王宏播，郭靈怡，遲文雅，卞康晴，周文鉑，俞 媛,2 （.海軍軍醫(yī)大學藥學系藥劑學教研室, 上海 200433；2.生物安全防御教育部重點實驗室（海軍軍醫(yī)大學）, 上海 200433）

多形性膠質母細胞瘤（GBM）是惡性程度最高的腦腫瘤之一，呈強侵襲生長特點，患者中位生存期一般不超過15～17 個月，5 年生存率低于5%[1-3]。腫瘤最新機制研究聚焦高能量代謝特征，加州大學的研究人員揭示了癌癥基因擴增和表觀遺傳重塑依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）途徑，干預NAD+代謝成為癌癥精準治療的重要靶點[4]。腫瘤細胞通過生物合成上調(diào)來增加NAD+水平，對NAD+生物合成的限速酶——煙酰胺磷酸核糖轉移酶（NAMPT）非常敏感[5]。Kim 等[6]發(fā)現(xiàn)NAD+代謝在膠質瘤中過度活躍，GBM 患者腫瘤細胞中NAMPT基因表達水平異常升高。PROTAC 技術是一種化學誘導靶蛋白（POI）多聚泛素化，通過蛋白酶體通路降解POI 的藥物分子靶向新技術[7]。PROTAC分子由靶蛋白結合配體、連接鏈和E3 泛素連接酶配體三部分組成，能特異性結合靶蛋白，同時招募E3 泛素連接酶使POI 多聚泛素化，最終通過蛋白酶體系統(tǒng)降解。并且標記POI 促使蛋白降解后，可與POI 解離在細胞內(nèi)循環(huán)利用，起到亞化學計量催化的效果，減少藥物劑量從而減少體內(nèi)藥物暴露量[8]。合作課題組合成了一種新型NAMPT 酶抑制PROTAC 分子NPT-B2，小鼠卵巢癌藥效學研究表明NPT-B2 具有比FK866 更顯著的抑制腫瘤效果。但是NPT-B2 水溶性差，影響其適用性及吸收。納米藥物利用納米尺度效應，對藥物進行包載形成水分散的納米粒子系統(tǒng)，具有較好的穩(wěn)定性，降低藥物毒性，并由載體特性具有緩控釋能力。白蛋白（BSA）是一種生物安全性良好、可降解的納米載體材料，已經(jīng)被美國FDA 收錄可以用于人體[9]。此外，腫瘤組織對白蛋白具有攝取特性，白蛋白與腫瘤血管內(nèi)皮細胞表面的Gp60 受體結合，激活細胞內(nèi)小窩蛋白-1，引起細胞膜內(nèi)陷形成胞轉小泡，將白蛋白載體從內(nèi)皮細胞轉運進入腫瘤組織間。同時腫瘤在生長過程中分泌的富含半胱氨酸的酸性蛋白功能類似于白蛋白受體，可吸引粘附白蛋白，促進其從組織間隙轉運到腫瘤細胞內(nèi)，聚集于腫瘤細胞內(nèi)釋放藥物[10-11]。

本研究以牛血清白蛋白包載PROTAC 藥物NPT-B2，通過熱驅動法[12]制備白蛋白納米粒，提高其載藥量和包封率，改善了PROTAC 藥物的水溶性不佳的問題，提高其適用性；并考察載藥納米粒對膠質瘤細胞增殖活性及NAMPT 酶的抑制。

1 材料和方法

1.1 實驗儀器和材料

1.2 NPT-B2 對膠質瘤細胞的增值活性抑制及對NAMPT 的降解

U251細胞培養(yǎng)。以10% FBS 的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，當細胞達到80%匯合度時，進行傳代培養(yǎng)或凍存。恒溫CO2細胞培養(yǎng)箱條件均為37 ℃，5% CO2。

采用CCK8 法考察NPT-B2 對膠質瘤細胞的毒性作用。取對數(shù)生長期的U251細胞接種至96 孔板。設置不同濃度含NPT-B2 培養(yǎng)基作為實驗組，不加藥的培養(yǎng)基作為陰性對照組，PBS 作為空白對照組（n=3）。孵育72 h 后加入CCK8 試劑孵育1 h，酶標儀檢測吸光度值A，按以下公式計算細胞活力，繪制細胞活力曲線并計算IC50：細胞活力=（A實驗組-A空白對照組）/（A陰性對照組-A空白對照組）×100%。

