-588內(nèi)源參照。對于USP22 mRNA，分別通過PrimeScript-RT和SYBR Premix Ex Taq試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄（37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s）和qPCR（95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，40個循環(huán)，65 ℃ 45 s），GAPDH用作內(nèi)源參照。通過比較循環(huán)閾值評估m(xù)iR-588和USP22 mRNA相對于U6和GAPDH的表達(dá)水平。

1.2.3.2 Western blot檢測蛋白 將細(xì)胞研磨萃取總蛋白，蛋白濃度通過BCA試劑盒測量。使用10%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳（PAGE）（80～120 V，90 min）分離40 μg的總蛋白。在100 mV恒定電壓下與PVDF膜進(jìn)行濕轉(zhuǎn)移。在5%牛血清白蛋白中室溫孵育1 h，將1∶500稀釋的anti-USP22、antiβ-catenin添加到PVDF膜中，在4 ℃下孵育8 h。洗滌后在室溫下添加二抗孵育2 h，然后加入化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯影，GAPDH用作內(nèi)參，用Image J軟件分析目標(biāo)條帶的灰度值。

1.2.3.3 CCK-8法檢測細(xì)胞活力 將1×104個細(xì)胞（100 μl）接種到96孔板中。培養(yǎng)48 h后，添加10 μl CCK-8，并在37 ℃下培養(yǎng)2 h，用酶標(biāo)儀測量450 nm處的吸光度（OD）。

1.2.4 劃痕愈合實驗檢測遷移 將培養(yǎng)接種于6孔板中的1×105個細(xì)胞使用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)至90%融合。使用200 μl移液器吸頭刮擦細(xì)胞。在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)48 h。通過細(xì)胞的圖像使用光學(xué)顯微鏡觀察并拍照，計算劃痕前緣遷移距離百分比。

1.2.5 Transwell檢測侵襲 將基質(zhì)膠和完全培養(yǎng)基分別添加到Transwell的上部和下部腔室中。將1×104個細(xì)胞添加到上室并培養(yǎng)48 h。48 h后，將滲透的細(xì)胞用20%甲醇固定并用0.1%結(jié)晶紫染色。計數(shù)進(jìn)入5個視野中每個視野底部室的細(xì)胞數(shù)平均值。

1.2.6 ELISA檢測腫瘤免疫指標(biāo) 收集細(xì)胞培養(yǎng)基，離心后取出細(xì)胞上清液，根據(jù)說明書分別加入抗體和顯色劑，通過酶標(biāo)儀檢測450 nm處的OD，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測的OD值計算免疫指標(biāo)TNF-α和可溶性白細(xì)胞介素-2受體（soluble interleukin-2 receptor，sIL-2R）濃度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 統(tǒng)計分析使用SPSS19軟件。數(shù)據(jù)以±s表示，計數(shù)資料使用（%）表示。進(jìn)行單因素方差分析，兩兩比較通過SNK-q檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-588在NB中的表達(dá)特點 為初步分析miR-588在NB中的表達(dá)特點，通過RT-qPCR檢測人正常神經(jīng)細(xì)胞視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞株和NB細(xì)胞SK-N-SH中miR-588水平，結(jié)果顯示miR-588在兩組細(xì)胞中的表達(dá)量分別為2.51±0.38和0.85±0.20，SKN-SH中miR-588水平明顯降低（P＜0.05）。

2.2 miR-588與USP22 mRNA 3'-UTR區(qū)域靶向結(jié)合 通過網(wǎng)站預(yù)測發(fā)現(xiàn)了miR-588與USP22 mRNA 3'-UTR區(qū)域之間存在多個連續(xù)的堿基互補(bǔ)配對位點，見圖1。利用SK-N-SH細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-588 mimic構(gòu)建miR-588過表達(dá)的細(xì)胞結(jié)果顯示miR-588的水平升高了（7.56±0.72）倍，提示轉(zhuǎn)染成功。然后通過雙熒光霉素報告驗證了在SK-N-SH細(xì)胞中，miR-588與USP22 mRNA 3'-UTR區(qū)域靶向結(jié)合，見圖2。

