賴春池 張璐璐 孫夢雅 孫俊芳 姜紅

（青島大學(xué)附屬醫(yī)院新生兒科，山東青島 266000）

子癇前期（preeclampsia, PE）是一種常見的妊娠并發(fā)癥，重度子癇前期（severe preeclampsia,sPE）病情呈持續(xù)性進(jìn)展，常導(dǎo)致胎兒早產(chǎn)和母親心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)增加，嚴(yán)重者可伴有多器官功能衰竭，威脅母嬰生命［1-2］。大量研究表明，早發(fā)型PE 產(chǎn)婦圍生期不良預(yù)后、新生兒嚴(yán)重并發(fā)癥的發(fā)生率和病死率均高于晚發(fā)型［3-4］。

人類白細(xì)胞抗原（human leucocyte antigen,HLA） 是主要組織相容性復(fù)合物（major histocompatibility complex, MHC） 的表達(dá)產(chǎn)物，HLA-DR 抗原是HLA基因系統(tǒng)中的重要抗原之一，決定其特異性的主要編碼基因DRB1座位具有高度多態(tài)性。既往研究表明，HLA-DRB1rs3135388 位點(diǎn)的多態(tài)性是多發(fā)性硬化癥的易感因素［5］；另有研究顯示，rs3135388及rs2308765位點(diǎn)與高血壓疾病可能存在一定相關(guān)性［6］。本研究通過對母嬰HLA-DRB1基因rs3135388與rs2308765位點(diǎn)所在片段進(jìn)行測序，篩選單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism, SNP） 位點(diǎn)，探究HLADRB1基因多態(tài)性與產(chǎn)婦早發(fā)型sPE 遺傳易感性的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對象

本研究共納入2016年12月—2017年12月期間在青島大學(xué)附屬醫(yī)院分娩的產(chǎn)婦及其新生兒222對，所有研究對象臨床資料完整。選取早發(fā)型sPE產(chǎn)婦及其新生兒102對為sPE組，同期血壓正常產(chǎn)婦及其新生兒120對為對照組。對照組產(chǎn)婦平均年齡為（31±4）歲，新生兒平均胎齡為（39.0±2.5）周。sPE 組產(chǎn)婦平均年齡為（33±5）歲，新生兒平均胎齡為（32.5±2.6）周。早發(fā)型sPE的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照有關(guān)國際實(shí)踐管理建議［7］。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）產(chǎn)婦既往有原發(fā)性高血壓、腎功能不全、肝功能損傷、糖尿病和自身免疫性疾病等病史；（2）染色體異常；（3）胎兒為多胎、死胎及嚴(yán)重胎兒畸形等。本研究已獲青島大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（審批號(hào)：QYFY WZLL 27688），研究對象均已簽署相關(guān)知情同意書。

1.2 方法

抽取產(chǎn)婦清晨空腹外周肘靜脈血2 mL 置于EDTA 管中，胎兒娩出后抽取臍帶血2 mL 置于EDTA 管中。標(biāo)本保存在-80°C 冰箱中備用。使用北京天根生化有限公司全血基因組DNA 提取試劑盒（離心柱型）提取DNA。取2 μL 樣品用微量紫外分光光度儀（美國Thermo 公司）對DNA 進(jìn)行純度與濃度測定。HLA-DRB1基因rs3135388 和rs2308765 位點(diǎn)引物序列見表1，引物由美國Applied Biosystems 生物公司合成。1 μL DNA、1 μL 引物溶液（上游引物0.5 μL 和下游引物0.5 μL）、10 μL去離子水和7 μL 2×PCR Mix混勻，放入C1000TM Thermal Cycler（Bio-Rad, USA）熒光定量PCR 儀中，反應(yīng)條件為：95°C 5 min，94°C 45 s，57°C 1 min，30個(gè)循環(huán)。

表1 HLA-DRB1基因相關(guān)片段的引物序列

采用Sanger測序法獲得基因分型，測序結(jié)果由BioEdit Sequence Alignment Editor 直接得出，統(tǒng)計(jì)每個(gè)研究對象在各個(gè)位點(diǎn)的基因型分布。同一位點(diǎn)3種基因型圖像如圖1～3所示。

