賈西貝,李效雄,杜 雨,胡曉桐,劉 筠,馬彥軍*

(1.甘肅農業(yè)大學林學院,甘肅 蘭州 730070;2.蘭州資源環(huán)境職業(yè)技術大學,甘肅 蘭州 730030)

自然界中有許多不利因素影響著植物的生長發(fā)育過程,這些因素主要分為生物脅迫和非生物脅迫兩大類。而鹽脅迫和干旱脅迫是非生物脅迫中影響植物生長發(fā)育的主要原因,對植物的遺傳潛力存在較大的影響[1]。鹽脅迫會對植物細胞滲透產生影響,引發(fā)離子毒害,從而誘發(fā)植株內活性氧的產生,不僅導致各組織細胞內的離子失衡,還會使植物發(fā)生生理性干旱,缺少生長發(fā)育必需的營養(yǎng)元素等許多問題[2-3]。面對鹽脅迫,多數植物通過自身合成能夠滲透調節(jié)的物質,或是通過清除活性氧等方法,增強自身應對鹽脅迫時的調節(jié)能力,從而減小鹽脅迫對其生長發(fā)育帶來的危害與影響[4]。此外,干旱也可以迫使植物的生理生化指標發(fā)生異常[5],引起細胞壁的機械損傷、葉片的光合效率降低或氣孔閉合,以及植物細胞脫水等許多問題,最終導致植株的代謝紊亂[4]。由于鹽脅迫或干旱脅迫導致的植物細胞脫水,會使其細胞壁的伸展性受到直接影響。面對此類問題,植物會對自身細胞大小進行調節(jié),或是通過改變細胞壁的延展性來保障細胞膨壓,從而將細胞失水的影響降到最低,適應失水條件[6]。因此,明確植物的耐鹽耐旱等抗逆脅迫機制,對提高植物的育種及栽培技術有著重要意義[7]。

木葡聚糖內糖基轉移酶/水解酶(Xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase,XTH)是一種細胞壁操作酶,屬于糖苷水解酶16(GH16)家族[8],具有兩種不同的催化活性,一種為水解酶(Xyloglucan endohydrolase,XEH),另一種為轉糖基酶(Xyloglucan endotransglucosylase,XET)。XTH酶多數的保守基序都是DEIDFEFLG,該基序被認為是XET和XEH活性的催化位點[9]。根據結構的不同可將XTH蛋白分為I/II和III組,而III組分為兩個亞組IIIA和IIIB[10]。研究表明,具有糖基轉移酶活性的XTH主要屬于I/II組,而具有水解酶活性的XTH主要屬于III組。XTH蛋白中有兩個保守結構域,名為Glyco_hydro_16和XET_C。XET(C-XET)的C端結構域是區(qū)分XTH成員和其他GH16家族的主要依據[11-12]。在植物的生長發(fā)育及整個生命周期中,XTH基因參與植物許多抗逆性調控過程,具有極其重要的作用。例如,在辣椒(Capsicumannuum)中,CaXTH1,CaXTH2以及CaXTH3鹽脅迫處理后表達均呈現升高趨勢,同時CaXTH3過表達有利于番茄(Solanumlycopersicum)和擬南芥(Arabidopsisthaliana)耐鹽能力的提升[13-14]。在較高濃度的NaCl脅迫下,蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)的MtXTH3基因表達顯著上調[15]。柿子(DiospyroskakiThunb)中DkXTH1基因的過表達有利于增強擬南芥的抗鹽脅迫、抗干旱脅迫以及對脫落酸(Abscisic acid,ABA)的耐受能力[16]。上述研究表明XTH基因家族在植物耐鹽和抗干旱等非生物脅迫的生理過程中發(fā)揮一定的重要作用。

黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr．)屬于茄科(Solanceae)枸杞屬(LyciumL.),多棘刺灌木,無主枝,多分枝,主要分布在西北地區(qū)的戈壁灘或鹽堿地中[17]。黑果枸杞生命力頑強,耐寒耐旱、抗鹽堿,是我國防風固沙、改良土壤荒漠化的先鋒植物[18],同時因其果實中豐富的營養(yǎng)物質價值較高,因此也是荒漠地區(qū)主要的經濟物種[19-20]。黑果枸杞雖然是西北地區(qū)重要的耐鹽植物之一,但對其在分子層面對逆境脅迫的研究還較少。當前對植物抗逆性的研究多集中在模式植物上,如擬南芥、水稻(Oryzasativa)和煙草(Nicotianatabacum)[21-22]等。因此,本研究通過分析鹽脅迫下黑果枸杞的轉錄組數據庫,對黑果枸杞XTH家族成員進行了系統(tǒng)的鑒定及生物信息學分析,為更加深入了解黑果枸杞響應脅迫機制及XTH家族成員功能的進一步研究提供理論依據和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗材料為甘肅農業(yè)大學林學院組培室枸杞組培苗。材料生長環(huán)境為：晝夜溫度控制在(22±2)℃/(20±2)℃的范圍內,光照每天保持16 h,相對濕度保持在65%,光照強度為700 μmol·m-2·s-1。1/2MS培養(yǎng)基配方主要包括：1/2MS培養(yǎng)基2.47 g·L-1,蔗糖20 g·L-1,瓊脂5 g·L-1,NAA 0.2 mg·L-1,IBA 0.2 mg·L-1。2周后,取長勢良好、條件相同的實驗苗進行煉苗,經過5天后移栽培養(yǎng)至1/2 Hoagland營養(yǎng)液中,培養(yǎng)液(pH=5.7)的配制成分包括：2 mmol·L-1KNO3,0.5 mmol·L-1MgSO4·7H2O,10 μmol·L-1MnCl2·4H2O,0.5 mmol·L-1Ca(NO3)2·4H2O,0.5 mmol·L-1KH2PO4,0.05 μmol·L-1Na2MoO4·2H2O,1.6 μmol·L-1ZnSO4·7H2O,0.6 μmol·L-1CuSO4,50 μmol·L-1H3BO3,0.06 μmol·L-1Fe-citrate·2H2O[23]。在營養(yǎng)液中培養(yǎng)14天,然后分別用50 mmol·L-1和250 mmol·L-1的NaCl進行鹽脅迫處理。在加入NaCl的0 h,1 h和12 h三個時間段分別取樣,并設置空白對照組。以相同的處理方式用樣品做3次重復。之后將樣品材料的根、莖、葉各采集0.1 g,液氮速凍,并在-80℃的條件下冷藏備用。

1.2 方法

1.2.1鹽脅迫下黑果枸杞XTH基因家族的篩選及理化性質分析 對數據庫NR,KOG和Swiss-Prot分別注釋,將篩選出的候選基因蛋白序列導入NCBI(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)進行預測,利用在線軟件Pfam(https：//Pfam.xfam.org/)以及NCBI的CDD(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)進行保守結構域分析,然后利用InterProScan(v5.17-56.0)進行進一步的驗證,剔除不含保守結構域的序列,剩余序列即為黑果枸杞的XTH蛋白序列。使用ExPASy(http：//web.expasy.org/protparam/)對XTH轉錄因子進行預測,分析其氨基酸的分子量、脂肪系數、不穩(wěn)定數以及等電點等相關數據。

1.2.2鹽脅迫下黑果枸杞XTH基因家族保守域驗證與基序分析 通過開放閱讀框(Open reading frame,ORF)(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder)對LrXTHs的氨基酸序列進行初步預測。LrXTHs氨基酸序列的比對則使用DNAMAN 8.0軟件。用在線軟件MEME(https：//meme.nbcr.net./meme/tools/meme)對XTH基因的保守域單元(Motif)進行檢測,其中數目最大的保守基序為5,設其余參數值為默認。

