蘇子欽, 高田田, 邱 敏, 梁馨文, 胡繼亮, 劉 強, 張建龍, 吳玉宇, 陳 超, 劉瑋煒

(江蘇海洋大學 藥學院,江蘇省海洋生物資源與環(huán)境重點實驗室,江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇海洋生物技術重點實驗室,江蘇省海洋藥物活性分子篩選重點實驗室,江蘇 連云港 222005)

近年來,我國海水養(yǎng)殖種類和養(yǎng)殖模式越來越多樣化,養(yǎng)殖技術逐漸成熟,養(yǎng)殖面積不斷擴大,但隨著集約化養(yǎng)殖程度的不斷提高,養(yǎng)殖水域的污染也逐漸加重,致病性弧菌所引起的病害已被認為是海水動物養(yǎng)殖的“災禍之源”[1-5],主要包括副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)、霍亂弧菌(Vibriocholerae)和創(chuàng)傷弧菌(Vibriovulnificus)等,均為海洋環(huán)境中最常見的細菌類群。這些菌群廣泛分布于近岸、河口海區(qū)的海水和水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境之中,不僅會引起水產(chǎn)動物發(fā)病造成巨大經(jīng)濟損失,某些弧菌更是會造成人或其它動物發(fā)病[6-8]。

目前,水產(chǎn)動物弧菌病的藥物防治主要包括青霉素、硫酸鏈霉素、諾氟沙星和新諾明等,但長期使用會出現(xiàn)耐藥性菌株[9-10]。因此,尋找新的先導化合物或化合物骨架修飾、簡化并開發(fā)出新型水產(chǎn)抗菌藥是當前水產(chǎn)病害防控研究的熱點之一。1,3,4-噻二唑是一類含氮硫的五元雜環(huán)化合物,具有抗菌、抗氧化、抗病毒和調節(jié)植物生長等多種生物活性[11-21]。國內外公司基于噻二唑結構,陸續(xù)研發(fā)出了多種含1,3,4-噻二唑結構的藥物,如除草劑氟噻草胺、丁噻咪草酮和噻黃隆等,殺菌劑噻枯唑,抗菌藥頭孢唑啉和頭孢卡奈等[22-25],該類化合物在化學和生物學研究領域一直具有廣泛的應用。

XIAO等[26]設計并合成了2-氨基-5-(2,4-二氯苯氧基)甲基-1,3,4-噻二唑酰胺類化合物(圖1),初步活性測試結果發(fā)現(xiàn),大部分化合物具有一定的抑菌活性,其中對麥類黑變病菌的抑制率達到了70%以上,對炭疽菌抑制率達到了60%以上。王德志等[27]基于1,3,4-噻二唑類化合物的抑菌活性,以芳香醛和氨基硫脲為原料,合成了6個2-氨基-5-芳基-1,3,4-噻二唑類化合物。抑菌結果表明,所有目標化合物均對小麥赤霉病菌和番茄灰霉病菌具有一定的抑菌活性。通過分析構效關系得出,該類化合物中對氟苯基取代的化合物抑菌活性優(yōu)于其它取代基化合物,對應化合物對小麥赤霉病菌和番茄灰霉病菌的半數(shù)有效濃度(EC50)值分別為23.17 μg·mL-1和20.22 μg·mL-1(圖2)。袁海燕等[28]以硫代氨基脲、甲酸為原料,通過脫水環(huán)化、Knoevenagle縮合等多步反應,合成一類具有1,3,4-噻二唑基團的酰胺類化合物。通過生長速率法進行抑菌活性測試,研究結果表明,部分化合物在50 mg·L-1濃度下對稻瘟病菌和番茄早疫病菌均具有良好的抑制活性,且抑菌率達到了80%以上(圖3)。萬金林等[29]以5-氨基-1,3,4-噻二唑-2-硫醇為起始原料,設計合成了一系列從未報道的含1,3,4-噻二唑結構的查爾酮縮氨基脲類化合物。實驗研究發(fā)現(xiàn),該類化合物對水稻白葉枯病菌、煙草青枯病菌和柑橘潰瘍病菌均具有較好的抑制活性,部分化合物在100 mg·L-1濃度下對以上3種植物病菌的抑制率均達到100%(圖4)。 PATTANAYAK等[30]基于1,3,4-噻二唑結構的活性,設計并合成出2-氨基-5-磺?；?1,3,4-噻二唑類衍生物,經(jīng)初步活性測試結果表明,該類化合物具有良好抗焦慮、抗抑郁和抗驚厥活性(圖5)。薛蒙偉等[31]以二硫化碳和氨基硫脲為原料,設計并合成一系列2-氨基-5-巰基-1,3,4-噻二唑席夫堿類化合物,初步活性研究發(fā)現(xiàn),部分化合物對番茄灰霉病菌、油菜菌核病菌和大豆灰斑病菌均表現(xiàn)出高于85%的抑制率(圖6)。目前,新型雜環(huán)酰胺類化合物的合成與相關藥物研發(fā)逐漸成為醫(yī)藥領域的熱點。基于以上分析,本研究根據(jù)活性子疊加以及生物等排取代的原理,通過化學合成手段,將酰胺鍵引入到具有良好抑菌活性的1,3,4-噻二唑類化合物中,設計合成了6個含1,3,4-噻二唑結構的酰胺類衍生物(圖7)。其結構經(jīng)IR、1H NMR以及HR-MS(ESI)確證,并用牛津杯法初步測試了化合物對霍亂弧菌及哈維氏弧菌的抑制活性。

