盧國鵬 唐海鵬 王夢川 （南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院普通外科，廣州 510282）

樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）是體內(nèi)功能最強(qiáng)的專職抗原遞呈細(xì)胞，具有激活初始T細(xì)胞的作用［1］。經(jīng)典抗原遞呈理論認(rèn)為DC可通過直接遞呈（direct-presentation）和交叉遞呈（cross-presentation）的方式遞呈腫瘤抗原［2］。近年學(xué)者發(fā)現(xiàn)了一種新的抗原遞呈方式，即腫瘤細(xì)胞釋放自身抗原肽-MHCⅠ類分子復(fù)合物，該復(fù)合物與DC結(jié)合后無需經(jīng)過DC加工處理便可直接遞呈給CD8+T細(xì)胞，從而發(fā)揮免疫效應(yīng)。這種供體細(xì)胞完整的抗原肽-MHCⅠ類分子復(fù)合物結(jié)合至受體細(xì)胞包膜表面的現(xiàn)象稱為cross-dressing［3］。與DC直接遞呈和交叉遞呈方式比較顯示（表1），腫瘤細(xì)胞釋放的抗原肽-MHCⅠ類分子復(fù)合物與DC結(jié)合后，無須經(jīng)過DC再加工便可直接遞呈給CD8+T細(xì)胞，因此，cross-dressing被認(rèn)為可能是一種更高效的抗原遞呈方式［4］。cross-dressing在腫瘤免疫方面的研究尚處于早期階段，包括模型探索和免疫應(yīng)答評估、DC表型和作用方式以及cross-dressing與交叉遞呈的關(guān)系等，本文對上述問題進(jìn)行綜述。

表1 DC遞呈腫瘤抗原的三種方式比較Tab.1 Comparison of three ways in tumor antigen presentation by DC

1 cross-dressing模型選擇和免疫效應(yīng)

相比于移植領(lǐng)域的如火如荼，cross-dressing在腫瘤領(lǐng)域的發(fā)展相對緩慢，主要原因?yàn)閏ross-dressing研究的前提是區(qū)分供體（或腫瘤細(xì)胞）和受體（或抗原遞呈細(xì)胞，如DC）的MHCⅠ類分子，這在移植領(lǐng)域具有天然優(yōu)勢，由于供體和受體細(xì)胞的MHCⅠ類分子不同，兩者可很好地被標(biāo)記和區(qū)分，而在腫瘤領(lǐng)域則比較困難，因?yàn)槟[瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的MHCⅠ類分子相同，正常情況下無法直接標(biāo)記和區(qū)分，從而不易追蹤抗原遞呈過程［5-6］。為解決這一問題，學(xué)者們采用不同方式建立模型，其核心思路還是借助移植免疫原理，利用腫瘤細(xì)胞和DC MHCⅠ類分子差異進(jìn)行標(biāo)記和研究（表2）。