1.2.3鹽脅迫下黑果枸杞XTH系統(tǒng)發(fā)育和表達譜分析 從TAIR(http：//www.arabidopsis.org/)、UniPort(https：//www.uniprot.org)和NCBI上獲取擬南芥、水稻、番茄、煙草和葡萄(Vitisvinifera)五種植物的序列。使用MEGA-X軟件(版本為10.0.2),采用極大似然法(ML,Piosson model),bootstrap1000構建黑果枸杞、擬南芥、水稻、番茄、煙草和葡萄的系統(tǒng)發(fā)育樹。構建的進化樹則通過在線軟件iTOL(http：//itol.embl.de/)進行美化。利用軟件TBtools內的Heatmapper程序構建黑果枸杞葉部和根部組織的基因表達譜。

2 結果與分析

2.1 基因篩選

通過Pfam和NCBI Blast,篩選含有PF00722(Glycohydro_16)和PF06955(XET_C)保守結構域的蛋白序列,共篩選得到19個LrXTHs基因家族成員,并命名為LrXTH1～LrXTH19(表1)。使用在線軟件ExPASy預測分析19個LrXTHs氨基酸序列(表1),結果顯示氨基酸數目介于258～330 aa之間;分子量在29.770 62～37.980 83 kDa之間;理論等電點介于4.98～8.92之間,LrXTHs的基因長度在954 bp～1 814 bp之間。其中穩(wěn)定蛋白有11個,不穩(wěn)定蛋白有8個,通過脂肪系數可知19個LrXTHs蛋白屬于親水性蛋白。

表1 黑果枸杞XTH轉錄因子的理化性質Table 1 The physicochemical properties of XTH transcription factors in Lycium ruthenicum

2.2 保守域驗證與基序分析

通過對19個LrXTHs蛋白序列進行多序列比對,結果表明(圖1)：在LrXTHs蛋白中代表催化活性殘基的活性位點(ExDxE)高度保守,且所有LrXTHs蛋白都具有DE(I/L/F/V)D(F/I/M)EFLG保守結構域。DE(I/L/F/V)D(F/I/M)EFLG結構域氨基酸數量在103～160個之間,氨基酸序列中多個氨基酸位點都是穩(wěn)定不變的,為DEXDXEFLG(圖1)。19個LrXTHs蛋白的催化殘基附近具有潛在的N-連接糖基化位點：N(Y/H)V(R/L/T/I/S/K/E/A)T(S/K/R/P)G(A/D/R)。

將黑果枸杞XTH導入MEME軟件,對其家族成員的保守序列驗證分析。結果顯示,得到5個LrXTH基因家族的保守基序,并為其從Motif 1依次命名至Motif 5(圖2),長度在21～50 aa之間,且LrXTH中都含Motif 1～Motif 5的基序。這5個保守基序通過Intreproscan(v5.17-56.0)工具功能注釋(表2),發(fā)現Motif 1～Motif 4為Glyco_hydro_16,Motif 5為XET-C。

圖1 黑果枸杞XTH轉錄因子的多序列對比Fig.1 Multi-sequence comparison of XTH transcription factors in L. ruthenicum

圖2 黑果枸杞XTH轉錄因子的蛋白保守基序Fig.2 The protein conserved motif of LrXTH transcription factor in L. ruthenicum