圖1 2-氨基-5-(2,4-二氯苯氧基)甲基-1,3,4-噻二唑酰胺類化合物的結構

圖2 2-氨基-5-芳基-1,3,4-噻二唑類化合物的合成路線

圖3 含1,3,4-噻二唑結構的酰胺類衍生物的合成路線

圖4 含1,3,4-噻二唑結構的查爾酮縮氨基脲類化合物的合成路線

圖5 2-氨基-5-磺酰基-1,3,4-噻二唑類衍生物的結構

圖6 2-氨基-5-磺?；?1,3,4-噻二唑類化合物的合成路線

圖7 含1,3,4-噻二唑結構的酰胺類衍生物的合成路線

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

X-4B型數(shù)字顯微熔點儀;WFH-203型三用紫外分析儀;AVANCE型核磁共振氫譜儀(DMSO-d6為溶劑,TMS為內標);Cary630型傅里葉紅外光譜儀(KBr壓片);Agilent 6230型液質聯(lián)用儀;SW-CJ-1D型單人凈化工作臺。

酰氯類化合物(98%,上海易恩化學技術有限公司);六水合三氯化鐵(99%,上海阿拉丁試劑有限公司);硫酸鏈霉素(98%,上海麥克林生化科技有限公司);三乙胺(化學純,上海阿拉丁試劑有限公司),其余試劑均為分析純。

1.2 化合物的合成

(1) 2-取代-氨基硫脲類化合物(2)的合成

依次稱取硫代氨基脲(11 mmol)、取代醛類化合物1(10 mmol)于50 mL的圓底燒瓶中,加入20 mL的無水乙醇溶解。80 ℃油浴攪拌3 h, TLC檢測反應至結束,冷卻至室溫,大量固體析出,靜置30 min,抽濾,用蒸餾水洗滌濾餅,得粗品,并用無水乙醇重結晶,得純品化合物2。

(2) 5-取代-1,3,4-噻二唑-2-胺類化合物(3)的合成

于50 mL圓底燒瓶中依次加入化合物2(6 mmol)、六水合三氯化鐵(12 mmol)及20 mL無水乙醇,80 ℃加熱回流8 h, TLC監(jiān)測反應至結束,冷卻至室溫,倒入裝有40 mL蒸餾水的燒杯中,加入5%(質量分數(shù))的氫氧化鈉水溶液,調節(jié)pH至8,用二氯甲烷(3×30 mL)萃取,取有機相,旋蒸除溶劑,得粗品,無水乙醇重結晶,得純品化合物3。

(3) 氯-N-(1,3,4-噻二唑-2-取代)酰胺類化合物(4a～4f)的合成

稱取化合物3(6 mmol)、酰氯類化合物(7.2 mmol)于50 mL圓底燒瓶中,加入15 mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解,冰水浴下攪拌,加入3滴三乙胺至反應液中,撤去冰水浴,繼續(xù)攪拌2 h, TLC監(jiān)測反應至結束。向燒瓶中加入蒸餾水15 mL,有大量固體析出,靜置30 min,抽濾得濾餅。用二氯甲烷和甲醇重結晶,得純品目標化合物4。

2-氯-N-(5-甲基-1,3,4-噻二唑-2-基)乙酰胺(4a):白色固體,收率85.0%, m.p.239～240 ℃; IR(KBr),ν: 3417, 1698, 1596, 1415, 1385, 1066, 840, 774, 613 cm-1;1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 12.77(s, 1H, NH), 4.43(s, 2H, CH2), 2.63(s, 3H, CH3); HR-MS(ESI)m/z: calcd for C5H7ClN3OS+{[M+H]+}191.9993, found 191.9969。

4-氯-N-(5-甲基-1,3,4-噻二唑-2-基)丁酰胺(4b):白色固體,收率87.0%, m.p.210～212 ℃; IR(KBr)ν: 3416, 1687, 1598, 1411, 1366, 848, 775, 678, 668 cm-1;1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 12.42(s, 1H, NH), 3.68(t,J=6.5 Hz, 2H, CH2), 2.63(d,J=7.3 Hz, 2H, CH2), 2.60(d,J=3.4 Hz, 3H, CH3), 2.08～2.01(m, 2H, CH2); HR-MS(ESI)m/z: calcd for C7H11ClN3OS+{[M+H]+}220.0306, found 220.0288。

