鄧忠宇，郭士槿，郭熠凡，馮峻程，呂權(quán)真，邱麗娟 （海軍軍醫(yī)大學：.基礎(chǔ)醫(yī)學院；.藥學系, 上海 200433）

隨著唑類抗真菌藥物的長期廣泛使用，真菌耐藥的問題更加凸顯[1]。目前，臨床上從患者體內(nèi)分離出的真菌以念珠菌為主，而其中白念珠菌占比40%以上[2]。然而，抗真菌藥物極為有限，迫切需要研發(fā)新的抗真菌藥物。

近年來，靶向于真菌線粒體的藥物是抗真菌藥物研究的重要方向，如正在開展臨床研究的F901318、聚酮類化合物Ilicicolin-H 等[3-4]。課題組前期在靶向線粒體的藥物研究中發(fā)現(xiàn)，親脂性吡啶鎓鹽可以破壞白念珠菌的線粒體功能，發(fā)揮抗真菌作用，其中帶正電荷的吡啶鎓結(jié)構(gòu)是其抗真菌活性的關(guān)鍵[5-6]。為了進一步篩選通過陽離子靶向線粒體的新骨架類型的化合物，我們從國外ChemDiv化合物庫，篩選了具有吡啶鎓結(jié)構(gòu)的化合物，考察其抗真菌活性。其中N1～N9 是已知化合物，但此前并未有該類化合物應(yīng)用于抗真菌領(lǐng)域的相關(guān)報道。本文通過研究其體外抗真菌效果，探討其作為抗真菌先導化合物。

1 儀器和材料

1.1 儀器

潔凈工作臺[HPeafe-1200LC(A2)上海力申科學儀器有限公司]；振蕩培養(yǎng)箱（HZ-2111K-B 江蘇太倉市實驗設(shè)備廠）；微量加樣器（Biohit）；小型冷凍離心機（HitachiCT15RE）；蒸汽滅菌鍋（KGSX500 KAGOSHIMA SELSAKUSYO，Japan）；多功能酶標儀（TECAN Infinite M200）；倒置相差顯微鏡（Amersham Pharmacia AMG EVOS×1）；紫外分光光度計（Amersham Biosciences Mltrospec10）。

1.2 材料

白念珠菌標準菌株SC5314 由美國Georgetown大學William A Fonzi 教授贈送，臨床分離的10 株氟康唑耐藥的白念珠菌（103、538、876、311、911、849、100、32、1 010）、隱球菌2 株、光滑念珠菌1 株、熱帶念珠菌1 株、近平滑念珠菌1 株、克柔念珠菌1 株，來自海軍軍醫(yī)大學附屬長征醫(yī)院、長海醫(yī)院皮膚科并經(jīng)生化和形態(tài)學鑒定，N1-N9 化合物購自ChemDiv，Inc，二甲基亞砜（DMSO）購自博光生物試劑有限公司，酵母提取物、甘露醇、營養(yǎng)肉湯購自BD 公司，蛋白胨、葡萄糖、瓊脂購自上海生工生物技術(shù)有限公司，RPMI1640 購自Gibco公司，氟康唑購自阿拉丁試劑有限公司。

2 方法

2.1 微量稀釋法篩選N 系列化合物對氟康唑耐藥白念珠菌103、538 的抗菌活性

將保存在SDA 固體培養(yǎng)皿的白念珠菌單克隆菌株轉(zhuǎn)接到1 ml YEPD 培養(yǎng)基，30 ℃、200 r/min，培養(yǎng)過夜，使真菌菌株處于指數(shù)生長平臺期。①洗菌：將活化好的菌株轉(zhuǎn)移到1.5 ml 離心管中，用無菌PBS 緩沖液洗3 次，再用1 ml PBS 重懸。②調(diào)節(jié)濃度：用RPMI 1640 稀釋菌液至終濃度為（1～5）×103CFU/ml。③制備藥敏實驗板：取96 孔板，第1 列加入100 μl RPMI 1640 液體培養(yǎng)基做空白對照；第12 列加入100 μl 上述菌液做陽性對照；第2～11 列采用倍比稀釋的方法制成不同梯度的加藥處理菌液，于30 ℃恒溫培養(yǎng)過夜，用酶標儀在λ=630 nm 測吸光度（A630）值，使A值下降80%以上的對應(yīng)的藥物濃度為MIC80值[7]。

2.2 微量液稀釋法測定N2 化合物對臨床常見致病菌的抗真菌譜

在N 系列化合物中篩選活性較強的化合物N2 進行進一步的抗真菌譜測定。菌株活化、菌液濃度調(diào)節(jié)、藥敏反應(yīng)板制備、測定A值(600 nm)值同上，更換實驗室常用的菌株，測定化合物N2 對多種真菌的作用，重復上述實驗步驟進行實驗。

