占鵬飛，趙 輝，霍進(jìn)喜，吳偉杰，鐘 石，陳慧芝，潘美良，牛 犇，馬煥艷，李有貴，孫雨晴＊

（1. 湖州市農(nóng)業(yè)科技發(fā)展中心，浙江 湖州 313000；2. 中國(guó)計(jì)量大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310018；3. 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，浙江 杭州 310021；4. 浙江省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，浙江 杭州 310020）

桑樹(shù)是我國(guó)的特色經(jīng)濟(jì)作物，桑葉除了可以用來(lái)養(yǎng)蠶外，還是一種傳統(tǒng)中藥材。桑葉含有多酚、生物堿、多糖、黃酮等多種藥效成分［1］，具有抗氧化［2］、降血糖［3-4］、抗衰老和降血脂［5］等多種功效。多酚是桑葉功效物質(zhì)之一，可以清除多種自由基，發(fā)揮抗氧化［2］、抗衰老［5］、降血糖［6］等作用，因此多酚含量是桑葉品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。桑葉多酚常用的提取方法有蒸煮法、微波提取法、超聲波提取法等，但已經(jīng)報(bào)道的各研究方法的優(yōu)化條件存在很多差異，且各有側(cè)重的考察因素，尤其是微波、超聲波等的提取方法中因?yàn)閮x器型號(hào)、功率等的不同造成提取率和測(cè)定含量差異較大。本研究采用簡(jiǎn)單易行、對(duì)設(shè)備要求最低的蒸煮提取法，并利用單因素試驗(yàn)研究粉碎粒度、提取溶劑、提取溫度、提取時(shí)間對(duì)福林酚法測(cè)定桑葉多酚含量的影響，明確最優(yōu)提取條件，考察該提取測(cè)定方法的精確度、重復(fù)性、回收率、中間精確度等參數(shù)，為在常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)定桑葉多酚提供方法參考和依據(jù)。最后，用獲得的最優(yōu)提取測(cè)定方法測(cè)定20 個(gè)桑品種在不同時(shí)間點(diǎn)的桑葉多酚含量，并將桑葉多酚含量與降糖活性成分1-脫氧野尻霉素（Deoxynojirimycin，DNJ）進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，闡述桑葉多酚在不同品種、不同季節(jié)下的變化規(guī)律以及與DNJ的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

含量測(cè)定方法優(yōu)化研究所用桑葉品種為‘強(qiáng)桑1號(hào)’，2021年8月采摘自浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院桑園試驗(yàn)區(qū)。多酚含量測(cè)定的不同桑品種見(jiàn)表1，分別于2022年4月25日、2022年5月9日、2022年8月10 日采摘自浙江省農(nóng)科院桑園試驗(yàn)區(qū)。桑葉于60 ℃以下溫度烘干后使用。

表1 桑品種表Table 1 Mulberry varieties

1.2 主要試劑

沒(méi)食子酸購(gòu)于上海麥克林生化科技有限公司，DNJ、氯甲酸-9-芴基甲酯購(gòu)于德國(guó)Sigma公司，福林酚試劑購(gòu)于北京華科盛精細(xì)化工產(chǎn)品貿(mào)易有限公司；碳酸鈉、乙腈、硼酸鉀、甘氨酸、乙酸、乙醇、甲醇等均為分析純。

1.3 多酚含量的測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：精確稱取沒(méi)食子酸對(duì)照品25 mg于50 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度線處，精確量取5 mL置于50 mL量瓶中，用水稀釋至刻度線處，搖勻，即得沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液（0.05 mg/mL 沒(méi)食子酸溶液）。精確量取對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置于10 mL 離心管中，各加入福林酚試劑0.2 mL，再分別加水2.3、2.2、2.0、1.8、1.6、1.4 mL，加入2.4 mL 29%碳酸鈉溶液，搖勻，放置30 min，以相應(yīng)的試劑為空白，在760 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，以吸光度值為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品測(cè)定：精確量取樣品溶液0.4 mL 于10 mL離心管中，分別加入福林酚試劑0.2 mL、水2 mL、29%碳酸鈉溶液2.4 mL，搖勻，放置30 min，室溫下3 500×g離心5 min，取上清液，以相應(yīng)的試劑為空白，測(cè)定760 nm 處吸光度值；從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出供試品溶液中多酚濃度，根據(jù)樣品稀釋倍數(shù)換算成干燥桑葉粉中多酚的含量，多酚含量以沒(méi)食子酸（Gallic acid，GAE）當(dāng)量計(jì)算。

