李仰琪,趙曉嵐,梁艷華,柯婭楠,沈秀玲,葉興東

瘙癢是一種可使人產生不快的主觀癥狀,易引發(fā)搔抓欲望,其發(fā)病機制尚未完全闡明。近年臨床發(fā)現(xiàn)瘙癢的外周敏化機制主要是組胺依賴及非組胺依賴性的瘙癢信號通路,其中蛋白酶激活受體2(PAR-2)途徑可介導瘙癢,瞬時感受器電位香草酸受體1(TRPV1)是該途徑的下游信號。有研究表明,非組胺依賴性瘙癢神經信號傳導與TRPV1或TRPA1耦聯(lián)神經通路有關[1]。TRPV1的初級傳入C纖維的子集可根據(jù)受體的表達與瘙癢原敏感性分為3組[2-4]。TRPV1作為各刺激的整合器,在瘙癢、疼痛及皮膚神經源性炎癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[5-6]。本研究基于PAR-2/TRPV1信號通路探討低分子肝素鈉聯(lián)合醋酸地塞米松治療小鼠瘙癢模型的有效性,現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 于選取6周齡C57小鼠48只,體質量(25±5)g,在標準環(huán)境下飼養(yǎng),晝夜12 h∶12 h,均衡飲食,自由飲水。采用隨機數(shù)字表法將24只制成干皮癥(AEW)慢性瘙癢小鼠模型,剩余24只制成DNFB過敏性皮炎急性瘙癢小鼠模型。將AEW慢性瘙癢、DNFB過敏性皮炎急性瘙癢小鼠模型按照隨機數(shù)字表法分為模型對照組、地塞米松組、肝素組、聯(lián)合用藥組,每組6只。

1.2 建模與干預方法 小鼠AEW慢性瘙癢、DNFB過敏性皮炎急性瘙癢模型構建參考文獻[7-8]。治療方法：模型對照組僅在小鼠脫毛部位給予0.9%氯化鈉溶液;地塞米松組在小鼠脫毛部位涂抹醋酸地塞米松乳膏(本院自制)0.1 g;肝素組在小鼠脫毛部位涂抹低分子肝素鈉軟膏(山東博士倫福瑞達制藥有限公司生產)0.1 g;聯(lián)合用藥組在小鼠脫毛部位涂抹醋酸地塞米松乳膏、低分子肝素鈉軟膏各0.1 g。各組小鼠用藥頻率均為2次/d,持續(xù)干預7 d。

1.3 觀察指標與方法 (1)瘙癢次數(shù)：于干預前、干預7 d后,分別將各組小鼠置于聚丙烯樹脂玻璃盒子內,在安靜環(huán)境下用攝像機記錄小鼠1 h內對頸背部的抓撓次數(shù),測試當天選取3個不同的時間點記錄,取平均值。(2)PAR-2、TRPV1蛋白表達量：干預7 d后,觀察小鼠皮損、抓撓情況,而后采取頸椎脫臼法處死所有小鼠,取小鼠造模區(qū)皮膚,提取蛋白并根據(jù)BCA法進行蛋白定量,待抗體孵育完成清洗,行ECL化學發(fā)光法進行目的蛋白條帶灰度分析,采用Western blotting檢測PAR-2、TRPV1蛋白表達量。

2 結 果

2.1 瘙癢次數(shù)比較 在AEW慢性瘙癢、DNFB過敏性皮炎急性瘙癢小鼠模型中,干預前,4組小鼠瘙癢次數(shù)比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);干預7 d后,聯(lián)合用藥組、肝素組、地塞米松組小鼠瘙癢次數(shù)均少于模型對照組,且聯(lián)合用藥組小鼠瘙癢次數(shù)少于肝素組、地塞米松組(P<0.05),見表1。

表1 4組小鼠模型干預前后瘙癢次數(shù)比較次,n=6)

2.2 PAR-2、TRPV1蛋白表達量比較 干預7 d后,在AEW慢性瘙癢小鼠模型中,肝素組、聯(lián)合用藥組TRPV1蛋白表達量低于模型對照組,聯(lián)合用藥組低于地塞米松組、肝素組(P<0.05);地塞米松組、肝素組、聯(lián)合用藥組PAR-2蛋白表達量低于模型對照組,聯(lián)合用藥組低于地塞米松組、肝素組(P<0.05)。干預7 d后,在DNFB過敏性皮炎急性瘙癢小鼠模型中,肝素組、聯(lián)合用藥組TRPV1、PAR-2蛋白表達量低于模型對照組,聯(lián)合用藥組低于地塞米松組、肝素組(P<0.05),見表2。

表2 4組小鼠模型干預后TRPV1、PAR-2蛋白表達量比較

3 討 論

急性瘙癢提示環(huán)境存在有害物質,如昆蟲、有毒植物或其他刺激物,同時激發(fā)抓撓,以清除瘙癢原并減輕瘙癢感。慢性瘙癢則可能是一種伴隨皮膚或系統(tǒng)病變的免疫異常表現(xiàn),雖然多數(shù)瘙癢癥狀由組胺信號介導,但還有其他神經通路[9],如來自植物毛霉的針刺通過非組胺依賴途徑引起的強烈瘙癢[10-11]。此外,免疫細胞可釋放多種致癢原,引起瘙癢、銀屑病及濕疹等,而抗組胺藥物在治療瘙癢方面無效。大多數(shù)病理生理瘙癢癥對抗組胺藥物并不敏感,治療靶點尚未確定[12]。皮膚病、全身性疾病、神經系統(tǒng)疾病、精神疾病等均可導致瘙癢癥狀,常表現(xiàn)為急性或慢性形式(持續(xù)時間≥6周)。

