夏碧 李蒙蒙 陸軍

重癥COVID-19肺炎康復患者中,肺纖維化的發(fā)展是一個主要問題。對COVID-19肺炎患者的尸檢研究表明,COVID-19肺炎患者死亡的主要原因是不同階段彌漫性肺泡損傷(diffuse alveolar damage,DAD)引起的呼吸衰竭。據(jù)報道,在重癥COVID-19肺炎幸存者中,20%非機械通氣患者和72%機械通氣患者在住院4個月后出現(xiàn)纖維樣影像學異常[1]。目前,對于重癥COVID-19肺炎肺纖維化,尚不清楚其分子機制且無確切的治療手段[2]。近年來,生物信息學技術和微陣列技術的發(fā)展,為生物學機制的研究提供了便利。本文從GEO數(shù)據(jù)庫中下載了編號為GSE206788的基因表達數(shù)據(jù),使用R語言軟件篩選出重癥COVID-19肺炎肺纖維化組與正常對照組的差異表達基因(differentially expressed genes,DEGs),進一步篩選出關鍵基因,并通過關鍵基因預測可能的治療中藥,同時對DEGs進行GO和KEGG富集分析,旨在探究重癥COVID-19肺炎肺纖維化的關鍵基因及可能機制,為臨床治療提供新的靶點。

資料與方法

一、數(shù)據(jù)獲取

在GEO公共數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)檢索并獲取重癥COVID-19肺炎患者肺纖維化的基因表達矩陣(GSE206788),其中包含19個樣本,12個重癥COVID-19肺炎肺纖維化組,7個正常對照組?；虮磉_的檢測平臺為GPL32385(Nano Stringn Counter human fibrosis panel)。

二、差異基因獲取

使用R語言軟件中的limma包篩選出重癥COVID-19肺炎肺纖維化組與正常對照組的DEGs,篩選條件為P值<0.05 和|log2FC|>1。

三、差異基因功能富集分析

用生物學信息注釋及可視化數(shù)據(jù)庫(database for annotation,visualization and integrated discovery,DAVID)(https://david.ncifcrf.go/)對DEGs進行GO功能注釋和KEGG富集分析。其中,GO功能注釋包括生物學過程(biological process,bp)、細胞組成(cell composition,cc)和分子功能(molecular function,mf)[3];KEGG富集分析會將DEGs富集在特定的通路[4]。

四、蛋白互作網絡構建與關鍵基因的篩選

將差異基因列表上傳至數(shù)據(jù)庫檢索工具(search tool for the retrieval of interacting genes,STRING)平臺進行蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction,PPI)分析,篩選置信度>0.9的互作蛋白基因,通過 Cytoscape軟件(https://cytoscape.org/)的CytoHubba 插件中的5種算法(MCC、Degree、Closeness、Betweenness和Radiality)共同篩選出關鍵基因。

五、關鍵基因中藥預測

將關鍵基因輸入 Coremine Medical 數(shù)據(jù)庫(http://www.coremine.com/)中,下載每個基因對應的中藥信息,通過每個基因對應的中藥取交集,獲取與關鍵基因相關性最高的中藥列表。

結 果

一、差異分析結果

下載GEO數(shù)據(jù)庫GSE206788的表達矩陣及平臺文件GPL32385,在Excel中提取表達譜數(shù)據(jù),使用VLOOKUP函數(shù)將ID轉換成Gene symbol,將數(shù)據(jù)分為兩組:重癥COVID-19肺炎肺纖維化組與正常對照組,重癥COVID-19肺炎肺纖維化組12個樣本,正常對照組7個樣本。通過R語言的limma將兩組數(shù)據(jù)進行差異分析,按條件|log2FC|>1且P值<0.05篩選出249個DEGs,其中有125個上調基因,124個下調基因(見圖1)。

圖1 DEGs火山圖注:藍色為下調基因,紅色為上調基因

二、差異基因功能富集分析

使用DAVID網站進行基因聚類分析,GO功能注釋結果顯示,DEGs富集的生物學過程包括信號轉導(signal transduction)、免疫應答(immune response)、炎癥反應(inflammatory response)等,在細胞組成中,主要富集于質膜(plasma membrane)、細胞溶質(cytosol)、細胞外區(qū)域(extracellular region)、細胞外空間(extracellular space)等,分子功能包括蛋白質結合(protein binding)等(見圖2 )。KEGG通路分析結果顯示,DEGs主要富集于癌癥通路、PI3K/Akt信號通路、MAPK信號通路等(見圖3)。

圖3 DEGs的KEGG分析

三、蛋白互作網絡構建與關鍵基因的篩選

采用STRING平臺對已獲取的249個DEGs進行蛋白互作網絡的構建,去除網絡中游離的蛋白質,通過Cytoscape軟件(https://cytoscape.org/)的CytoHubba 插件分別使用MCC、Degree、Closeness、Betweenness、Radiality方法篩選前30個基因(見表1),并取交集獲得10個關鍵基因:IL-10、IRF4、JUN、PTK2、TNF、KDR、CXCL8、SMAD3、NOTCH1、RPS27A(見圖4),其中IL-10、IRF4、CXCL8為下調基因,JUN、PTK2、TNF、KDR、SMAD3、NOTCH1、RPS27A為上調基因。

表1 5種算法篩選的前30個基因

圖4 5種算法取交集獲得10個關鍵基因

四、中藥預測結果

將關鍵基因輸入 Coremine Medical 數(shù)據(jù)庫中,下載相關的中藥信息(見表2),其中去除PTK2、RPS27A后剩余關鍵基因在平臺預測得到黃芩、黃芪、茶樹根,通過關鍵基因關聯(lián)中藥數(shù)據(jù)取交集,同時與其中七個及以上基因關聯(lián)的中藥有丹參、人參、人參花、人參葉、人參蘆、靈芝、黃芩、黃芪、茶樹根等多味中藥。