表2 cross-dressing研究的抗原遞呈模型Tab.2 Antigen presentation models of cross-dressing

1.1 小鼠腫瘤細(xì)胞抗原遞呈模型 ZHANG等［7］向小鼠肺腺癌CMT.64細(xì)胞轉(zhuǎn)染帶有綠色熒光標(biāo)記的GFP-H2Kb載體，并將牛痘病毒表位微基因VVVSV-Np52-59轉(zhuǎn)染至CMT.64細(xì)胞，從而獲得CMT.TAP1，2/Kb細(xì)胞株，該細(xì)胞的特點(diǎn)是攜帶抗原肽VVVSV-Np52-59/H2Kb復(fù)合物，且在熒光顯微鏡下帶有綠色熒光。將GFP-tagged-CMT.TAP1，2/Kb細(xì)胞與C57BL/6（H2Kb+）小鼠骨髓DC共培養(yǎng)后，采用多通道熒光顯微鏡觀察到帶有GFP綠色熒光的DC，說明DC獲得了CMT.TAP1，2/Kb細(xì)胞H2Kb分子，即發(fā)生了cross-dressing，為進(jìn)一步評估cross-dressing引起的免疫應(yīng)答，將BALB/c小鼠骨髓DC（H2Kd+）與CMT.TAP1，2/Kb細(xì)胞共培養(yǎng)以獲得H2Kb+DC，發(fā)現(xiàn)這些DC可激活C57BL/6小鼠VV-VSV-Np52-59抗原特異性H2Kb+細(xì)胞毒性T細(xì)胞（cytotoxic T lymphocytes，CTLs），說明發(fā)生MHC cross-dressing的DC具有激活CTLs的能力。ZIEGLER等［8］發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象，首先構(gòu)建了攜帶雞卵清白蛋白（ovalbumin，OVA）抗原的腸癌CT26細(xì)胞（BALB/c小鼠來源，H2Kd+）和腸癌CMT細(xì)胞（C57BL/6小鼠來源，H2Kb+），兩種癌細(xì)胞的OVA抗原易被OT-I小鼠CD8+T細(xì)胞（H2Kb+）識別和應(yīng)答，將C57BL/6小鼠DC（H2Kb+）與OVA-CT26（H2Kd+）細(xì)胞在這一模型中共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)了H2Kd+DC，說明發(fā)生了cross-dressing；與此類似，將BALB/c DC（H2Kd+）與OVA-CMT（H2Kb+）細(xì)胞共培養(yǎng)后，這些DC攜帶OVA/H2Kb復(fù)合物，且可引起OT-I CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答。

將BALB/c小鼠的骨髓DC（H2Kd+）與攜帶OVA抗原肽SIINFEKL的小鼠T淋巴瘤EG7細(xì)胞（H2Kb+）共培養(yǎng)可獲得H2Kb+DC，將這些DC作用于OT-I小鼠CD8+T細(xì)胞后可引起CD8+T細(xì)胞體外擴(kuò)增，為進(jìn)一步研究體內(nèi)cross-dressing情況，采用攜帶抗原肽SIINFEKL的EL4細(xì)胞（H2Kb+）致敏H2Kbm1轉(zhuǎn)基因小鼠（H2Kbm1分子可攜帶抗原肽SIINFEKL，但SIINFEKL/H2Kbm1分子復(fù)合物無法被OT-I CD8+T細(xì)胞識別），再收集H2Kbm小鼠CD8α+DCs，發(fā)現(xiàn)CD8α+DCs可引起OT I小鼠CD8+T細(xì)胞增殖，說明體內(nèi)H2Kbm1DC通過cross-dressing從EL4細(xì)胞獲得了SIINFEKL/H2Kb復(fù)合物，進(jìn)而引發(fā)OT-I CD8+T細(xì)胞應(yīng)答［9］。

