劉 巖，林天寶，盧紅伶，朱 燕，計(jì)東風(fēng)，呂志強(qiáng)

（浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蠶桑與茶葉研究所，浙江 杭州 310021）

碳水化合物是植物生長發(fā)育過程中主要的碳源和供能物質(zhì)［1］，占干物質(zhì)總量的90%以上，對(duì)植物生命活動(dòng)有著極其重要的作用。碳水化合物包括結(jié)構(gòu)性碳水化合物和非結(jié)構(gòu)性碳水化合物兩大類。其中，非結(jié)構(gòu)性碳水化合物是光合作用的主要同化產(chǎn)物，其合成、運(yùn)輸和積累很大程度上決定植物能量循環(huán)、生長發(fā)育和對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力，是參與植物生命代謝的重要物質(zhì)［2-3］。非結(jié)構(gòu)性碳水化合物主要包括葡萄糖、果糖、蔗糖等可溶性糖（Soluble sugars，SS）和淀粉（Starch，ST）2類物質(zhì)?？扇苄蕴强芍苯訁⑴c植物生長、代謝過程，并具有調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓的作用；淀粉可作為短期或長期貯存的碳源，供給植物生長所需，可溶性糖與淀粉兩者之間還可以相互轉(zhuǎn)換［4-5］。

桑樹是一種多年生深根性木本闊葉型經(jīng)濟(jì)林木，在我國有悠久栽培歷史。桑葉作為家蠶完成全世代生長的天然飼料，是影響繭絲綢產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。我國作為種桑養(yǎng)蠶大國，蠶桑生產(chǎn)遍及全國1 000余縣，蠶桑產(chǎn)業(yè)還在脫貧攻堅(jiān)、鄉(xiāng)村振興和特色產(chǎn)業(yè)發(fā)展中起到重要作用［6-7］。近年來，隨著國家“一帶一路”重要倡儀的實(shí)施推進(jìn)，以及桑樹除了用來養(yǎng)蠶外，還在醫(yī)藥、食品、生態(tài)等領(lǐng)域進(jìn)行了多元化拓展，桑樹產(chǎn)業(yè)迎來新的發(fā)展機(jī)遇。生產(chǎn)上對(duì)適宜不同生長環(huán)境的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)高抗桑樹品種需求增加，而碳水化合物的含量和轉(zhuǎn)運(yùn)分配與植物產(chǎn)量、品質(zhì)相關(guān)，碳水化合物還參與鹽、旱、澇等逆境脅迫適應(yīng)性。測(cè)定桑樹非結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量具有重要生產(chǎn)指導(dǎo)意義。然而，目前對(duì)桑葉中非結(jié)構(gòu)性碳水化合物測(cè)定方法報(bào)道較少。為此，本研究開展對(duì)比分析和優(yōu)化桑葉非結(jié)構(gòu)性碳水化合物的測(cè)定方法，為今后開展桑樹理化性質(zhì)研究和品種相關(guān)的生產(chǎn)應(yīng)用提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

以資源圃種植10 年生的‘強(qiáng)桑1 號(hào)’桑樹品種為研究對(duì)象，于2022年5月中旬采集枝條自上而下第4～7位完全展開葉片，清洗干凈并擦干，液氮研磨后-80 ℃低溫冷凍保存，備用。

1.2 可溶性糖抽提

1.2.1 乙醇抽提法

參考文獻(xiàn)［8］方法進(jìn)行改進(jìn)方法如下：取適量冷凍保存的桑葉粉，加入1.4 mL體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇，70 ℃分別恒溫振蕩，10 000g離心10 min，收集上清液用于可溶性糖的測(cè)定。

1.2.2 甲醇抽提法

參考文獻(xiàn)［9］取適量冷凍保存的桑葉粉，加入1.4 mL的75%（V/V）甲醇，70 ℃分別恒溫振蕩抽提，10 000g離心10 min，上清液吸出并分別轉(zhuǎn)入10 mL離心管，加入1.5 mL預(yù)冷的雙蒸水和750 μL的三氯甲烷，充分渦旋振蕩，10 000g離心10 min，收集上層上清液用于可溶性糖的測(cè)定。