取對數(shù)生長期的U251細胞消化成單細胞懸液后鋪12 孔板。設置含不同濃度NPT-B2 的培養(yǎng)基作為實驗組，不加藥培養(yǎng)基作為對照組（n=3）。孵育72 h 后提取細胞蛋白，蛋白印跡法（Western Blot）檢測細胞中NAMPT 的降解。

Western Blot 條件：以10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白樣品。400 mA 恒流20 min 轉移至PVDF 膜上，轉膜后置于快速封閉液中室溫孵育封閉30 min，PBST 洗膜后與NAMPT兔單克隆抗體（1∶1 000）在4 ℃下孵育過夜，再次洗膜，蛋白條帶轉移至二抗，室溫孵育1 h，曝光。

1.3 白蛋白納米粒（B2-BSA-NPs）的制備

圖1 不同濃度的NPT-B2 對U251 的作用

圖2 B2-BSA-NPs 中NPT-B2 含量測定的HPLC 方法

圖3 B2-BSA-NPS 的粒徑、Zeta 電位和透射電鏡圖片

圖4 不同濃度的B2-BSA-NPs 對U251 的作用

熱驅動法制備包載NPT-B2 的B2-BSA-NPs。將BSA 分散于SDS/DTT 溶液中，濃度為40 mg/ml，90 ℃反應2 h 即得rBSA。取25 μl rBSA 溶液，10 μl NPT-B2（10 μg/μl）加入定量MES（pH4.8）溶液中，37 ℃反應2 h 得到B2-BSA-NPs。5 000 g 離心20 min取上清以去除游離藥物。同法制備不加藥物的空白白蛋白納米粒（BSA-NPs）。

1.4 HPLC 法測定B2-BSA-NPs 中NPT-B2 的含量

HPLC 色譜條件：色譜柱：Agilent Pursuit XRs C18 USP L1（4.6×250 mm，5 μm）；流動相：甲醇：水（81∶19）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：227 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μl。

專屬性測定：對照品：NPT-B2 溶解于甲醇，過0.22 μm 濾膜。B2-BSA-NPs 納米粒中藥物提取方法：取1.25 ml B2-BSA-NPs 溶液，加入適量SDS/DDT 孵育10 min，加入甲醇超聲10 min，16 000 g離心15 min 取上清，過0.22 μm 濾膜。BSA-NPs：處理方法同B2-BSA-NPs。將處理后的各組溶液進行HPLC 檢測。

沃爾夫岡·阿馬德烏斯·莫扎特（Wolfgang Amadeus Mozart，1756—1791）是作曲家、樂器演奏家、維也納古典樂派的重要人物，出生于奧地利。莫扎特是繼格魯克之后最成功的歌劇改革家，在他一生短短的一生中有25年都在從事歌劇創(chuàng)作，共寫了20多部歌劇。

線性范圍：精確稱取NPT-B2 以甲醇定容，配制濃度為100、50、25、12.5、6.25 ng/ml 的對照品溶液，過0.22 μm 濾膜后HPLC 檢測，以峰面積A與對照品濃度C 進行線性回歸制備標準曲線。

精密度測定：取低、中、高三個濃度的對照品溶液，一天內(nèi)重復進樣考察日內(nèi)精密度，連續(xù)三天每天測定一次以考察日間精密度。

回收率測定：取低、中、高三個濃度對照品溶液，加入1.25 ml 空白脂質體溶液，以甲醇定容后超聲10 min，16 000 g 離心15 min，取上清進行HPLC檢測，計算加樣回收率。

1.5 B2-BSA-NPs 的處方優(yōu)化

1.5.1 不同藥載比對B2-BSA-NPs 粒徑、包封率、載藥量的影響

藥載比為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶30時，分別制備B2-BSA-NPs，并測定其粒徑、Zeta 電位、包封率和載藥量。其中包封率的計算公式為：包封率=M實際包載量/M投藥量×100%。載藥量的計算公式為：載藥量=M實際包載量/M載藥納米?！?00%。