2.3 系統(tǒng)進化樹分析

為進一步解析LrXTH基因家族的系統(tǒng)發(fā)育關系,選擇19個黑果枸杞的XTHs成員,33個擬南芥的XTHs成員、29個水稻的XTHs成員、32個番茄的XTHs成員、56個煙草的XTHs成員和34個葡萄的XTHs成員構建系統(tǒng)發(fā)育樹。結果顯示,五種植物的XTHs基因家族成員分為4個亞族(圖3),除III A和Ancestral亞族不含有LrXTH成員外,III B亞族含有基因LrXTH2,LrXTH13和LrXTH14,其余成員則位于I/II亞族。同時I/II亞族的XTH蛋白數量較多,共有16名成員,AtXTH1,AtXTH2,AtXTH3和AtXTH11基因則被歸入Ancestral亞族。同時在系統(tǒng)發(fā)育樹中部分XTH基因形成了相關姐妹對,如LrXTH14和NtXTH47,LrXTH1和NP_001 234369.2,LrXTH3和NtXTH28,NtXTH28,LrXTH4和XP_004250701.1等(圖3)?？偠灾?XTH基因家族成員在不同植物進化過程有所差異,并且在這五種植物中黑果枸杞與番茄的家族成員關系更加密切。

圖3 擬南芥、水稻、煙草、葡萄、番茄和黑果枸杞中LrXTH基因的系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of LrXTH genes in Arabidopsis thaliana,Oryza sativa,Nicotiana tabacum,Vitis vinifera,Solanum lycopersicum and L. ruthenicum

2.4 基因的表達譜分析

為初步了解LrXTH基因的功能,在NaCl處理下對黑果枸杞葉部和根部組織的19個LrXTHs基因表達進行分析。結果顯示,LrXTH基因家族成員在黑果枸杞不同組織中的表達量存在明顯差異。在鹽脅迫下黑果枸杞根部組織的多數XTHs表達量較高,其中LrXTH3,LrXTH9,LrXTH18和LrXTH19是受鹽脅迫誘導而表達量上調的基因。在250 mmol·L-1濃度的鹽處理下,根部組織中LrXTH3和LrXTH19基因分別在1 h和12 h時(R250_1和R250_12)表達量顯著上調;同一時間內(1 h),LrXTH9表達量在50 mmol·L-1的NaCl處理下顯著上調,LrXTH18表達量在250 mmol·L-1的NaCl處理下顯著上調,推測這4個基因可能參與鹽脅迫反應并發(fā)揮功能。在鹽脅迫下,黑果枸杞葉部組織的LrXTH9表達量在50 mmol·L-1的NaCl處理下隨鹽處理時間的增加而升高,其屬于鹽脅迫誘導上調基因。鹽脅迫處理下LrXTH5和LrXTH8表達量在根部和葉部組織中均表現出較明顯的下降趨勢,其中LrXTH5在1 h和12 h兩組處理時間內,其表達量隨NaCl濃度的升高而降低;在濃度為50 mmol·L-1和250 mmol·L-1的兩組NaCl處理下,其表達量隨時間的增加而降低,它屬于鹽脅迫誘導下調基因。在葉片和根部中,LrXTH9表達量在1 h和12 h時,50 mmol·L-1的NaCl處理下表現為上調,250 mmol·L-1的NaCl處理下表現為下調(圖4)。通過與對照組比較,推測LrXTH3,LrXTH9,LrXTH18和LrXTH19在黑果枸杞抗鹽脅迫的生理過程中起到了重要的作用。

圖4 LrXTH基因在不同組織中的表達模式Fig.4 Expression patterns of LrXTH genes in different tissues注：L表示葉;R表示根.R50-1表示50 mmol·L-1NaCl處理下1小時所取根樣;L50-1表示50 mmol·L-1 NaCl處理下1小時所取葉樣;R250-1表示250 mmol·L-1 NaCl處理下1小時所取根樣;L250-1表示250 mmol·L-1NaCl處理下1小時所取葉樣;R50-12表示50 mmol·L-1 NaCl處理下12小時所取根樣;L50-12表示50 mmol·L-1NaCl處理下12小時所取葉樣;R250-12表示250 mmol·L-1NaCl處理下12小時所取根樣;L250-12表示250 mmol·L-1NaCl處理下12小時所取葉樣,R0表示CK根;L0表示CK葉。下同Note：L denotes the leaf,R the root.R50-1：root sample under 50 mmol·L-1 of NaCl treatment for 1 hour;L50-1：leaf sample under 50 mmol·L-1 of NaCl treatment for 1 hour;R250-1：root sample under 250 mmol·L-1 of NaCl treatment for 1 hour;L250-1：leaf sample under 250 mmol·L-1 of NaCl treatment for 1 hour;R50-12：root sample under 50 mmol·L-1 of NaCl treatment for 12 hours;L50-12：leaf sample under 50 mmol·L-1 of NaCl treatment for 12 hours;R250-12：root sample under 250 mmol·L-1 of NaCl treatment for 12 hours L250-12：leaf sample under 250 mmol·L-1 of NaCl treatment for 12 hours;R0：root sample under root control treatment;L0：leaf sample under leaf control treatment.The same as below