參考文獻(xiàn)［10-11］方法，取適量冷凍保存的桑葉粉，加入1.4 mL 的MCW 抽提液（甲醇∶氯仿∶水=12∶5∶3，體積比），70 ℃恒溫振蕩抽提，10 000g離心10 min，各組上清液吸出并分別轉(zhuǎn)入2 mL離心管，加入800 μL 預(yù)冷的雙蒸水，充分渦旋震蕩，10 000 g離心10 min，收集各組上清液用于可溶性糖的測(cè)定。

1.2.3 可溶性糖抽提條件的優(yōu)化對(duì)比

設(shè)置不同抽提時(shí)間（0.5、1、3 h）和不同抽提次數(shù)，檢測(cè)對(duì)比優(yōu)化可溶性糖抽提條件。

1.3 淀粉抽提

參考文獻(xiàn)［8］報(bào)道的淀粉測(cè)定方法，將上述可溶性糖抽提離心后的沉淀殘?jiān)?，在通風(fēng)處干燥10 min，然后各管分別加入1 mL熱蒸餾水，沸水浴煮15 min，然后再加入0.5 mL 9.2 mol/L的高氯酸溶液，沸水?dāng)嚢?5 min。室溫自然冷卻后，4 000 r/min離心5 min，收集上清液測(cè)定淀粉含量。

1.4 蒽酮比色法測(cè)定碳水化合物含量

配制硫酸蒽酮溶液，利用蒽酮比色法［12］，配制不同濃度葡萄糖和可溶性淀粉溶液，取標(biāo)準(zhǔn)液或一定稀釋后的抽提液，加入3倍體積的蒽酮試劑，混勻后沸水浴中5 min，然后水浴冷卻至室溫，在分光光度計(jì)測(cè)定D（620 nm）值，根據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算可溶糖和淀粉含量。

1.5 數(shù)據(jù)分析

可溶性糖與淀粉兩者含量之和即為非結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量，兩者之商即為SS/ST［13-14］。測(cè)得的可溶性糖、淀粉和非結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量及SS/ST實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析，用OriginPro 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于乙醇抽提的可溶性碳水化合物含量檢測(cè)

利用80%乙醇對(duì)桑葉樣品的可溶性碳水化合物進(jìn)行抽提，檢測(cè)數(shù)據(jù)顯示隨著振蕩抽提時(shí)間的延長，檢出可溶性碳水化合物濃度逐漸增加（圖1）。上述抽提液經(jīng)氯仿萃取處理后，可溶性碳水化合物溶液脫色明顯；脫色后測(cè)定可溶性碳水化合物含量略有下降，這可能與色素干擾測(cè)定結(jié)果有關(guān)。

圖1 乙醇法抽提可溶性碳水化合物Fig. 1 The extraction of water soluble carbohydrates based on ethanol

2.2 基于甲醇抽提的可溶性碳水化合物含量檢測(cè)

由檢測(cè)數(shù)據(jù)（圖2）顯示，隨著抽提時(shí)間的延長，甲醇介導(dǎo)的可溶性碳水化合物抽提檢測(cè)得率呈現(xiàn)增加；比較75%甲醇和MCW 介導(dǎo)的方法發(fā)現(xiàn)，本研究單次抽提0.5-3 h的處理時(shí)，前者檢測(cè)可溶性糖水化合物含量水平高于后者，但隨著抽提次數(shù)的增加，利用MCW 方法組抽提得率增加顯著，而利用75%抽提的樣品僅在抽提1 h 重復(fù)2 次組呈現(xiàn)相對(duì)明顯的檢測(cè)值增加。

圖2 甲醇法抽提可溶性碳水化合物Fig. 2 The extraction of water soluble carbohydrates based on methanol

2.3 不同方法測(cè)定的淀粉含量

對(duì)上述不同方法抽提可溶性碳水化合物后的殘?jiān)?，烘干后利用高氯酸介?dǎo)的方法抽提淀粉，并結(jié)合硫酸蒽酮方法測(cè)定淀粉含量。結(jié)果（圖3）顯示，隨著抽提時(shí)間的延長，淀粉含量測(cè)量值呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，與測(cè)得的可溶性碳水化合物趨勢(shì)不同。

圖3 淀粉含量測(cè)定對(duì)比Fig. 3 Comparison of the starch content treated with different method

