李清權(quán) 許華平 劉金環(huán)

肺部是最常受金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)影響的器官之一[1]。在S.aureus感染期間,肺泡巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞被募集到感染部位并有助于細(xì)菌清除,但也可能加劇肺部炎癥和損傷[2-3]。因此,這些免疫細(xì)胞和病原體之間的早期相互作用對于確定S.aureus感染疾病的結(jié)果很重要。先天免疫系統(tǒng)檢測病原體相關(guān)分子模式通過激活模式識(shí)別受體快速響應(yīng),包括干擾素基因刺激物(stimulator of interferon genes,STING),這是宿主防御微生物感染的第一道防線[4]。STING作為感染環(huán)境中炎癥的重要介質(zhì),參與調(diào)節(jié)促炎和抗炎細(xì)胞因子的分泌[5]。然而,S.aureus是否能激活STING信號(hào)通路,并通過STING介導(dǎo)促炎和抗炎細(xì)胞因子的分泌尚不清楚。因此,本研究分析了C57BL/6J小鼠、STING-/-小鼠在S.aureus感染期間死亡率、炎癥介質(zhì)產(chǎn)生和器官損傷的差異。

資料與方法

一、細(xì)菌菌株和動(dòng)物

金黃色葡萄球菌USA 300購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。將細(xì)菌菌株在Mueller-Hinton Ⅱ陽離子調(diào)節(jié)肉湯(MH肉湯,美國BD Biosciences公司)中于37 ℃培養(yǎng)16 h,同時(shí)不斷搖晃至600 nm處的光密度為2.0。8周齡C57BL/6J WT和STING缺陷型(STING-/-)小鼠由南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所提供[6]。將小鼠安置在微型隔離籠中,并隨意接受食物和水。實(shí)驗(yàn)室溫度為(24±1) ℃。在實(shí)驗(yàn)之前,將小鼠安置至少2～3 d以適應(yīng)環(huán)境。本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)本院倫理委員會(huì)審批同意(倫審2021-012)。

二、小鼠的實(shí)驗(yàn)性感染和治療

實(shí)驗(yàn)分兩部分。第一部分考察STING在調(diào)節(jié)S.aureus感染誘導(dǎo)的小鼠死亡率中的作用。使用計(jì)算機(jī)隨機(jī)化表將60只小鼠隨機(jī)分為3組:對照組、C57BL/6J WT組和STING-/-組,每組20只。C57BL/6J WT組和STING-/-組小鼠腹腔注射金黃色葡萄球菌 (1×109CFU)。對照組小鼠腹腔注射1 mL PBS。連續(xù)觀察60 h內(nèi)動(dòng)物存活情況。第二部分考察STING對S.aureus感染期間炎癥介質(zhì)產(chǎn)生和器官損傷的影響。使用計(jì)算機(jī)隨機(jī)化表將72只小鼠隨機(jī)分為3組:對照組、C57BL/6J WT組和STING-/-組,每組24只。C57BL/6J WT組和STING-/-組小鼠腹腔注射金黃色葡萄球菌 (1×109CFU)[7]。對照組小鼠腹腔注射1 mL PBS。分別在注射前和注射后6 h和24 h,各組隨機(jī)選取8只小鼠收集血清和肺組織,用于炎癥介質(zhì)和器官損傷分析。

三、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)

將收獲的肺切成小塊并稱重。然后,將組織均質(zhì)化并用T-PER組織蛋白提取試劑(美國Thermo Scientific公司)進(jìn)行裂解,然后在4 ℃下以1500 g離心20 min。收集血清后,小鼠血清在37 ℃下孵育1 h,然后在4 ℃下孵育過夜。隨后,將血清以1000 × g離心15 min,收集上清液。使用TNF-α、IL-10(美國Biolegend公司)和RANTES(美國PeproTech公司) 的ELISA試劑盒檢測TNF-α、IL-10和RANTES水平。

四、肺的組織病理學(xué)

從左下葉收集的肺組織樣本用10%福爾馬林固定,石蠟包埋,切成4 μm切片。對于組織學(xué)檢查,石蠟切片用Mayer蘇木精和1%伊紅染色。通過光學(xué)顯微鏡和攝影系統(tǒng)觀察和評(píng)估切片。將小鼠的冷凍6 μm肺組織切片在室溫下解凍15 min,然后在冷丙酮中固定10 min。將解凍的切片在含有0.25% Tween的冷PBS中洗滌,并在室溫下在5%牛血清白蛋白中封閉1 h。添加兔抗高遷移率組框蛋白1(high-mobility group box protein 1,HMGB1)單克隆抗體(1 ∶100,英國Abcam公司),切片在4 ℃黑暗中孵育過夜。孵育后,使用含0.25% Tween的PBS洗滌載玻3次,每次15 min,然后在Alexa Fluor 488偶聯(lián)山羊抗兔IgG二抗(1 ∶1 000,英國Abcam公司)中室溫避光孵育1 h。采用LSM 800共聚焦顯微鏡(德國Zeiss公司)捕獲圖像(×100 放大倍率)和分析熒光強(qiáng)度。從每個(gè)樣品中隨機(jī)選擇三個(gè)捕獲場之一并用于熒光強(qiáng)度分析。在相同條件下捕獲來自不同樣本的圖像。