上述實(shí)驗(yàn)說明DC通過cross-dressing可激活初始CD8+T細(xì)胞和CTLs，但并未提示cross-dressing能否激活CD8+記憶T細(xì)胞。LI等［12］回答了這一問題，發(fā)現(xiàn)CD8α+/CD103+DC可通過cross-dressing激活初始CD8+T細(xì)胞和CD8+記憶T細(xì)胞，首先利用二硫鍵將p5Y抗原肽與H2Kb分子連接構(gòu)成單鏈三聚體（single chain trimer，SCT），p5Y與OVA抗原肽SIINYEKL高度相近并可引起OT-I CD8+T細(xì)胞應(yīng)答，一旦二硫鍵被破壞，由于p5Y與H2Kb分子的親和力極弱，兩者不能再次形成復(fù)合物。構(gòu)建該SCT的意義在于如p5Y引起OT-I CD8+T細(xì)胞應(yīng)答，必然是由SCT提供的H2Kb分子而非細(xì)胞自身H2Kb分子。SCT穩(wěn)定轉(zhuǎn)染小鼠胚胎成纖維母細(xì)胞（embryonic fifibroblasts，MEFs，缺乏H2Kb、H2Kd和β2m分子，故稱3KO MEFs）建立3KO p5Y/Kb SCT MEFs細(xì)胞系，可為DC提供p5Y/H2Kb復(fù)合物。在此基礎(chǔ)上，向C57BL/6小鼠和Batf3-/-小鼠（Batf3基因是調(diào)控CD8α+/CD103+DC成熟的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，因此，Batf3-/-小鼠不含CD8α+/CD103+DC）注射OT-I CD8+T細(xì)胞和3KO p5Y/Kb SCT MEFs，發(fā)現(xiàn)C57BL/6小鼠引流淋巴結(jié)可檢測到擴(kuò)增的OT-I CD8+T細(xì)胞，而Batf3-/-小鼠則無OT-I CD8+T細(xì)胞擴(kuò)增，說明：①由于p5Y不與DC自身H2Kb結(jié)合且3KO MEFs無H2Kb分子，因此能引起OT-I CD8+T應(yīng)答的必然是SCT本身的p5Y/H2Kb復(fù)合物；②C57BL/6小鼠體內(nèi)OT-I CD8+T細(xì)胞擴(kuò)增而Batf3-/-小鼠體內(nèi)注射的OT-I CD8+T細(xì)胞無擴(kuò)增，說明p5Y/H2Kb復(fù)合物通過與CD8α+/CD103+DC發(fā)生cross-dressing激活初始OT-I CD8+T細(xì)胞。為進(jìn)一步探討cross-dressing能否激活CD8+記憶T細(xì)胞，用攜帶OVA抗原的脾細(xì)胞刺激初始OT-I CD8+T細(xì)胞，再將這些OT-I CD8+T細(xì)胞注入C57BL/6小鼠體內(nèi)，30 d后將3KO p5Y/Kb SCT MEFs注射入小鼠體內(nèi)，亦可引起OT-I CD8+T細(xì)胞擴(kuò)增，說明CD8α+/CD103+DC發(fā)生cross-dressing可激活CD8+記憶T細(xì)胞。

1.2 人腫瘤細(xì)胞抗原遞呈模型 上述cross-dressing研究是基于小鼠的抗原遞呈模型，人抗原遞呈模型上同樣有類似發(fā)現(xiàn)。BONACCORSI等［10］從1例HLA-A1+轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者提取原代細(xì)胞培養(yǎng)，獲得的黑色素瘤細(xì)胞表達(dá)HLA-A1；同時從HLA-A1+健康人群外周血提取B淋巴細(xì)胞并采用EB病毒轉(zhuǎn)化以建立EB病毒永生化B細(xì)胞系（EBV transformed B cells，LCLs），獲得的LCLs同樣表達(dá)HLA-A1。將上述兩種HLA-A1+細(xì)胞與HLA-A1-患者漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞（plasmacytoid dendritic cells，pDC）共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)這些pDC亦攜帶HLA-A1，說明發(fā)生了crossdressing。為進(jìn)一步評估cross-dressing產(chǎn)生的免疫應(yīng)答水平，制備了兩種EB病毒特異性CD8+T細(xì)胞克隆，其中一種CD8+T細(xì)胞可限制性識別由HLA-A2分子遞呈的潛伏性膜蛋白2（latent membrane protein 2，LMP2）（HLA-A2+/LMP2426-434），而另一種CD8+T細(xì)胞可限制性識別由HLA-B8分子遞呈的EB病毒核抗原3（epstein Barr nuclear antigen 3，EBNA3A）（HLA-B8+/EBNA3A325-333）。從HLA-A2-或HLA-B8-健康人群提取pDC，并將這些pDC分別與HLAA2+LCLs、HLA-B8+LCLs共培養(yǎng)，分選共培養(yǎng)的pDC并體外分別刺激上述CD8+T細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)這些pDC可激活HLA-A2+/LMP2426-434和HLA-B8+/EBNA3A325-333特異性CD8+T細(xì)胞。另一項(xiàng)黑色素瘤細(xì)胞cross-dressing研究中，BOSSI等［11］采用了一種特殊的黑色素瘤細(xì)胞Mel624，其特點(diǎn)是細(xì)胞自身HLA-A2分子攜帶腫瘤相關(guān)抗原MART-126-35（HLA-A2+/MART-126-35），從HLA-A2-人群外周血提取DC并將其與凋亡的Mel624細(xì)胞共培養(yǎng)，觀察到HLA-A2+DC，說明DC發(fā)生了cross-dressing，且HLA-A2+DC可引起MART-126-35特異性HLA-A2+CT8+T細(xì)胞擴(kuò)增和IFN-γ分泌。