圖1 rs114293611 位點(diǎn)的Sanger 測序結(jié)果 箭頭處表明該位點(diǎn)一代測序結(jié)果讀取為CC。

圖2 rs114293611 位點(diǎn)的Sanger 測序結(jié)果 箭頭處表明該位點(diǎn)一代測序結(jié)果讀取為CT。

圖3 rs114293611 位點(diǎn)的Sanger 測序結(jié)果 箭頭處表明該位點(diǎn)一代測序結(jié)果讀取為TT。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 25.0 對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用成組t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分率（%）表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)或Fisher 確切概率法。對對照組基因型進(jìn)行Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)，P＞0.05 說明該數(shù)據(jù)具有群體代表性，遵循遺傳規(guī)律。采用多因素logistic 回歸模型分析等位基因頻率與sPE發(fā)生的關(guān)系。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組臨床資料的比較

sPE組產(chǎn)婦年齡、生產(chǎn)次數(shù)、收縮壓和舒張壓均高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；sPE組新生兒胎齡、出生體重、1 min 及5 min Apgar 評分均低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與對照組相比，sPE組新生兒宮內(nèi)窘迫和窒息的發(fā)生率顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。兩組產(chǎn)婦的懷孕次數(shù)及新生兒性別的比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 兩組臨床資料的比較

2.2 HLA-DRB1基因SNP位點(diǎn)

在 2 個(gè)基因片段中發(fā)現(xiàn) rs3135388、rs114293611 和rs142804168 3 個(gè)SNP 位點(diǎn)，已知的rs2308765 在本研究所選研究對象中未體現(xiàn)出多態(tài)性。上述3個(gè)SNP對照組基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)（P＞0.05）。

2.3 兩組HLA-DRB1 基因rs114293611 位點(diǎn)基因型分布和等位基因頻率比較

sPE組產(chǎn)婦rs114293611位點(diǎn)的CC、CT、TT基因型分布與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而兩組產(chǎn)婦在該位點(diǎn)的等位基因頻率的比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在新生兒中，rs114293611 位點(diǎn)的基因型分布和等位基因頻率分布在兩組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3～4。

表3 兩組rs114293611位點(diǎn)基因型比較 ［n（%）］

表4 兩組rs114293611位點(diǎn)等位基因頻率比較 ［n（%）］

2.4 兩組HLA-DRB1 rs3135388 和rs142804168位點(diǎn)基因型分布和等位基因頻率比較

rs3135388和rs142804168位點(diǎn)的基因型分布和等位基因頻率在兩組產(chǎn)婦及新生兒之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表5～6。

表5 兩組rs3131388和rs142804168位點(diǎn)基因型比較［n（%）］

表6 兩組rs3131388和rs142804168位點(diǎn)等位基因頻率比較 ［n（%）］

2.5 rs114293611位點(diǎn)基因型母嬰配伍分析

選擇產(chǎn)婦與新生兒差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的rs114293611 位點(diǎn)進(jìn)行母嬰配伍，結(jié)果顯示sPE 組和對照組在基因型相容性上差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表7。

表7 兩組母嬰攜帶的rs114293611位點(diǎn)基因型的相容性比較 ［n（%）］

3 討論

PE的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。目前公認(rèn)的PE兩階段模型指出，第一階段胎盤灌注不足或異常胎盤觸發(fā)臨床表現(xiàn)出現(xiàn)，第二階段母親個(gè)體因素（環(huán)境、遺傳或行為）與之相互作用而加劇導(dǎo)致孕產(chǎn)婦綜合征［8-9］。研究表明，胎兒攜帶的HLA基因一半來自母親，一半來自父親［10］。在妊娠過程中，HLA 的產(chǎn)物在正常的胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞上表達(dá)，與母體子宮自然殺傷細(xì)胞上表達(dá)的殺傷IgG樣受體相互作用，維持母胎之間免疫平衡［11］。

在正常妊娠中，絨毛細(xì)胞滋養(yǎng)層和合胞體滋養(yǎng)層不表達(dá)HLAⅠ類和Ⅱ類分子，侵襲性絨毛外滋養(yǎng)層僅表達(dá)Ⅰ類分子（HLA-C、HLA-G、HLA-E和HLA-F）［12-13］。這一機(jī)制對于母胎免疫耐受平衡至關(guān)重要，其有效阻止了母體T 細(xì)胞針對父源性MHC 抗原的同種免疫反應(yīng)，使妊娠順利繼續(xù)。一旦這種免疫平衡被打破，就可能出現(xiàn)母胎間免疫耐受失衡，抑制自然殺傷細(xì)胞產(chǎn)生參與血管生成和血管穩(wěn)定的細(xì)胞因子，影響外滋養(yǎng)層浸潤和母體胎盤床血管重塑，從而導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤不足、胎盤螺旋動(dòng)脈生理轉(zhuǎn)化異常，引起胎盤功能失調(diào)、胎盤灌注障礙繼而發(fā)展為PE［11，14］。HLA-DR 屬HLAⅡ類，表達(dá)于專業(yè)抗原遞呈細(xì)胞上，向T細(xì)胞呈遞外源性抗原，引起特異性免疫應(yīng)答。研究發(fā)現(xiàn)，PE 孕婦的胎盤和合體滋養(yǎng)層細(xì)胞來源的細(xì)胞外囊泡中HLA-DR分子異常表達(dá)，而正常妊娠的孕婦未檢測到HLA-DR分子表達(dá)［15-16］，這一發(fā)現(xiàn)為探索PE發(fā)病機(jī)制提供了新思路。