2.3 紙片擴散實驗對比N2 化合物與氟康唑的藥效

稀釋菌液至1×106CFU/ml，均勻涂布于2 個SDA 固體培養(yǎng)基上并在2 塊培養(yǎng)基上分別放置5 片小圓紙片。取一塊培養(yǎng)基，在5 片紙片上分別滴加0、0.25、0.5、1、2 μg N2 化合物，另一塊按相同方式滴加等量氟康唑。于恒溫箱中30 ℃培養(yǎng)24 h 后觀察并記錄2 塊培養(yǎng)皿上的抑菌圈大小及形態(tài)。

2.4 時間-生長曲線和時間-殺菌曲線測定

生長曲線測定：菌株活化、洗菌步驟同前所述，用YPD 培養(yǎng)基稀釋菌液至1×106CFU /ml（A630=0.01）。取3 支搖菌管加入相同起始菌液量，并對各管進行加藥處理，使3 支搖菌管中N2 濃度分別為0、2、4 μg/ml。30 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)。分別在0、3、6、9、12、24 h 測定各管菌液的A值(630 nm)。以A值(630 nm)值對時間做時間-生長曲線[8]。

殺菌曲線測定：菌株活化、洗菌步驟同前所述，用RPMI 1640 培養(yǎng)基稀釋菌液至1×103CFU /ml。取4 支搖菌管，各加入1 ml 菌液和一定濃度的N2 化合物，使4 支搖菌管的藥物濃度分別為0、2、4、8 μg/ml。30 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)。分別在0、3、6、9、12、24 h 取100 μl 菌液，用無菌PBS 以10 倍濃度梯度稀釋，各取100 μl 涂于SDA 固體培養(yǎng)基表面，30 ℃靜置培養(yǎng)24 h～48 h 后統(tǒng)計培養(yǎng)基內(nèi)的菌落克隆數(shù)。以lgCFU/ml 對時間做時間-殺菌曲線[9]。

2.5 對白念珠菌菌絲和被膜形成能力的影響

N2 化合物對于白念珠菌菌絲形成誘導影響：過夜活化的白念珠菌SC5314 分別用Spider 培養(yǎng)液和RPMI 1640 培養(yǎng)液稀釋至菌濃度為5×105CFU/ml，分別加藥使N2 終濃度為0.5、0.25、0.125 μg/ml。空白對照加入同體積的DMSO，充分混勻，轉(zhuǎn)移至12 孔板中，37 ℃，靜置培養(yǎng)3 h，倒置顯微鏡觀察菌絲形態(tài)。

XTT 法測定N2 化合物抗生物被膜形成實驗：活化白念珠菌SC5314，離心后去除培養(yǎng)基，用無菌PBS 洗菌3 次，然后用RPMI 1640 液體培養(yǎng)基稀釋菌液至1×106CFU/ml。取TC 處理的96 孔板制備反應(yīng)板，37 ℃恒溫培養(yǎng)培養(yǎng)30 min，使細胞沉降黏附在孔板底面。然后吸棄上清，用PBS 緩沖液洗滌3 次。在處理完成的96 孔板第一列加入RPMI 1640培養(yǎng)基，第12 列加入菌液，第2～11 列每2 列為一組，分別加入一定量的N2 化合物使其濃度為32、16、8、4、2 μg/ml。將96 孔板置于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，隨后吸棄上清液并用PBS 洗滌3 次。之后每孔加入200 μl XTT/Menadione 溶液，37 ℃避光孵育3 h。每孔吸取100 μl 上層液體并轉(zhuǎn)移到另一塊96 孔板對應(yīng)的位置，用酶標儀測定各孔A值(490 nm)[10-11]。

2.6 透射電鏡觀察N2 化合物對白念珠菌細胞膜和細胞壁的影響

為進一步明確N2 化合物對白念珠菌細胞壁和細胞膜的影響，研究設(shè)置了2 組白念珠菌。一組用2 μg/ml 的N2 化合物處理，另一組不進行加藥處理，作為對照。處理16 h 后用2%的戊二醛固定，隨后采用透射電鏡詳細觀察2 組白念珠菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

3 結(jié)果

3.1 N2、N6 和N8 化合物具有明顯的體外抗氟康唑耐藥白念珠菌的活性

在RPMI 1640 培養(yǎng)液中，采用臨床分離的氟康唑耐藥白念珠菌103 和538（氟康唑單用時，MIC80＞32 μg/ml），考察N 系列化合物的抗真菌活性。通過對N 系列化合物9 種衍生物的體外抗真菌活性研究發(fā)現(xiàn)，N 系列化合物中N2、N6 和N8 單用對白念珠菌均有一定的抗真菌活性，而N2 化合物的MIC 最低，為0.5 μg/ml 和1 μg/ml，抗真菌作用顯著，這些結(jié)果表明吡啶鎓類化合物具有體外抗真菌活性，后續(xù)可以通過結(jié)構(gòu)改造進一步獲得活性更高的類似物開展深入研究。結(jié)果見表1。