式中桑葉粉以干質(zhì)量計(jì)，測(cè)定液多酚濃度單位為mg/mL，提取液體積單位為mL，桑葉粉質(zhì)量為g。

1.4 桑葉多酚含量在不同提取條件下的單因素考察

1.4.1 粉碎粒度考察

桑葉粉碎后，精確稱取過(guò)30 目篩或80 目篩的粉末1 g，置錐形瓶中，加70%乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，60 ℃水浴加熱1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用提取溶劑補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，精確量取續(xù)濾液2 mL，置10 mL 量瓶中，用70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得待測(cè)樣品。各平行3份操作，測(cè)定多酚含量。

1.4.2 提取溶劑考察

精確稱取過(guò)80目篩的桑葉粉1 g，置錐形瓶中，加入不同溶劑（水、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇）50 mL，后續(xù)步驟按照1.4.1 粉碎粒度考察中所述方法提取桑葉多酚并測(cè)定多酚含量，各平行3份操作。

1.4.3 料液比考察

精確稱取過(guò)80目篩的桑葉粉1 g，置錐形瓶中，加入不同體積（50、60、70 mL）70%乙醇，后續(xù)步驟按照1.4.1 粉碎粒度考察中所述方法提取桑葉多酚并測(cè)定多酚含量，各平行3份操作。

1.4.4 提取溫度考察

精確稱取過(guò)80目篩的桑葉粉1 g，置錐形瓶中，加入50 mL 的70%乙醇，稱定質(zhì)量，不同溫度（60、70、80 ℃）水浴加熱1 h，后續(xù)步驟按照1.4.1粉碎粒度考察中所述方法提取桑葉多酚并測(cè)定多酚含量，各平行3份操作。

1.4.5 提取時(shí)間考察

精確稱取過(guò)80目篩的桑葉粉1 g，置錐形瓶中，加入50 mL 的70%乙醇，稱定質(zhì)量，在80 ℃水浴中加熱回流為不同時(shí)間（1 h、2 h、3 h），后續(xù)步驟按照1.4.1 粉碎粒度考察中所述方法提取桑葉多酚并測(cè)定多酚含量，各平行3份操作。

1.4.6 精確度考察

精確稱取過(guò)80目篩的桑葉粉1 g，置錐形瓶中，加入50 mL 的70%乙醇，稱定質(zhì)量，80 ℃加熱回流1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，精確量取續(xù)濾液2 mL，置10 mL 量瓶中，用70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得待測(cè)樣品。精確量取同一待測(cè)樣品溶液0.4 mL 6份于6支10 mL離心管中，分別測(cè)定多酚含量。

1.4.7 重復(fù)性考察

精確稱取6份過(guò)80目篩的桑葉粉1 g，置錐形瓶中，分別加入50 mL 的70%乙醇，稱定質(zhì)量，80 ℃加熱回流1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，精確量取續(xù)濾液2 mL，置10 mL量瓶中，用70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得待測(cè)樣品，分別測(cè)定6份樣品中多酚含量。

1.4.8 回收率考察

精確稱取過(guò)80 目篩的桑葉粉0.5 g，置錐形瓶中，加入一定量的沒(méi)食子酸（相當(dāng)于0.5 g 樣品含量的80%、100%、120%，各平行操作3份），加入70%乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，80 ℃加熱回流1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，精確量取續(xù)濾液2 mL，置10 mL 量瓶中，用70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，分別測(cè)定多酚含量。

1.4.9 中間精確度試驗(yàn)

由不同實(shí)驗(yàn)人員于不同時(shí)間取本品粉末約1 g，按重復(fù)性考察試驗(yàn)，平行操作6份，于不同儀器上測(cè)定。

1.5 桑葉DNJ的測(cè)定

桑葉粉碎過(guò)80 目篩，0.2 g 樣品加200 mL pH 2.0的0.1%乙酸緩沖液超聲提取20 min，10 000 r/min離心10 min，保留上清液；精確吸取樣品溶液10 μL，置1.5 mL離心管中，與10 μL 0.2 mol/L（pH=7）硼酸鉀緩沖液在1.5 mL試管中混合，加入20 μL 5 mmol/LFMOC-CL（溶解于乙腈中），迅速混勻并在室溫條件下反應(yīng)10 min。加10 μL 0.1 mol/L甘氨酸液終止反應(yīng)，待上樣。DNJ 標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma）為對(duì)照品，用0.1%乙酸緩沖液溶解后，稀釋成不同濃度，相同HPLC 條件下測(cè)定峰面積，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，桑葉中DNJ含量根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算。每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。