3 討論

非結(jié)構(gòu)性碳水化合物是植物體內(nèi)碳水化合物的一種重要存在形式，在植物生長代謝中起重要作用［5］。本研究利用80%乙醇、75%甲醇和MCW 介導(dǎo)的不同抽提方法，并設(shè)置不同抽提條件對(duì)桑葉中非結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量進(jìn)行對(duì)比檢測(cè)分析。從結(jié)果的綜合對(duì)比來看，乙醇抽提方法獲得的非結(jié)構(gòu)性碳水化合物濃度最高，其次是MCW 抽提產(chǎn)物，75%甲醇抽提得到產(chǎn)物濃度最低；從可溶性碳水化合物與淀粉含量的比率對(duì)比發(fā)現(xiàn)，75%甲醇單次抽提組SS/ST高于乙醇和MCW處理組，且多次抽提組的SS/ST數(shù)值更高，提示利用甲醇介導(dǎo)抽提可溶性糖分的方法的更完全，這與Wang 等在蘋果糖分檢測(cè)分析中的報(bào)道一致［9］。另外，盡管本研究中乙醇抽提產(chǎn)物中測(cè)定可溶性糖分含量高于另外2 種測(cè)定方法，但經(jīng)三氯甲烷萃取脫色后，可溶性糖的測(cè)定值下降（圖1）。推測(cè)這可能與抽提產(chǎn)物中葉綠素素含量較高，影響可溶性碳水化合物測(cè)定，以及非結(jié)構(gòu)性碳水化合物總量和比值的統(tǒng)計(jì)有關(guān)。綜合對(duì)比分析后發(fā)現(xiàn)，MCW多次重復(fù)抽提和75%甲醇抽提的及檢測(cè)效果更佳；其中，75%甲醇抽提方法更為高效快速，適合用于桑葉非結(jié)構(gòu)性碳水化合物的測(cè)定分析。

非結(jié)構(gòu)性碳水化合物與植物器官間碳平衡、以及逆境脅迫條件下的響應(yīng)性都密切相關(guān)［4］。植物各器官中非結(jié)構(gòu)性碳水化合物的濃度與不同生長環(huán)境下的植物光合固碳以及呼吸分泌等的耗碳相關(guān)［15］，對(duì)維持樹木滲透調(diào)節(jié)、生長發(fā)育，以及植物氮吸收能力和環(huán)境脅迫反應(yīng)都具有重要作用［16］。我們前期研究已發(fā)現(xiàn)，受鹽、旱共脅迫后，桑苗總碳含量在源器官葉片中下降，在庫器官根部中增加；源庫器官中差異表達(dá)蛋白主要富集在蔗糖等代謝通路［17］。碳水化合物相關(guān)代謝通路在雜交桑受干旱脅迫反應(yīng)中也起重要作用［18］。李思源等也報(bào)道桑苗幼苗葉片內(nèi)可溶性糖含量隨水淹時(shí)間增加呈現(xiàn)先增后減趨勢(shì)，具有一定耐水淹能力［19］。Mac-Neill 等認(rèn)為淀粉濃度的升高也提升了林木抗旱能力［4］，這可能與脅迫條件有關(guān)，光合固碳能力下降后，植物選擇優(yōu)先將光合產(chǎn)物貯藏起來，并分配參與滲透調(diào)節(jié)等過程，來抵抗脅迫環(huán)境有關(guān)［15］。這種非結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量和分配的調(diào)整，在一定程度上反映植物響應(yīng)逆境脅迫影響的變化，這與能量釋放、細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)有關(guān)，進(jìn)而在植物生長和脅迫響應(yīng)方面具有的重要影響作用［20-21］。

鑒于可溶性糖和淀粉在植物生命活動(dòng)過程中起重要作用，今后可在本研究確立適合桑葉樣品中的檢測(cè)方法基礎(chǔ)上，利用高效液相色譜（High performance liquid chromatography，HPLC）或 氣相色譜（Gas chromatography，GC）等技術(shù)進(jìn)一步分析可溶性碳水化合物各組分含量，再結(jié)合現(xiàn)代組學(xué)等生物技術(shù)，鑒定分析糖代謝關(guān)鍵性功能及基因，深入開展桑樹糖代謝相關(guān)的生理學(xué)、逆境生物學(xué)以及生產(chǎn)品種的選育工作。