五、數(shù)據(jù)分析

結(jié) 果

一、STING在調(diào)節(jié)S.aureus感染誘導(dǎo)的小鼠死亡率中起關(guān)鍵作用

采用STING缺陷型(STING-/-)小鼠研究STING在調(diào)節(jié)S.aureus感染誘導(dǎo)的小鼠死亡率中的作用(圖1)。C57BL/6J WT小鼠腹膜內(nèi)注射S.aureus后42 h的存活率為50%。STING-/-小鼠在腹腔注射S.aureus后30 h的存活率為50%(圖2)。肺組織的組織病理學(xué)分析顯示,S.aureus感染導(dǎo)致小鼠肺組織出現(xiàn)嚴(yán)重的病理變化,如肺泡破壞和肺泡腔擴(kuò)張。STING-/-小鼠肺損傷程度進(jìn)一步加重(圖3)。

圖1 WB驗(yàn)證STING-/-小鼠肺組織中STING敲除

圖2 對數(shù)秩檢驗(yàn)用于比較實(shí)驗(yàn)組之間的生存差異(n=20)。與對照組相比,*P<0.05

圖3 H&E染色檢測感染后24 h小鼠肺組織病理變化(×100) A:對照組;B:C57BL/6J WT組;C:STING-/-組

二、 STING參與S. aureus感染小鼠的促炎細(xì)胞因子、抗炎細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生

與C57BL/6J WT組相比,STING-/-組小鼠在S.aureus感染后6 h肺和血清TNF-α、IL-10和RANTES水平均顯著降低(P<0.05),而STING-/-組小鼠在S.aureus感染后24 h肺和血清TNF-α、IL-10和RANTES水平均顯著升高(P<0.05)(表1-3)。

表1 ELISA分析小鼠肺和血清中TNF-α水平(感染前、感染后6 h和24 h)

表2 ELISA分析小鼠肺和血清中IL-10水平(感染前、感染后6 h和24 h)

表3 ELISA分析小鼠肺和血清中RANTES水平(感染前、感染后6 h和24 h)

三、 STING可以減弱S. aureus誘導(dǎo)小鼠HMGB1的表達(dá)

在S.aureus感染期間,STING-/-小鼠肺中HMGB1的表達(dá)在感染后6 h時(shí)顯著低于C57BL/6J WT小鼠(P<0.05),在感染后24 h時(shí)顯著高于C57BL/6J WT小鼠(P<0.05)(圖4,表4)。

表4 各組感染前、感染后6 h和24 h小鼠肺組織中HMGB1的平均強(qiáng)度

圖4 免疫熒光檢測感染前、感染后6 h和24 h小鼠肺組織中HMGB1的表達(dá)(×100)。比例尺=50μm

討 論

S.aureus是一種革蘭氏陽性細(xì)菌,通常作為位于前鼻孔表面的共生細(xì)菌發(fā)現(xiàn)。然而,它具有多種毒力因子,在某些條件下可能會(huì)致病[8]。S.aureus引起的全身感染主要表現(xiàn)為菌血癥、肺炎、膿毒癥和中毒性休克綜合征[9]。研究發(fā)現(xiàn),模式識(shí)別受體識(shí)別來自S.aureus的病原體相關(guān)分子模式,然后激活NF-κB和MAPK信號(hào)通路,介導(dǎo)促炎細(xì)胞因子、趨化因子和抗炎細(xì)胞因子的強(qiáng)烈釋放[10]。本研究表明,與C57BL/6J WT小鼠相比,在S.aureus感染期間,STING-/-小鼠的死亡率加快?；谶@一觀察,我們推斷STING對于介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和調(diào)節(jié)S.aureus誘導(dǎo)的小鼠死亡率可能是必不可少的,但是,STING調(diào)節(jié)這一過程的確切機(jī)制仍不清楚。為了解釋觀察到的現(xiàn)象,我們接下來探索了S.aureus感染小鼠中促炎細(xì)胞因子、趨化因子和抗炎細(xì)胞因子的水平。