圖5 LrXTH基因響應鹽處理的表達分析Fig.5 Expression analysis of LrXTH genes in response to salt treatments

3 討論

對XTH基因的鑒定有助于了解植物面對耐鹽和抗旱等環(huán)境脅迫時耐受性基因的表達和調控機制。已有研究通過轉基因技術證實了XTH基因在提高機體對鹽脅迫耐受性中的重要作用[24-25]。目前,XTH基因家族已經在多個植物中得到鑒定,其中包括擬南芥33個[26],水稻29個[27],大麥(HordeumvulgareL.)35個[28]和煙草56個[22]等。本研究基于黑果枸杞轉錄組數據鑒定出19個LrXTHs家族成員,并對其進行系統(tǒng)地生物信息學分析及功能預測。

驗證保守結構域是研究基因家族及其功能的重要內容。通過多序列比對及保守基序的分析,19個LrXTHs成員都含DE(I/L/F/V)D(F/I/M)EFLG保守結構域,這與擬南芥[26]、水稻[27]、鹽角草[10]等蛋白序列結構高度相似。與進化樹結合分析發(fā)現,同一亞族的LrXTHs基因具有較高相似度的保守基序,說明黑果枸杞XTH基因擁有較為保守的蛋白結構。這為LrXTHs各序列之間的保守程度以及對進化樹的亞族分類提供了較高保障,從而有助于更深層次地進行黑果枸杞XTH基因家族的功能分析。另外,在同一亞族中,LrXTHs基因的位置相近,Motif數目和排列順序大致相同,這與鳳梨[29](Ananascomosus)和胡楊[30](Populuseuphratica)等植物中XTH轉錄因子結果相似。這表明LrXTHs的分類不僅有保守基序的保障,而且亞族之間的序列也有著較高的保守性。

對19個LrXTHs進行系統(tǒng)發(fā)育分析,劃分出4個亞族(圖3),這與XTH家族中水稻、鹽角草[10](Salicorniaeuropaea)、桃[31](Prunuspersica(L.) Batsch)和辣椒[32]等植物的分類結果一致。除Ancestral亞族外,其它亞族全都含有擬南芥、水稻、煙草及葡萄的XTH基因家族成員,說明黑果枸杞和它們的演化路徑具有一定的相似性,通過比較這幾種植物XTH基因家族的遺傳演化過程,發(fā)現與黑果枸杞XTH家族同源程度最高的植物為番茄,表示黑果枸杞XTH家族成員與番茄的進化起源關系是十分相近的。部分研究表明Ⅰ/Ⅱ亞族和ⅢB亞族的XTH蛋白一般具有XET活性[33-35],而ⅢA亞族的XTH蛋白具有XEH活性[36-37]。通常位于同一亞族的基因具有相似的功能,因此可以通過對進化樹亞族中基因家族成員的分析,推測相同分支的基因功能[38]。擬南芥XTH19和XTH23受BES1調控,參與側根的生長發(fā)育并促進側根的鹽適應[16],因此推測LrXTH19具有類似的作用;AtXTH30作為負調控因子參與擬南芥對鹽脅迫的響應[39],推測同一亞族的LrXTH2,LrXTH13,LrXTH14具有類似的功能;擬南芥的根部在生長發(fā)育過程中,AtXTH10起著重要作用,其缺失或過量表達都會對擬南芥幼苗根部生長產生影響[40],推測同分支的LrXTH10對黑果枸杞根部生長有著相同的作用;水稻在干旱脅迫下,OsXTH2表達明顯升高并呈現出相關趨勢[41],推測同分支的LrXTH1,LrXTH4,LrXTH5在黑果枸杞抗干旱脅迫過程中可能發(fā)揮重要作用;在鹽脅迫和干旱脅迫下,葡萄的VvXTH3,VvXTH5,VvXTH31,VvXTH34表達量顯著增加[42],推測同分支的LrXTH4,LrXTH9,LrXTH10和LrXTH12在黑果枸杞耐鹽和抗干旱等非生物脅迫響應過程中發(fā)揮重要作用。通過對基因表達譜分析,能夠對植物的生物學特性(如抗逆脅迫、生長發(fā)育以及亞族組織的特異性等)進行更加深入地探索,為下一步的功能分析打下堅實的數據基礎[43-44]。