3-氯-N-(5-甲基-1,3,4-噻二唑-2-基)丙酰胺(4c):淺黃色固體,收率83.0%, m.p.206～208 ℃; IR(KBr)ν: 3447, 1688, 1594, 1418, 1365, 848, 777, 681, 648 cm-1;1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 12.42(s, 1H, NH), 3.68(t,J=6.5 Hz, 2H, CH2), 2.63(d,J=7.3 Hz, 2H, CH2), 2.60(d,J=3.4 Hz, 3H, CH3), 2.08～2.01(m, 2H, CH2); HR-MS(ESI)m/z: calcd for C6H9ClN3OS+{[M+H]+}206.0150, found 206.0123。

2-氯-N-(1,3,4-噻二唑-2-基)乙酰胺(4d):白色固體,收率84.0%, m.p.194～196 ℃; IR(KBr)ν: 3414, 3058, 1711, 1597, 1400, 1364, 820, 776, 715, 603 cm-1;1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 12.95(s, 1H, NH), 9.23(s, 1H, thiadiazole), 4.46(s, 2H, CH2); HR-MS(ESI)m/z: calcd for C4H3ClN3OS-{[M-H]-}175.9681, found 175.9694。

3-氯-N-(1,3,4-噻二唑-2-基)丙酰胺(4e):棕色固體,收率81.0%, m.p.177～178 ℃; IR(KBr)ν: 3443, 1600, 1423, 1384, 1137, 1067, 953, 825, 778, 619 cm-1;1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 12.71(s, 1H, NH), 9.18(s, 1H, thiadiazole), 3.90(t,J=6.2 Hz, 2H, CH2), 3.01(t,J=6.3 Hz, 2H, CH2); HR-MS(ESI)m/z: calcd for C5H5ClN3OS-{[M-H]-}189.9836, found 189.9840。

4-氯-N-(1,3,4-噻二唑-2-基)丁酰胺(4f):白色固體,收率82.0%, m.p.174～175 ℃; IR(KBr)ν: 3417, 1687, 1597, 1444, 1385, 1138, 878, 797, 749, 699 cm-1;1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 12.60(s, 1H, NH), 9.15(s, 1H, thiadiazole), 3.69(t,J=6.5 Hz, 2H, CH2), 2.65(t,J=7.3 Hz, 2H, CH2), 2.06(p,J=6.8 Hz, 2H, CH2); HR-MS(ESI)m/z: calcd for C6H7ClN3OS-{[M-H]-}203.9992, found 204.0000。

1.3 待測定藥液的配制

待測樣品均用乙酸乙酯溶解,配制成濃度為2 mg·mL-1的1 mL樣品溶液,并以溶劑乙酸乙酯溶液1 mL作對照,陽性對照藥硫酸鏈霉素用蒸餾水配置成1 mg·mL-1溶液。牛津杯外徑7.80 mm,對于抑菌圈直徑大于14 mm的化合物,用相應的溶劑按二倍稀釋法進行稀釋,進一步測定其最小抑菌濃度(MIC)。

1.4 生物活性測定

預熱固體MH肉湯培養(yǎng)基,沸騰后取出。溫度稍低后,向每個平板中倒入約30 mL MH肉湯培養(yǎng)基,室溫靜置30 min,待其凝固。吸取活化后的菌懸液200 μL至固體培養(yǎng)基上,在酒精燈附近用涂布棒緩慢將菌液抹勻。靜置約10 min后,用鑷子夾取牛津杯垂直放置于平板規(guī)劃的位置,取200 μL待測樣品溶液于牛津杯孔徑中,每個樣品需做3次平行樣,在32 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h后測定抑菌圈直徑。

2 結果與討論

表1研究結果表明,化合物4b對霍亂弧菌的抑制效果最好,抑菌圈直徑為11.79±0.15 mm,化合物4a和4d對哈維氏弧菌的抑菌效果最好,最小抑菌濃度均達到了0.250 mg·mL-1。分析構效關系表明,雜環(huán)噻二唑酰胺類衍生物的抗菌活性受連接酰胺鍵的脂肪鏈長短的影響。鑒于此,今后的研究工作可以選擇噻二唑基團的5位進行結構修飾。

表1 目標化合物體外抑制哈維氏弧菌和霍亂弧菌的活性測試結果

3 結論

本文以醛類化合物為原料,與硫代氨基脲生成希夫堿類化合物,成環(huán)后生成1,3,4-噻二唑類衍生物,并與不同鏈長的酰氯反應,合成6個含1,3,4-噻二唑結構的酰胺類衍生物。抑菌活性結果表明:部分目標化合物對哈維氏弧菌和霍亂弧菌表現(xiàn)出一定的抑制活性,其中化合物4b對霍亂弧菌的抑制效果最好,抑菌圈直徑為11.79±0.15 mm,化合物4a和4c對哈維氏弧菌的抑制效果最好,抑菌圈直徑分別為17.53±0.08 mm、 19.37±0.56 mm,且MIC均為0.250 mg·mL-1。構效關系表明:酰胺鍵的脂肪鏈長短對化合物的弧菌抑制活性影響較大,脂肪鏈越短活性越好?；衔?a、4b和4d可作為先導化合物進一步研究,為后續(xù)水產(chǎn)抗菌藥物的研發(fā)提供了理論基礎。