HPLC 分析條件為：分離柱SunFireTM C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相0.05%乙酸與乙腈的體積比為65∶35，柱溫為室溫，流速1 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，采用2414檢測(cè)器采集熒光信號(hào)，測(cè)定峰面積。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 16軟件統(tǒng)計(jì)，兩組之間比較采用Student's test，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。相關(guān)性分析采用皮爾遜法計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

以吸光度值為縱坐標(biāo)，沒(méi)食子酸含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=16.591x+0.071 1，R2=0.999 4，表明沒(méi)食子酸在25～250 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（圖1）。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 1 Standard curve

2.2 粉碎粒度考察

結(jié)果（圖2）表明，通過(guò)30 目篩粉末提取所測(cè)得的多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（10.31±0.52）mg/g，通過(guò)80 目篩的粉末所測(cè)得的多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（12.92±0.32）mg/g，因此選擇多酚含量更高的80 目篩為粉碎粒度。本研究沒(méi)有進(jìn)一步提高粉碎粒度是因?yàn)檫^(guò)粒度過(guò)細(xì)會(huì)導(dǎo)致后續(xù)過(guò)濾困難。

圖2 粉碎粒度對(duì)桑葉多酚含量的影響Fig. 2 Effect of pulverized particle size on polyphenol content in mulberry leaves

2.3 提取溶劑考察

結(jié)果（圖3）表明，水、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇提取所測(cè)得的多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為（10.24±0.41）、（11.82±1.82）、（12.80±0.822）、（6.53±0.53）mg/g，以70%乙醇為溶劑的提取效率最高，所以選取70%乙醇作為最優(yōu)提取溶劑。

圖3 提取溶劑對(duì)桑葉多酚含量的影響Fig. 3 Effect of extraction solvent on polyphenol content in mulberry leaves

2.4 液料比考察

結(jié)果（圖4）表明，提取1 g桑葉樣品加入提取溶劑40、50、60、70 mL 所測(cè)得多酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為（11.49±0.35）、（12.48±0.31）、（12.42±0.50）、（12.53±0.44）mg/g，提取溶劑用量達(dá)到50 mL 時(shí)提取效率不再提高，因此選用更加節(jié)省溶劑的50 mL作為提取溶劑的體積，即料液比為1∶50。

圖4 料液比對(duì)桑葉多酚含量的影響Fig. 4 Effect of solid-liquid ratio on polyphenol content in mulberry leaves

2.5 提取溫度考察

60 ℃、70 ℃、80 ℃提取測(cè)得的多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為（12.42±0.33）、（12.50±0.410）、（13.01±0.60）mg/g（圖5），80 ℃回流處理的多酚含量高于60 ℃、70 ℃，即隨著溫度的提高多酚提取率呈上升趨勢(shì)，但是由于提取溶劑為70%的乙醇，其沸點(diǎn)約為83 ℃，因此提取溫度不宜繼續(xù)提高，所以選取80 ℃回流處理作為提取溫度。

圖5 提取溫度對(duì)桑葉多酚含量的影響Fig. 5 Effect of temperature on polyphenol content of mulberry leaves

2.6 提取時(shí)間考察

結(jié)果（圖6）表明，提取時(shí)間1、2、3h 所測(cè)得多酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為（12.77±0.32）、（12.74±0.40）、（12.81±0.41）mg/g，3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間多酚含量的變化不大，因此選擇時(shí)間最短的1 h作為提取時(shí)間。

圖6 提取時(shí)間對(duì)桑葉多酚含量的影響Fig. 6 Effect of extraction time on polyphenol content in mulberry leaves

2.7 精確度考察

通過(guò)上述單因素試驗(yàn)，確定最優(yōu)提取條件為粉碎粒度80目、提取溶劑70%乙醇、料液比為1 g樣品對(duì)應(yīng)50 mL 溶劑（即1∶50）、提取溫度80 ℃、提取時(shí)間1 h，按照此提取方法提取桑葉多酚，取同一份桑葉粉提取液6 份測(cè)定多酚含量，如表2 所示，6 個(gè)平行測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 為1.26%，結(jié)果表明本方法精確度良好。

表2 桑葉多酚測(cè)定方法的精密度考察結(jié)果Table 2 Precision of the method for determining polyphenols in mulberry leaves

2.8 重復(fù)性考察

為了考察提取方法的考察重復(fù)性，在粉碎粒度80 目、提取溶劑70%乙醇、料液比1∶50、提取溫度80 ℃、提取時(shí)間1 h條件下提取6份桑葉粉并測(cè)定多酚含量。如表3所示，測(cè)得6份樣品的多酚含量RSD為2.38%，結(jié)果表明本提取測(cè)定方法的重復(fù)性良好。