圖1 miR-588與USP22 mRNA的3'-UTR區(qū)域的結(jié)合位點示意圖Fig.1 Schematic diagram of binding site of miR-588 and 3'-UTR region of USP22 mRNA

圖2 雙熒光霉素報告驗證miR-588與USP22 mRNA的3'-UTR的靶向關(guān)系Fig.2 Dual fluorescein report verifies that miR-588 can target 3'-UTR of USP22 mRNA

2.3 miR-588靶向抑制USP22表達(dá) 各組USP22 mRNA和蛋白的水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其中miR-588組USP22 mRNA和蛋白水平顯著低于NC組但USP22組顯著高于NC組（P＜0.05），miR-588+USP22組USP22 mRNA和蛋白水平顯著高于miR-588組但低于USP22組（P＜0.05），見圖3、圖4。

圖3 RT-qPCR檢測各組USP22 mRNA表達(dá)水平比較Fig.3 Comparison of USP22 mRNA expression level in each group detected by RT-qPCR

圖4 Western blot檢測各組細(xì)胞中USP22蛋白水平Fig.4 Western blot detection of USP22 protein levels in cells of each group

2.4 miR-588通過靶向USP22對細(xì)胞活力的影響在培養(yǎng)48 h后，各組的OD值比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），與NC組（0.68±0.07）比較，miR-588組OD值（0.58±0.06）顯著降低，USP22組OD值（0.81±0.08）顯著升高，miR-588+USP22組的OD值（0.71±0.07）高于miR-588組而低于USP22組。

2.5 miR-588通過靶向USP22對細(xì)胞遷移能力的影響 各組的遷移能力比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其中miR-588組的遷移能力（22.07%±2.11%）顯著低于NC組（43.42%±2.75%），而USP22組（83.45%±4.09%）顯著高于NC組（P＜0.05），miR-588+USP22組的遷移能力（51.06%±3.67%）顯著高于miR-588組而低于USP22組（P＜0.05），見圖5。

圖5 劃痕愈合實驗檢測miR-588通過靶向USP22對細(xì)胞遷移能力的影響Fig.5 Scratch healing experiment to detect effect of miR-588 on cell migration by targeting USP22

2.6 miR-588通過靶向USP22對細(xì)胞侵襲能力的影響 各組的侵襲能力比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其中miR-588組的侵襲能力（61.35%±3.06%）顯著低于NC組（123.64%±4.33%）而USP22組（238.02±7.71）顯著高于NC組（P＜0.05），miR-588+USP22組的侵襲能力（131.78%±5.58%）顯著高于miR-588組而低于USP22組（P＜0.05），圖6。

圖6 Transwell實驗檢測miR-588通過靶向USP22對細(xì)胞侵襲能力的影響Fig.6 Transwell experiment to detect effect of miR-588 on cell invasion by targeting USP22

2.7 miR-588通過靶向USP22對免疫抑制的影響各組的免疫抑制水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其中miR-588組TNF-α和sIL-2R水平顯著高于NC組，而USP22組顯著低于NC組（P＜0.05），miR-588+USP22組的TNF-α和sIL-2R水平顯著低于miR-588組而高于USP22組，見圖7。

圖7 miR-588通過靶向USP22對細(xì)胞培養(yǎng)基中TNF-α、sIL-2R水平的影響Fig.7 Effect of miR-588 on levels of TNF-α and sIL-2R in cell culture medium by targeting USP22

3 討論

由于NB患者年齡較小，治療方案受到較大的限制。BC占所有腫瘤的6%～10%，高危NB的治愈率低于30%，因此探究NB的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制具有重要意義［8］。