目前針對HLA基因多態(tài)性與PE的關(guān)系已有大量研究報(bào)道。研究顯示，PE組孕產(chǎn)婦HLA-DRB1*06和HLA-DRB1*07基因頻率顯著高于對照組，提示其可能是PE 發(fā)生的易感因素［17］。HLA-G基因29799440 位點(diǎn)的SNP 與產(chǎn)婦PE 的易感性存在聯(lián)系［18］。Mohammadi 等［19］研究發(fā)現(xiàn)，HLA-DQB1基因多態(tài)性與PE的發(fā)生有關(guān)，HLA-DQB1*0602位點(diǎn)的缺乏可能是PE的危險(xiǎn)因素。另外，有研究發(fā)現(xiàn)，配偶間HLAⅡ類基因相容性與sPE的發(fā)生有關(guān)［20］。Zheng 等［21］發(fā)現(xiàn)母胎間HLA-A基因相容有利于母胎對妊娠的免疫耐受。

本研究根據(jù)HLA-DRB1基因rs3135388 位點(diǎn)與多發(fā)性硬化癥的發(fā)生相關(guān)文獻(xiàn)查詢結(jié)果，獲得其上下游引物片段［6］。本研究通過基因測序發(fā)現(xiàn)了新的SNP 位點(diǎn)rs114293611 和rs142804168。在102對sPE 組母嬰和120 對對照組母嬰之間進(jìn)行Sanger測序基因分型分析中，結(jié)果顯示，rs114293611 位點(diǎn)基因型分布在sPE組和對照組產(chǎn)婦之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；同時(shí)，在兩組新生兒間的比較中，rs114293611 位點(diǎn)的基因型分布差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明HLA-DRB1基因rs114293611 位點(diǎn)的SNP 可能與早發(fā)型sPE 發(fā)生有關(guān)。此外，在sPE 組新生兒中，rs114293611 位點(diǎn)的T 等位基因頻率高于對照組，提示攜帶T等位基因的新生兒其母親患早發(fā)型sPE 的概率是攜帶C 等位基因的1.919 倍（OR=1.919，P＜0.05），表明HLA-DRB1rs114293611位點(diǎn)T等位基因可能是sPE的危險(xiǎn)基因。其發(fā)病機(jī)制可能是該位點(diǎn)等位基因由C變?yōu)門時(shí)，相應(yīng)氨基酸表達(dá)由色氨酸變?yōu)榱涟彼?，從而影響蛋白功能表達(dá)，并進(jìn)一步導(dǎo)致sPE的發(fā)生，但具體機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。然而，對于rs3135388 和rs142804168 位點(diǎn)而言，兩組母嬰之間的基因型分布和等位基因頻率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，尚不能認(rèn)為這兩個(gè)位點(diǎn)的SNP與sPE的發(fā)生相關(guān)。為進(jìn)一步探討HLA-DRB1基因在sPE組和對照組的母嬰傳遞上是否存在差異，我們將母嬰按rs114293611 位點(diǎn)的基因型分布進(jìn)行配伍統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示sPE組和對照組在基因型相容性上存在顯著差異，表明rs114293611位點(diǎn)在母嬰雙方基因型多態(tài)性不相容，可能與胎兒來源于父系基因?qū)е履柑ブg免疫紊亂有關(guān)，從而參與sPE的發(fā)病過程，然而具體發(fā)病機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，HLA-DRB1基因rs114293611 位點(diǎn)SNP 可能與產(chǎn)婦早發(fā)型sPE 的發(fā)生相關(guān)。HLADRB1基因rs114293611 位點(diǎn)母嬰基因型配伍異?？赡苁钱a(chǎn)婦患早發(fā)型sPE的易感因素。然而，本研究的研究對象局限于中國北方女性，樣本量小。此外，sPE是一種復(fù)雜的多基因遺傳病，本研究僅選取了1個(gè)基因的3個(gè)SNP 位點(diǎn)，對于不同位點(diǎn)間是否存在相互作用未進(jìn)行研究。今后還需進(jìn)行擴(kuò)大范圍及樣本量、涉及不同基因和多個(gè)位點(diǎn)的研究，進(jìn)一步加深對sPE發(fā)病機(jī)制的認(rèn)知，以便更好地指導(dǎo)臨床診斷和治療。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在任何利益沖突。