根據基因表達譜顯示,經過鹽脅迫處理,多數黑果枸杞LrXTHs基因的表達水平都高于空白對照,同時基因的表達模式在葉片和根部中也存在差異。其中LrXTH3,LrXTH18,LrXTH19僅根部上調表達,這在水稻中也有同樣的現象,其中7個XTH基因(OsXTH1,OsXTH2,OsXTH4,OsXTH13,OsXTH15,OsXTH16和OsXTH25)主要在14日齡幼苗的根中表達,而在其他組織中未檢測到表達[10]。葡萄的VvXTH20在鹽脅迫處理3 h內根部表達量顯著升高[42],且同一亞族的LrXTH18在R250_1 NaCl處理下顯著升高,推測LrXTH18在黑果枸杞根部的抗鹽脅迫過程中起到一定作用;在干旱和鹽脅迫下,VvXTH31表達量在葡萄葉部組織中顯著上調[42],而同一亞族中LrXTH9在黑果枸杞的葉中表達水平較高,推測LrXTH9在黑果枸杞葉部的抗鹽脅迫過程中參與調控過程;同時LrXTH9在低濃度NaCl(L50和R50)處理下,分別在1 h和12 h兩組不同時間處理中都表現為表達量上調,推測該基因在黑果枸杞根部和葉部組織中參與耐鹽脅迫。在擬南芥中AtXTH14,AtXTH15和AtXTH31基因在鹽脅迫處理下顯著下調,表明其參與植物抗鹽的調控過程[45],因此推測黑果枸杞的LrXTH15和LrXTH16參與對NaCl脅迫抗性的負調控過程。在水稻中OsXTH11在抗鹽脅迫中發(fā)揮重要作用[46],推測同一亞族分支的LrXTH3,LrXTH18和LrXTH19可能在黑果枸杞抗鹽脅迫中發(fā)揮重要作用。因此,可將這些LrXTHs作為候選基因為作物抗鹽性研究提供參考,但仍需通過相關研究來完善LrXTHs在鹽脅迫下的作用機理。

4 結論

本研究對鹽脅迫下黑果枸杞轉錄組數據分析,得到19個LrXTHs家族成員,并對其理化性質、系統(tǒng)進化樹以及表達譜模式等進行研究,從而預測其潛在的生物學功能。多序列比對分析表明LrXTHs的保守結構域為DE(I/L/F/V)D(F/I/M)EFLG。系統(tǒng)發(fā)育分析將LrXTHs分成4個亞族。表達譜分析表明LrXTH3,LrXTH18和LrXTH19在黑果枸杞根部表達水平較高,而LrXTH9基因在葉部和根部表達水平較高,推測它們可能在黑果枸杞抗鹽脅迫過程中具有重要作用。研究結果為黑果枸杞和XTH基因家族潛在功能的進一步研究提供了參考。