1.5.2 不同反應溫度和時間對B2-BSA-NPs 粒徑、包封率、載藥量的影響

反應溫度和時間分別為37 ℃ 1 h、37 ℃ 2 h、37 ℃ 3 h、70 ℃ 3 min、70 ℃ 5 min 時，分別制備B2-BSA-NPs，并測定其粒徑、Zeta 電位、包封率和載藥量。

1.6 B2-BSA-NPs 的表征

根據(jù)處方優(yōu)化結果，選擇反應條件為藥載比=1∶10、反應溫度37 ℃、反應時間2 h。制備B2-BSA-NPs。馬爾文激光粒度儀測定粒徑、Zeta電位。經(jīng)醋酸鈾負染后透射電鏡觀察納米粒的外觀形態(tài)，按1.5.1 中方法測定其包封率和載藥量。

1.7 B2-BSA-NPs 對膠質瘤細胞的增殖活性抑制及對NAMPT 的降解作用

采用CCK8 法考察B2-BSA-NPs 對膠質瘤細胞的增殖活性抑制。取對數(shù)生長期的U251細胞接種至96 孔板。設置含不同濃度NPT-B2 的B2-BSA-NPs 所配制的培養(yǎng)基作為實驗組，不加藥的培養(yǎng)基作為陰性對照組，PBS 作為空白對照組（n=3）。孵育72 h 后加入CCK8 試劑孵育1 h，酶標儀檢測吸光度值A，按1.2 中公式計算細胞活力，繪制細胞活力曲線并計算IC50。

取對數(shù)生長期的U251細胞消化成單細胞懸液后鋪12 孔板。設置含不同濃度NPT-B2 的培養(yǎng)基作為實驗組，不加藥培養(yǎng)基作為對照組（n=3）。孵育72 h 后提取細胞蛋白，按1.2 中蛋白印跡法檢測細胞NAMPT 降解情況。

本研究統(tǒng)計學分析方法均采用GraphPad Prism 8（GraphPad Software, San Diego, CA）計算。兩組間數(shù)據(jù)的比較采用Unpaired Student’s T-test，多組間的數(shù)據(jù)比較采用One-way ANOVA。P＜0.05、P＜0.01 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 NPT-B2 對膠質瘤細胞的增殖活性抑制和對NAMPT 的降解

如圖1A 所示，NPT-B2 對U251細胞的IC50值為61.16 nmol/L，表明NPT-B2 對其有一定毒性作用。Western Blot 結果如圖1B 所示，當NPT-B2 給藥濃度為100 nmol/L 時，NPT-B2 對U251細胞中NAMPT 具有顯著降解效果。

2.2 HPLC 法測定B2-BSA-NPs 中NPT-B2 的含量

如圖2 所示，方法專屬性良好，NPT-B2 保留時間為8.5 min，載體對NPT-B2 測定無干擾。6.25～100 ng/ml 的濃度范圍內(nèi)，NPT-B2 濃度（C, ng/ml）與曲線下面積（Area）呈良好線性關系，線性回歸方程為A=24 998C+30 006，R2=0.999 7。

由表1 可知，B2-BSA-NPs 在低、中、高三個濃度都具有較好的精密度，日間精密度和日內(nèi)精密度RSD 值均小于5%。由表2 可知，B2-BSA-NPs在低、中、高三個濃度的回收率在95%～115%范圍內(nèi)，且RSD 值均小于5%，表明該方法穩(wěn)定可靠，可用于樣品中NPT-B2 含量的測定。

表1 NPT-B2 的HPLC 方法精密度(Mean±SD，n=3)

表2 NPT-B2 的HPLC 方法提取回收率(Mean±SD，n=3)

2.3 B2-BSA-NPs 的處方優(yōu)化

2.3.1 不同藥載比對B2-BSA-NPs 粒徑、包封率、載藥量的影響

結果如表3 所示，隨著載體比例的降低，B2-BSA-NPs 粒徑逐漸增大，包封率逐漸減小，載藥量先增大后減小。故選擇藥載比=1∶10 作為最佳制備條件。

表3 不同藥載比對B2-BSA-NPs 粒徑、包封率、載藥量的影響(Mean±SD，n=3)