表3 桑葉多酚測(cè)定方法的重復(fù)性考察結(jié)果Table 3 Repeatability of the determination method of mulberry leaf polyphenols

2.9 回收率考察

為了考察提取方法的回收率，粉碎粒度80目的6 份桑葉粉加入不同量沒(méi)食子酸標(biāo)品，并在提取溶劑70%乙醇、料液比1∶50、提取溫度80 ℃、提取時(shí)間1 h條件下分別考察加樣回收率。如表4所示，本方法的加樣回收率在96.30%～102.51%之間，RSD 為2.15，該結(jié)果表明本方法的準(zhǔn)確度良好。

表4 加樣回收率結(jié)果Table 4 The recovery rate of addition sample

2.10 中間精確度試驗(yàn)

為了考察不同操作環(huán)境下的中間精確度情況，試驗(yàn)采用不同實(shí)驗(yàn)員、不同儀器測(cè)定同樣樣品，結(jié)果（表5）表明2個(gè)實(shí)驗(yàn)人員的12份樣品含量RSD為2.28%，表明本方法中間精確度良好。

表5 中間精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Intermediate precision test results

2.11 不同品種、不同采收時(shí)間的桑葉中多酚含量

不同品種和采收時(shí)間桑葉多酚含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表6。由于‘荷葉白’‘農(nóng)桑14’‘強(qiáng)桑1號(hào)’為浙江省的主栽品種，因此本研究將相同采樣時(shí)間的不同品種的桑葉多酚含量分別與這3 個(gè)品種進(jìn)行了比較。其中‘浦六2 號(hào)’的多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)5 月上旬達(dá)到（27.18±1.07）mg/g，顯著高于同期‘荷葉白’‘農(nóng)桑14’‘強(qiáng)桑1 號(hào)’含量（P＜0.05），分別高出40.76%、31.88%、75.35%；其在所測(cè)20 種品種的3 個(gè)采樣時(shí)間中為最高值，且其4月下旬質(zhì)量分?jǐn)?shù)也高達(dá)26.06 mg/g，4 月、5 月、8 月3 個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)的平均值也高達(dá)（21.57±8.76）mg/g?！?2-53’桑品種的多酚含量也很高，其在3 個(gè)采收時(shí)間點(diǎn)的多酚平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高（21.97±4.30）mg/g，且8月上旬的多酚含量在同期采收桑品種中含量也最高。從采樣時(shí)間的平均多酚含量看，4 月、5 月、8 月3 個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)桑葉中多酚含量整體呈下降趨勢(shì)。

2.12 多酚含量與DNJ含量的相關(guān)性

我們?cè)跍y(cè)定這20種桑品種多酚含量的同時(shí)，也測(cè)定了DNJ 的含量，同樣也將不同品種的含量與浙江省主栽品種‘荷葉白’‘農(nóng)桑14’‘強(qiáng)桑1號(hào)’在相同采樣時(shí)間下進(jìn)行了比較。如表7 所示，不同品種桑葉的DNJ含量也存在很大差異?！R交1號(hào)’8月份的DNJ 含量質(zhì)量分?jǐn)?shù)（6.22±0.09）mg/g，在所測(cè)20 個(gè)品種的3 個(gè)采樣時(shí)間中也為最高值，與同期‘荷葉白’含量沒(méi)有顯著差異（P＞0.05），但是顯著高于同期‘農(nóng)桑14’和‘強(qiáng)桑1號(hào)’DNJ含量（P＜0.05），分別比二者含量提高67.65%和58.27%，其4月、5月、8月3個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)的平均值也為20 個(gè)品種中最高。DNJ 含量最低的為‘恒10’，其在5 月的質(zhì)量分?jǐn)?shù)甚至低至（0.02±0.00）mg/g，3 個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)的DNJ 質(zhì)量分?jǐn)?shù)均值也僅為（1.23±1.59）mg/g。從采樣時(shí)間的平均DNJ 含量看，8 月的桑葉DNJ 含量顯著高于4 月和5月，而4 月和5 月二者之間變化不大。通過(guò)與多酚含量的關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，DNJ 含量與多酚含量之間存在顯著的負(fù)相關(guān)（圖7）。

表7 不同品種主不同采樣時(shí)間桑葉DNJ含量Table 7 DNJ content in mulberry leaves of different varieties at different sampling times mg/g

圖7 桑葉多酚含量與DNJ含量的相關(guān)性Fig. 7 Correlation between polyphenol content and dnj content in mulberry leaves