USP22是一種去泛素化酶，可通過催化組蛋白H2A和H2B去泛素化改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)，USP22對于通過細(xì)胞周期G1期的進(jìn)展至關(guān)重要［9］。USP22可作為原癌基因，通過誘導(dǎo)細(xì)胞的過度增殖誘導(dǎo)膀胱癌發(fā)生［10］。在胃癌中，USP22可以通過激活c-Myc/NAMPT/SIRT1通路使胃癌細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)移能力［11］。在本研究中，實驗結(jié)果顯示過表達(dá)USP22不但可以誘導(dǎo)NB細(xì)胞增殖，還可以顯著提高NB細(xì)胞遷移和侵襲能力。國內(nèi)臨床研究發(fā)現(xiàn)USP22的水平與NB患者的性別、年齡、腫瘤、病理分型和大小無關(guān)，但是出現(xiàn)淋巴轉(zhuǎn)移的腫瘤組織中USP22水平顯著高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移的組織［12］。一項最新的研究也顯示與USP22陰性腫瘤相比，表達(dá)USP22的NB患者預(yù)后較差，并且多元Cox回歸分析表明USP22蛋白水平是生存的預(yù)測因素［13］。本研究結(jié)果表明USP22的過表達(dá)不但會促進(jìn)NB細(xì)胞增殖，還會提高細(xì)胞遷移和侵襲能力，提示高USP22水平與NB轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良有關(guān)。

研究顯示miRNA可以通過堿基配對的方式與mRNA的3'-UTR區(qū)域結(jié)合從而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)水平，參與NB的發(fā)生和發(fā)展［14］。miRNA在NB轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，如miR-15a-5p、miR-15b-5p、miR-16-5p等［15］。國內(nèi)有研究顯示miR-588參與調(diào)控NB的遷移和侵襲［16］。此外，miR-588下調(diào)具有促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞進(jìn)展的作用［17］。本研究檢測了人正常神經(jīng)細(xì)胞視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞株和NB細(xì)胞SKN-SH中miR-588的水平，結(jié)果顯示NB細(xì)胞中miR-588的水平降低，提示miR-588在NB中也可能發(fā)揮抑癌作用。此外，本研究還通過雙熒光霉素報告驗證了在SK-N-SH細(xì)胞中miR-588可以靶向抑制USP22的表達(dá)。進(jìn)一步的研究結(jié)果顯示過表達(dá)miR-588會抑制NB細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，而在過表達(dá)miR-588的基礎(chǔ)上過表達(dá)USP22可以逆轉(zhuǎn)miR-588的抑癌作用。已有研究發(fā)現(xiàn)在鼻咽癌中，USP22的表達(dá)也會受到miR-588的靶向調(diào)控［18］。這提示miR-588可以通過靶向結(jié)合USP22的mRNA的3'-UTR區(qū)域使USP22 mRNA降解，從而使USP22蛋白水平降低，進(jìn)而誘導(dǎo)NB細(xì)胞遷移和侵襲能力的降低。此外，最新研究顯示USP22也具有免疫抑制能力，研究顯示敲除USP22可以通過T細(xì)胞依賴的方式緩解胰腺癌腫瘤免疫水平，從而減少腫瘤細(xì)胞浸潤并抑制胰腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移［19］。本次研究結(jié)果也顯示miR-588組TNF-α和sIL-2R水平顯著高于NC組而USP22組顯著低于NC組，miR-588+USP22組TNF-α和sIL-2R水平顯著高于miR-588組而低于USP22組。這提示USP22可以通過減少腫瘤殺傷相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)誘導(dǎo)免疫抑制，而miR-588可以通過靶向抑制USP的水平使TNF-α和sIL-2R水平升高，從而提高腫瘤免疫原性，緩解免疫抑制。

綜上所述，本次研究通過細(xì)胞實驗發(fā)現(xiàn)了miR-588可靶向抑制USP22表達(dá)誘導(dǎo)TNF-α和sIL-2R分泌，從而緩解免疫抑制，進(jìn)而抑制NB的增殖和轉(zhuǎn)移。關(guān)于miR-588通過USP22調(diào)控NB的作用仍需要體內(nèi)實驗驗證，并且miR-588在NB免疫抑制中的作用值得進(jìn)一步研究。