先前的研究報(bào)道,在S.aureus感染小鼠的急性期,TNF-α和IL-1β水平顯著升高[11]。S.aureus成分脂磷壁酸的乳房內(nèi)攻擊會(huì)增加各種細(xì)胞因子的mRNA表達(dá),包括TNF-α、IL-1β和RANTES[12]。IL-10通過限制過度的炎癥反應(yīng),在感染和炎癥期間維持組織穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著重要作用[13]。細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生被認(rèn)為是細(xì)菌感染過程中宿主炎癥反應(yīng)強(qiáng)度的重要指標(biāo)。我們的結(jié)果表明,與C57BL/6J WT小鼠在感染后6 h相比,STING-/-小鼠中TNF-α、RANTES和IL-10的產(chǎn)生減弱。以往的研究報(bào)道,感染早期的初始炎癥反應(yīng)對宿主有益,可提高細(xì)菌的清除率,是減弱細(xì)菌入侵、控制炎癥和減少組織損傷的關(guān)鍵因素[14]。通過STING識(shí)別的S.aureus的細(xì)菌肽聚糖可以誘導(dǎo)IL-10的產(chǎn)生,從而控制組織損傷和對S.aureus感染的疾病耐受性[15]。此外,STING已被證明在S.aureus識(shí)別和清除中發(fā)揮關(guān)鍵作用[16]?；谙惹把芯康倪@些發(fā)現(xiàn)和本研究結(jié)果,我們推斷在STING缺乏的情況下,宿主先天免疫系統(tǒng)無法全面識(shí)別來自S.aureus的病原體相關(guān)分子模式。因此,感染早期小鼠促炎細(xì)胞因子、抗炎細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生受損不利于S.aureus的清除。

值得注意的是,我們的結(jié)果顯示,與C57BL/6J WT小鼠相比,STING-/-小鼠在感染24 h后TNF-α、RANTES和IL-10的分泌增加。先前的研究報(bào)道,S.aureus誘導(dǎo)的全身炎癥激活的免疫細(xì)胞會(huì)分泌大量的促炎細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子,它們負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[17]。IL-10的免疫逃避作用在葡萄球菌菌血癥患者中最為明顯,其中IL-10水平升高與死亡率相關(guān)[18]。循環(huán)中促炎細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子水平升高會(huì)進(jìn)一步增加免疫系統(tǒng)的活性,在極端情況下會(huì)導(dǎo)致器官損傷和死亡。膿毒癥期間巨噬細(xì)胞內(nèi)毒素耐受性的發(fā)展會(huì)重新編程STING信號(hào)傳導(dǎo)以抑制促炎細(xì)胞因子而不抑制抗炎和抗菌介質(zhì),從而保護(hù)宿主免受過度炎癥和組織損傷[19]。我們推斷,在STING缺乏的情況下,宿主感染耐受性未完全激活,但免疫驅(qū)動(dòng)的抗性在感染后指定時(shí)間點(diǎn)過度激活。這些結(jié)果在一定程度上解釋了與C57BL/6J WT小鼠相比,STING-/-小鼠的死亡率在S.aureus感染期間加速。基于先前研究的這些發(fā)現(xiàn)和本研究結(jié)果,我們初步得出結(jié)論,STING可以在指定的時(shí)間點(diǎn)調(diào)節(jié)宿主感染耐受中炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生和免疫驅(qū)動(dòng)的對S.aureus感染的抵抗之間的平衡。

HMGB1被認(rèn)為是與炎癥反應(yīng)相關(guān)的組織損傷信號(hào)[20]。與上述發(fā)現(xiàn)一致,本研究中與C57BL/6J WT小鼠在感染后6 h相比,HMGB1在STING-/-小鼠中的表達(dá)減弱。然而,隨著S.aureus感染的延長,HMGB1的表達(dá)在STING-/-小鼠中增強(qiáng)。以前的研究報(bào)道,HMGB1是內(nèi)毒素致死的晚期介質(zhì),并參與許多生物過程,包括膿毒癥和休克[20]。在膿毒癥和內(nèi)毒素血癥中,中和HMGB1可以阻斷LPS或CLP的致死作用[21]?；谶@些發(fā)現(xiàn)和本研究結(jié)果,我們推斷在S.aureus感染期間,STING在感染耐受和免疫驅(qū)動(dòng)的抵抗中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,其可能通過促進(jìn)HMGB1表達(dá)進(jìn)而誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生,決定了小鼠器官損傷的嚴(yán)重程度。

綜上所述,在S.aureus感染過程中,STING可以調(diào)節(jié)免疫驅(qū)動(dòng)的抵抗和耐受之間的平衡,從而影響體內(nèi)炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生,進(jìn)而改善肺損傷程度和死亡率。此外,在S.aureus感染期間,確保宿主先天免疫系統(tǒng)中STING參與對于維持宿主免疫驅(qū)動(dòng)的抗性和耐受性之間的平衡至關(guān)重要。