2 發(fā)生cross-dressing的DC分子表型和途徑

以上研究說明DC可通過cross-dressing遞呈腫瘤抗原并引發(fā)CD8+T細(xì)胞應(yīng)答，但并不代表crossdressing普遍存在于所有DC。如MOHAPATRA等［9］和LI等［12］均發(fā)現(xiàn)CD8α+DC是發(fā)生cross-dressing的主要DC類型。研究認(rèn)為，相比于脾臟來源DC，骨髓來源DC更易發(fā)生cross-dressing［13］。DC成熟程度亦對cross-dressing產(chǎn)生影響，未發(fā)育成熟的DC（CD80low/CD86low）更易發(fā)生cross-dressing，且crossdressing能促進(jìn)DC進(jìn)一步成熟，而已成熟的DC內(nèi)吞作用更強(qiáng)，被DC捕獲的抗原肽更易被內(nèi)吞進(jìn)行交叉遞呈［14］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，DC表面的膜蛋白表達(dá)情況與cross-dressing有關(guān)，如C型凝集素結(jié)構(gòu)域家族9成員A（C-type lectin domain containing 9A，CLEC9A）、髓樣細(xì)胞表達(dá)的觸發(fā)受體4、T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白3和淋巴細(xì)胞功能相關(guān)分子-1等表達(dá)更利于DC捕獲腫瘤細(xì)胞抗原肽-MHCⅠ類分子復(fù)合物［15-18］。

除與表型相關(guān)，DC能否發(fā)生cross-dressing還與腫瘤細(xì)胞接觸方式有關(guān)，最常見的兩種方式是胞啃途徑和外泌體途徑［19］。胞啃（trogocytosis）一詞來源于古希臘語“trogo”（意為“啃”），指細(xì)胞與細(xì)胞直接接觸后，一個細(xì)胞（通常是壞死或凋亡細(xì)胞）的部分細(xì)胞膜連同包膜上的各類蛋白附著于另一個細(xì)胞表面。從定義不難看出，如癌細(xì)胞部分包膜包含抗原肽-MHCⅠ類分子復(fù)合物且被DC捕獲，則發(fā)生了cross-dressing；或由于抗原肽-MHCⅠ類分子復(fù)合物普遍存在于細(xì)胞膜表面，cross-dressing僅是胞啃途徑的伴隨過程［20］。有學(xué)者認(rèn)為漿細(xì)胞樣DC（plasmacytoid DC，pDC）易通過胞啃途徑發(fā)生cross-dressing，也有觀點(diǎn)認(rèn)為傳統(tǒng)DC（conventional DC，cDC）更易從癌細(xì)胞獲得抗原肽-MHCⅠ類分子復(fù)合物，上述結(jié)論不同可能與腫瘤類型不同有關(guān)［21］。

胞啃途徑強(qiáng)調(diào)腫瘤細(xì)胞與DC的“直接接觸”，而有些癌細(xì)胞無須與DC接觸，通過分泌攜帶抗原肽-MHCⅠ類分子復(fù)合物的外泌體亦可發(fā)生crossdressing，即外泌體途徑［22］。這些外泌體被DC捕獲并附著于DC表面，由外泌體提供抗原肽-MHCⅠ類分子復(fù)合物，由DC提供共刺激分子（如CD80和CD86）共同激活T細(xì)胞［23］。DC并非可捕獲任意外泌體，而需要外泌體表達(dá)特定配體（如磷脂酰絲氨酸、CD11a、補(bǔ)體C3衍生物等），這些配體能夠與DC表面對應(yīng)受體結(jié)合以促發(fā)cross-dressing［24］。為區(qū)分胞啃途徑和外泌體途徑，通常采用Transwell小室將腫瘤細(xì)胞和DC共培養(yǎng)，如發(fā)生cross-dressing的DC比例無明顯下降，說明癌細(xì)胞分泌的外泌體通過Transwell微孔并被DC捕獲，即以外泌體途徑為主，反之則以胞啃途徑為主［22］。