2.3.2 不同反應溫度和時間對B2-BSA-NPs 粒徑、包封率、載藥量的影響

結果如表4 所示，反應溫度為37 ℃時，隨著反應時間的延長，B2-BSA-NPs 的粒徑逐漸減小，包封率逐漸增大，載藥量逐漸增大；反應溫度為70 ℃時，隨著反應時間的延長，B2-BSA-NPs 的粒徑逐漸增大，包封率逐漸增大，載藥量逐漸增大。反應溫度為37 ℃，反應時長2 h 和3 h 時，B2-BSA-NPs 的粒徑、包封率、載藥量無顯著性差異（P＞0.05）。選擇溫度為37 ℃，反應時長為2 h 作為最佳制備條件。

表4 不同反應溫度和時間對B2-BSA-NPs 粒徑、包封率、載藥量的影響(Mean±SD，n=3)

2.4 B2-BSA-NPs 的表征

選擇最優(yōu)處方后制備B2-BSA-NPs 并對其進行表征。如圖3 所示，B2-BSA-NPs 的粒徑、Zeta電位分別為55.48±5.30 nm，-12.9±1.21 mV，透射電鏡照片顯示B2-BSA-NPs 為類圓形粒子，粒徑約為50 nm。納米粒包封率為94.74±1.25%，載藥量為8.61±0.11%。

2.5 B2-BSA-NPs 對膠質瘤細胞的增殖活性抑制和對NAMPT 的降解作用

如圖4A 所示，B2-BSA-NPs 對U251細胞的IC50值為41.21 nmol/L，顯著優(yōu)于NPT-B2，表明B2-BSA-NPs 對U251細胞有更強的毒性作用。如圖4B所示，當B2-BSA-NPs 給藥濃度為100 nmol/L 時，對U251中NAMPT 具有非常顯著降解效果。

3 討論

多形性膠質母細胞瘤是惡性程度最高的腦腫瘤之一，具有強浸潤生長及術后高復發(fā)的特點，因此術后的放化療策略尤為重要，而首選藥物替莫唑胺對GBM 產(chǎn)生廣泛的耐藥性，有效率約40%，因此改善GBM 化療效果的新靶點和新方法的研究具有重要意義。腫瘤具有快速增殖和更高的能量代謝特征，干預NAD+代謝是癌癥精準治療的重要靶點，NAD+生物合成的限速酶-煙酰胺磷酸核糖轉移酶（NAMPT）的抑制是干擾NAD+能量代謝的關鍵步驟，是有效的抗腫瘤策略。目前進入臨床Ⅱ期試驗的NAMPT 抑制劑有FK866、GMX1778、GMX1777 等，但具有細胞靶向毒性如血小板減少、視網(wǎng)膜和心臟損害等缺點[13]。具有高度選擇性和效能的靶向蛋白降解技術得到關注，PROTAC 分子由靶蛋白結合配體、連接鏈和E3 泛素連接酶配體三部分組成，能特異性結合靶蛋白，同時招募E3 泛素連接酶使POI 多聚泛素化，最終通過蛋白酶體系統(tǒng)降解。本研究針對新型合成的PROTAC分子NPT-B2，考察其抑制膠質瘤細胞增殖活性以及腫瘤細胞中NAMPT 的降解特性。為了改善藥物水溶性差的問題，結合白蛋白在腫瘤細胞中特異性的攝取機制，以牛血清白蛋白包載NPT-B2 制備納米粒。制備白蛋白納米粒的方法有溶解揮發(fā)、噴霧干燥、乳化、Nab-技術、pH 凝聚等[14]。本研究通過還原BSA 將分子內(nèi)二硫鍵打開，形成分子間的二硫鍵網(wǎng)絡，可將疏水藥物或者分子量較大的藥物通過疏水作用及氫鍵作用穩(wěn)定在BSA 結構中，優(yōu)化處方提高載藥量和包封率。載藥納米粒粒徑約55.48 nm，較小的粒徑是納米粒在腫瘤組織中深層滲透的主要影響因素之一，同時納米載體改善了PROTAC 藥物的水溶性差、適用性差的缺陷，本研究可作為后續(xù)載藥納米粒用于膠質瘤治療研究的基礎。