3 討論

桑葉多酚提取測(cè)定方法研究已有多篇報(bào)道，但是所用方法和側(cè)重的考察條件各有不同。劉詠等［7］通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)水煮浸提法中的溫度、料液比、浸提時(shí)間及酸堿度等因素進(jìn)行優(yōu)化，綜合確定多酚、黃酮、多糖的同時(shí)提取的最佳條件為80 ℃、料液比1∶100、pH=10、浸提60 min。陳向陽(yáng)等［8］以蛋白桑葉為材料，用單因素試驗(yàn)研究了十二烷基硫酸鈉（Sodium lauryl sulfate，SDS）用量、超聲功率、超聲溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)等因素對(duì)多酚含量的影響，獲得最佳條件為超聲時(shí)間15 min，料液比1∶25，SDS 用量0.34%，超聲功率250 W，超聲溫度60 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，該條件下測(cè)定多酚含量達(dá)1.51%。祁偉亮等［9］采用超聲波輔助提取法，通過(guò)正交試驗(yàn)獲得最佳多酚提取條件為30%乙醇、提取時(shí)間70 min、超聲波溫度70 ℃、固液比1∶35。周昊等［10］利用超聲波和微波協(xié)同法提取桑葉總多酚，其最佳提取工藝為料液比1∶20，提取時(shí)間93 s，微波功率326 W，超聲波功率304 W。本研究采用簡(jiǎn)單易行、對(duì)試驗(yàn)設(shè)備要求最低的蒸煮法提取桑葉多酚，依次考察了桑葉的粉碎粒度、提取溶劑、料液比、提取溫度、提取時(shí)間等提取條件對(duì)多酚含量的影響，最后確定了粉碎粒度為過(guò)80目篩、料液比1∶50、70%乙醇80 ℃水浴加熱回流1 h的桑葉多酚提取條件。本方法沒(méi)有加入酸、堿、表面活性劑等物質(zhì)，也避免了微波超聲波等儀器型號(hào)和功率差異造成的提取效率差異，可以供絕大部分實(shí)驗(yàn)室參考和使用，測(cè)定結(jié)果便于不同的研究之間的數(shù)據(jù)相互參考比較。

利用本方法測(cè)定了本單位試驗(yàn)基地20 種桑品種在不同采收時(shí)間的多酚含量，發(fā)現(xiàn)不同品種桑葉間的多酚含量存在很大差異。這與其他研究中報(bào)道的不同品種［11］、不同產(chǎn)地［12］、不同采收時(shí)間［13］桑葉多酚含量變化大的結(jié)論相一致。本研究還發(fā)現(xiàn)所測(cè)品種的桑葉多酚在4 月下旬、5 月上旬、8 月上旬3個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)的含量在各品種中整體呈下降趨勢(shì)，8 月的含量最低。沈維治等［13］報(bào)道了廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院桑園基地的‘育2’‘紫白4’‘大10’‘湘7920’‘抗青10號(hào)’‘粵桑11號(hào)’6個(gè)品種的隨季節(jié)變化的規(guī)律，發(fā)現(xiàn)桑葉多酚于5 月過(guò)后逐漸下降，至7月、8 月份最低，然后又緩慢上升直至10 月的現(xiàn)象。本研究中所測(cè)桑品種變化規(guī)律與之相一致，推測(cè)這種現(xiàn)象很可能與氣溫和光照等變化相關(guān)。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)桑葉多酚含量最低的8 月，降血糖活性成分DNJ 含量卻最高，多酚含量與DNJ 呈負(fù)相關(guān)。這與崔夢(mèng)迪等［14］在陜西4個(gè)主栽桑品種中以及黃金枝等［15］在30 個(gè)江西栽培桑品種中發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)象相一致，但該現(xiàn)象的原因尚需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究?jī)?yōu)化了桑葉多酚的提取測(cè)定方法，確定了粉碎粒度為過(guò)80 目篩、料液比1∶50、70%乙醇80 ℃水浴加熱回流1 h的桑葉多酚提取條件，證明該方法具有較高的可重復(fù)性和準(zhǔn)確性。利用該方法測(cè)定了浙江省農(nóng)科院桑園基地中保留的20個(gè)桑品種資源在不同采樣時(shí)間的多酚含量，發(fā)現(xiàn)了不同桑品種在4月下旬、5月上旬和8月上旬的采樣時(shí)間下多酚含量逐漸降低的變化規(guī)律。同時(shí)，測(cè)定了這些品種在各采樣時(shí)間點(diǎn)的DNJ 含量，并與多酚含量進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析，明確了桑葉多酚與DNJ 呈負(fù)相關(guān)的關(guān)系。