表2 關鍵基因的中藥預測

討 論

肺纖維化是COVID-19患者的長期并發(fā)癥之一,新冠病毒主要通過鼻腔的上皮細胞傳播到呼吸系統(tǒng),感染肺部Ⅱ型肺泡細胞,引起DAD,進一步發(fā)展導致成纖維細胞增殖和上皮間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT),隨后肌成纖維細胞灶形成、細胞外基質(extracellular matrix,ECM)積累,最終導致肺纖維化的形成。診斷肺纖維化后的中位生存期僅為2～3年,抗纖維化藥物如尼達尼布和吡非尼酮正處于臨床試驗階段,肺移植可能是最終的治療手段[5-8]。本研究共篩選出249個DEGs,其中125個為上調基因,124個為下調基因。通過5種算法取交集篩選出10個關鍵基因:IL-10、IRF4、JUN、PTK2、TNF、KDR、CXCL8、SMAD3、NOTCH1、RPS27A。

IL-10基因編碼的蛋白質是一種細胞因子,主要由單核細胞產生,少量由淋巴細胞產生。具有抗炎及抗纖維化作用。轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)是纖維化發(fā)展的主要介質,可增強成纖維細胞趨化和增殖、誘導成纖維細胞合成膠原蛋白、抑制ECM降解[9-10]。TGF-β有3種亞型:TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3,雖然這些亞型的生物學功能是一體的,但TGF-β1在肺纖維化中起主要作用。IL-10主要通過抑制肺泡巨噬細胞TGF-β1的產生從而抑制肺纖維化[11]。PTK2基因編碼一種細胞質蛋白酪氨酸激酶2(PTK2),PTK2主要通過整合素β1介導成纖維細胞遷移,在肺纖維化中起重要作用[12]。腫瘤壞死因子(TNF)是一種多效細胞因子,有跨膜和可溶性兩種形式,可溶性形態(tài)在TGF-β1表達和纖維化病變形成中起作用,研究證實,TNF-α與COVID-19肺炎后肺纖維化存在顯著相關[13]。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)主要有兩種受體,即 VEGFR1(Fms-like tyrosine kinase-1,Flt-1)和VEGFR2(Fetal liver Kinase-1/Kinase Domain-containing Receptor,Flk-1/KDR),KDR基因編碼VEGRF2,VEGF/VEGFR2通路在肺間質纖維化異常血管形成過程中起主要作用[14]。SMAD3是TGF-β的下游受體調節(jié)型蛋白,激活后可促進成纖維細胞轉化為肌成纖維細胞,增強ECM的沉積,誘發(fā)肺組織纖維化樣改變[15]。周細胞-肌成纖維細胞轉變(pericyte-myofibroblast transition,PMT)的特征是周細胞從內皮細胞分離,遷移到間質空間并轉變?yōu)榧〕衫w維細胞,研究表明,NOTCH1通過PDGFRβ/ROCK1信號通路促進周細胞的增殖并向肌成纖維細胞分化從而促進肺纖維化[16]。

KEGG結果顯示,DEGs主要在癌癥、PI3K/Akt、MAPK等通路富集。在臨床上,患者同時患有肺纖維化和肺癌是很常見的,兩者存在一些共同的生物學途徑,如PI3K/Akt信號通路等[17]。PI3K/Akt信號通路是調控細胞生長、增殖、運動、代謝和生存的核心信號通路之一。PI3K可分為3類,Ⅰ類PI3Ks是由p110催化亞基和P85調節(jié)亞基形成的異源二聚體,存在四種亞型,包括ⅠA類(PI3Ka, PI3Kb和PI3Kd)和ⅠB類(PI3Kg)。這四種亞型均可在人肺成纖維細胞中表達,其中PI3Ka常在肺相關疾病中上調或突變,PI3Kg常在特發(fā)性肺纖維化肺勻漿和成纖維細胞中過表達,而Ⅲ類PI3Ks參與自噬體膜的形成,可能影響肺纖維化。Akt有3種亞型:Akt1, Akt2和Akt3,可被上游PI3K激活。由于Akt3主要在腦組織中表達,有關肺纖維化的研究主要集中在Akt1和Akt2亞型上。Akt1介導的線粒體自噬有助于肺泡巨噬細胞凋亡抵抗,這對于肺纖維化的發(fā)展是必需的,而Akt2缺失的小鼠對博萊霉素誘導的肺纖維化和炎癥具有保護作用,說明PI3K/Akt信號通路在肺纖維化發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[18]。MAPK廣泛分布于哺乳動物細胞中,該通路在炎癥、纖維化、腫瘤等一系列疾病中發(fā)揮重要作用。MAPK信號通路與多種主要器官的纖維化有關,如心肌纖維化、腎纖維化、肺纖維化等。研究發(fā)現(xiàn),該通路可能通過介導TGF-β誘導的EMT發(fā)揮促纖維化作用[19]。

以關鍵基因預測得到黃芩、黃芪、茶樹根、人參、靈芝、丹參等具有潛在療效的中藥,目前,人參皂苷元AD-1、黃芪-丹參藥對、丹芍化纖膠囊(由丹參、赤芍、黃芪、銀杏葉等組成)等在肺纖維化動物模型中均被證實有確切的抗纖維化療效[20-22]。

綜上所述,本研究篩選出了重癥COVID-19肺炎肺纖維化相關的關鍵基因及預測了潛在的治療性中藥,為臨床治療的研究提供了參考,但仍需進一步實驗來驗證關鍵基因及相關中藥的治療作用。