除上述兩種常見途徑外，亦有研究證實(shí)腫瘤細(xì)胞通過向微環(huán)境釋放大量“微管”（tunneling nanotubes）輸送抗原肽-MHCⅠ類分子復(fù)合物，即為“微管”途徑［25］。這些途徑并不是無序、隨機(jī)的，而是與DC分子表型和腫瘤類型有關(guān)。

3 cross-dressing與交叉遞呈的關(guān)系

cross-dressing和交叉遞呈均可激活抗原特異性CD8+T細(xì)胞，對某一種DC而言，是否可同時發(fā)生cross-dressing和交叉遞呈？哪一種抗原遞呈方式占主導(dǎo)地位？SQUADRI等［26］詳細(xì)探討了該問題，為H2Kb+DC構(gòu)建了胞外囊泡內(nèi)吞受體（DC-extracellular vesicle EV-internalizing receptor，DC-EVIR），其優(yōu)勢在于更易捕捉表達(dá)人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor-2，HER2）的細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）。為明確DC-EVIR主要通過cross-dressing還是交叉遞呈途徑遞呈腫瘤抗原，運(yùn)用CRISPR-Cas9技術(shù)敲除了MC38腸癌細(xì)胞H2Kb分子或B2m分子（該腫瘤細(xì)胞特點(diǎn)為HER2過表達(dá)，且攜帶OVA抗原），從而獲得H2KbKO MC38-HER2/OVA和B2mKO MC38-HER2/OVA細(xì)胞株。這兩種細(xì)胞株由于MHCⅠ類分子表達(dá)缺陷，分泌的EVs（H2KbKO EV-HER2/OVA和B2mKO EV-HER2/OVA）不含正常OVA/H2Kb復(fù)合物。當(dāng)H2KbKO EV-HER2/OVA和B2mKO EV-HER2/OVA被DC-EVIR捕獲后，DC-EVIR并不能刺激OT-I CD8+T細(xì)胞增殖，說明H2Kb+DC并未通過交叉遞呈途徑將OVA抗原遞呈給CD8+T細(xì)胞。為進(jìn)一步證實(shí)DC-EVIR通過cross-dressing途徑遞呈EV-HER2/OVA，從B2mKO小鼠提取DC并制備了DC-EVIR，發(fā)現(xiàn)這些DC即使自身缺乏正?？乖?H2Kb復(fù)合物，仍可通過獲得EV的OVA/H2Kb復(fù)合物刺激OT-I CD8+T細(xì)胞增殖，說明DC通過cross-dressing而不是交叉遞呈途徑遞呈OVA抗原。此外，另有兩項(xiàng)研究也得出類似結(jié)論，即發(fā)生cross-dressing的DC并不會同時通過交叉遞呈途徑遞呈抗原，說明cross-dressing可能是某些類型DC唯一的腫瘤抗原遞呈方式［8，11］。

4 問題和展望

雖然cross-dressing被某些學(xué)者認(rèn)為是一種更高效的抗原遞呈方式，但現(xiàn)有研究仍存在很多問題需要解決，如由于腫瘤細(xì)胞和DC的MHCⅠ類分子來源不同，不能完全模擬體內(nèi)環(huán)境的腫瘤抗原識別過程，需開發(fā)更先進(jìn)的抗原肽-MHCⅠ類分子復(fù)合物示蹤技術(shù)；對多數(shù)可發(fā)生cross-dressing的DC而言，其cross-dressing DC占比不高，如何提高這一比例值得研究；cross-dressing可引起致敏CD8+T細(xì)胞應(yīng)答，但不能引起初始CD8+T細(xì)胞應(yīng)答，如何提高其免疫激活效應(yīng)值得思考；DC通過cross-dressing遞呈的腫瘤抗原類型還需進(jìn)一步研究和鑒定［27］。雖然目前研究有限，但一旦能夠經(jīng)cross-dressing為DC裝載腫瘤新抗原，可能引起針對新抗原的腫瘤免疫應(yīng)答，從而真正實(shí)現(xiàn)腫瘤個體化和精準(zhǔn)化治療。