3.2 N2 化合物對臨床常見致病菌有明顯的抗菌活性

通過對N1-N9 化合物的初步篩選，發(fā)現(xiàn)N2 的抗真菌活性最強。因此，我們選定N2 進行了抗真菌譜的考察。為探究臨床常見致病真菌對N2 化合物的敏感性，選用國際標準菌C.albicansSC 5314以及9 種氟康唑耐藥的白念珠菌（C.albicans876、C.albicans311、C.albicans538、C.albicans103、C.albicans911、C.albicans849、C.albicans100、C.albicans32、C.albicans1010）、隱球菌（CryptococcusH99、Cryptococcus32609）、光滑念珠菌C.glabrata537、熱帶念珠菌C.tropicalist293、近平滑念珠菌C.parapsilosis22019、克柔念珠菌C.krusei463，用微量液基稀釋法測定了這些菌株對應(yīng)的MIC80值。通過不同菌株對應(yīng)的MIC80值可以發(fā)現(xiàn)，N2 化合物對這些臨床上常見的致病真菌均起到了明顯的抑制作用，結(jié)果見表2，這些結(jié)果表明吡啶鎓類化合物N2 具有廣譜的抗真菌活性，對于臨床常見的具有致病性的酵母菌均有較強的體外抗真菌活性。

表2 N2 化合物處理后菌株對應(yīng)MIC80 值

3.3 N2 體外抗菌效果優(yōu)于氟康唑

通過紙片擴散法，我們以氟康唑為對照探究了N2 化合物的抑菌效果。結(jié)果顯示，相同劑量下，N2 化合物和氟康唑均可在培養(yǎng)皿上形成圓形抑菌圈，直徑隨藥量增加而增大。N2 化合物處理組抑菌圈內(nèi)無散在菌落，邊界清晰，在培養(yǎng)皿上形成的抑菌圈直徑明顯大于氟康唑處理組。據(jù)此，我們可以認為N2 化合物體外抑菌效果優(yōu)于氟康唑。N2 化合物處理組內(nèi)部無克隆生長提示N2 化合物可能具有一定的殺菌能力而不僅僅是抑制作用，結(jié)果如圖1。

圖1 紙片擴散法抑菌實驗單位(m/μg)

3.4 N2 可以顯著抑制白念珠菌的生長增殖并具有一定的殺菌活性

為了進一步考察N2 對白念珠菌的抑制作用，測定了N2 抑制白念珠菌的時間-生長曲線。A值(600 nm)反映了白念珠菌的生長情況，通過不同時間點的測定發(fā)現(xiàn)，濃度為2 μg/ml 時，N2 對白念珠菌的生長增殖有明顯的抑制作用（P＜0.05），白念珠菌在12 h 內(nèi)，A值(600 nm)的值幾乎沒有升高，而在24 h 時，A值(600 nm)的值仍顯著低于未加藥組。當N2 的濃度增加至4 μg/ml時，白念珠菌在24 h 內(nèi)幾乎不能增殖，A值(600 nm)與起始的測定值相當，結(jié)果如圖2。上述結(jié)果表明，化合物N2 具有明顯的抑制真菌增殖的作用。

圖2 生長曲線

為明確化合物N2 是否有殺菌功效，我們使用N2 化合物處理白念珠菌后，進行涂板培養(yǎng)。測定了0、3、6、9、12、24 h 培養(yǎng)基內(nèi)存活的菌落數(shù)。通過測定N2 化合物濃度為0、2、4、8 μg/ml 時對應(yīng)的時間-殺菌曲線，發(fā)現(xiàn)N2 濃度為8 μg/ml 時，可以顯著降低培養(yǎng)基中白念珠菌的數(shù)量，顯示出明顯的殺菌活性。當N2 濃度為2 μg/ml 時，白念珠菌3 h時數(shù)量減少，而后續(xù)數(shù)量會增加，提示2 μg/ml 的N2 基本不能殺滅培養(yǎng)基中的白念珠菌，結(jié)果如圖3。上述結(jié)果表明，白念珠菌在低濃度時發(fā)揮抑菌活性，而當濃度升高時，展現(xiàn)出殺菌活性。