慢性瘙癢的治療是臨床的一項挑戰(zhàn),中重度瘙癢患者的生活質量顯著降低。而瘙癢的潛在生理學非常復雜,包括角質形成細胞和感覺神經元等以及某些免疫細胞的浸潤。有研究表明,角質層細胞、神經纖維與各種免疫細胞(如角質形成細胞、T細胞、嗜堿粒細胞、嗜酸粒細胞和肥大細胞)之間存在顯著影響,皮膚和脊髓神經元或不同免疫細胞上受體之間的相互作用對瘙癢傳播起著重要作用。

TRPV1廣泛分布于皮膚重要結構細胞的細胞膜上,包括角質形成細胞、成纖維細胞及皮脂腺細胞,以及樹突狀細胞、肥大細胞等功能細胞的細胞膜上,多種炎性皮膚病的發(fā)生、發(fā)展與內外源性刺激介導的TRPV1活化密切相關,該受體活化可進一步導致神經肽或促炎性遞質釋放,該通道的活化或阻斷在慢性炎性皮膚病治療中的靶點作用也日益凸顯。TRPV1是瘙癢信號傳導的重要分子。背根神經節(jié)細胞對PAR-2和5-羥色胺的反應大于對組胺的反應,提示慢性干性皮膚的瘙癢神經信號途徑可能是內源性激活劑的釋放促使PAR-2和5-羥色胺受體2A激活,致敏發(fā)送瘙癢信號的神經元,加重瘙癢癥狀,此過程并不依賴組胺的釋放。相關研究證實,PAR-2神經源性機制參與皮膚炎癥和瘙癢,TRPV1屬于瞬時受體電壓感受器家族成員之一,存在于中樞神經系統(tǒng)和外周神經系統(tǒng)。目前已有研究證實PAR-2在外周神經系統(tǒng)及中樞神經系統(tǒng)的脊髓及大腦中存在表達,因此,PAR-2信號途徑也可刺激中樞神經系統(tǒng)脊髓水平段的神經肽釋放,CGRP受體和SP受體(NK1P)激活后,促使癢覺效應直接傳達至中樞神經系統(tǒng)。此外,神經元表面的PAR-2活化后,神經元發(fā)生以鈣離子為主的跨膜離子流動,細胞內鈣離子濃度改變,TRPV1活性增強,PAR-2與TRPV1以協(xié)同作用的方式相互影響,增強瘙癢感覺。

肝素是三磷酸肌醇(IP3)受體特異性拮抗劑,其中低分子肝素分子量小,易透過細胞膜進入細胞內拮抗IP3受體,從而抑制PAR-2激活誘導的鈣離子濃度上升。本研究結果顯示,干預7 d后,在所有瘙癢小鼠模型中,聯(lián)合用藥組瘙癢次數(shù)少于肝素組、地塞米松組;在AEW慢性瘙癢小鼠模型中,肝素組、聯(lián)合用藥組TRPV1蛋白表達量低于模型對照組,聯(lián)合用藥組低于地塞米松組、肝素組,地塞米松組、肝素組、聯(lián)合用藥組PAR-2蛋白表達量低于模型對照組,聯(lián)合用藥組更低于地塞米松組、肝素組;在DNFB過敏性皮炎急性瘙癢小鼠模型中,肝素組、聯(lián)合用藥組TRPV1、PAR-2蛋白表達量低于模型對照組,聯(lián)合用藥組更低于地塞米松組、肝素組,表明低分子肝素鈉與醋酸地塞米松均可明顯改善瘙癢小鼠皮膚瘙癢癥狀,且聯(lián)合用藥效果優(yōu)于單一用藥,同時低分子肝素鈉可顯著降低小鼠皮膚PAR-2/TRPV1通路蛋白的表達,且聯(lián)合醋酸地塞米松對該通路的抑制效果更加顯著,本實驗結果進一步驗證了低分子肝素鈉聯(lián)合醋酸地塞米松可通過阻斷PAR-2/TRPV1信號通路改善瘙癢小鼠的瘙癢程度,PAR-2/TRPV1非組胺依賴通路可能是低分子肝素鈉發(fā)揮作用的重要機制。

綜上所述,低分子肝素鈉軟膏可通過阻斷PAR-2/TRPV1信號通路改善瘙癢小鼠的瘙癢癥狀,將其與醋酸地塞米松聯(lián)合治療對該通路的抑制效果更加顯著。隨著對PAR-2及TRPV1生物學功能的深刻認識,以及其在炎癥性瘙癢性皮膚病發(fā)病機制中的深入探討,研發(fā)更具有特異性的PAR-2或TRPV1拮抗肽應用于瘙癢性皮膚病的治療終將成為可能。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突。