圖3 殺菌曲線

3.5 化合物N2 可以抑制白念珠菌的菌絲形成

酵母態(tài)向菌絲態(tài)的轉(zhuǎn)換是白念珠菌在體內(nèi)發(fā)生侵襲的重要過程。為了考察N2 對白念珠菌菌絲形成的抑制作用，我們采用了不同的菌絲誘導模型考察化合物N2 對白念珠菌菌絲形成的作用。結(jié)果顯示，37 ℃條件下，無論在菌絲誘導培養(yǎng)基YPD+FBS%或RPMI 1640 培養(yǎng)基中，當N2 的濃度高于1 μg/ml 時，白念珠菌基本維持在酵母態(tài)，菌絲形成被完全抑制，結(jié)果如圖4。同時，化合物N2 的菌絲抑制的濃度與表2 中檢測的MIC80值相當，這一結(jié)果表明，化合物N2 在1 μg/ml 以上的濃度時，可以同時抑制菌絲形成和白念珠菌增殖。

圖4 N2 處理后白念珠菌菌絲形態(tài)

3.6 化合物N2 可以顯著抑制白念珠菌的被膜形成

采用XTT 法考察了化合物N2 對白念珠菌被膜形成的抑制作用。結(jié)果顯示，在RPMI 1640 培養(yǎng)基中，4 μg/ml 和8 μg/ml 的N2 可以抑制約50%的被膜形成，而當濃度繼續(xù)升高至16 μg/ml 或32 μg/ml時，N2 對被膜的抑制率到達70%左右，結(jié)果如圖5。上述結(jié)果表明化合物N2 可以顯著抑制白念珠菌的被膜形成，后續(xù)的結(jié)構(gòu)改造和深入研究可以為抗被膜形成藥物的研發(fā)提供新的方向。

圖5 N2 抑制白念珠菌的生物被膜形成

3.7 N2 可能通過損傷白念珠菌的細胞膜和細胞壁發(fā)揮殺菌作用

通過對比N2 化合物處理組和對照組白念珠菌的電鏡照片，結(jié)果如圖6，我們發(fā)現(xiàn)：N2 處理后，白念珠菌的表面絨毛狀明顯增厚，細胞壁分布不均，細胞膜內(nèi)層變薄，由此推斷可能是幾丁質(zhì)和β-1，3-葡聚糖變少。因此，N2 化合物可能主要通過損傷白念珠菌細胞膜和細胞壁發(fā)揮殺真菌作用。

圖6 白念珠菌透射電鏡照片

4 討論

近年來，隨著免疫抑制劑的廣泛使用、手術(shù)介入和免疫缺陷患者的增多，系統(tǒng)性真菌感染的發(fā)病率逐年攀升。但抗真菌藥物的研發(fā)進展緩慢，現(xiàn)有的幾類抗真菌藥物在長期使用后也逐漸出現(xiàn)了耐藥性。為解決臨床真菌感染的問題，研發(fā)新的抗真菌藥物意義重大。本課題組長期致力于抗真菌化合物的篩選和機制研究，前期在基于破壞真菌線粒體功能的研究中發(fā)現(xiàn)，親脂性吡啶鎓鹽具有較好的線粒體靶向性和抗真菌活性，因此課題組拓展了化合物的結(jié)構(gòu)類型，本研究中考察了親脂性吡啶鎓鹽的作用。通過體外MIC 測定和抗菌譜篩選發(fā)現(xiàn)了3 個具有抗真菌活性的化合物N2、N6 和N8，其中N2 結(jié)構(gòu)中含有2 個叔丁基的苯環(huán)結(jié)構(gòu)，N6 含有一個長飽和碳鏈，均增加了吡啶鎓鹽的親脂性，這些親脂性基團可能有利于增強吡啶鎓鹽的抗真菌活性。后續(xù)可以根據(jù)上述結(jié)構(gòu)，開展進一步的結(jié)構(gòu)改造。研究前期通過體外篩選結(jié)果表明，N2 化合物具有體外抗真菌活性較高和抗真菌譜廣泛的特點，對包括部分氟康唑耐藥菌在內(nèi)的臨床常見致病念珠菌和隱球菌均有一定的抑制作用。尤其是對臨床上造成感染問題最為嚴重的白念珠菌，N2 化合物展現(xiàn)出較強的抗菌效果，能夠高效地抑制和殺傷白念珠菌。而殺真菌藥物是近年來研究的重要方向，通過殺菌活性將體內(nèi)的念珠菌徹底清除，可以減少念珠菌感染的復發(fā)問題，縮短真菌感染的治療周期。本研究有望為抗真菌藥物研發(fā)提供新的思路，但目前涉及的機制研究尚不深入，后續(xù)將基于吡啶鎓鹽的線粒體靶向性，考察其對線粒體的形態(tài)、膜電位、線粒體DNA 和線粒體能量代謝的影響，進一步明確該類化合物的作用機制，為后續(xù)的結(jié)構(gòu)改造和靶點研究提供理論支撐。