龍劍文,張 晨,李楊璽宇

(1. 湖北中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床學(xué)院,湖北 武漢 430061;2. 湖北中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床學(xué)院,湖北 武漢 430061)

紫外線通過產(chǎn)生活性氧引起皮膚光老化,導(dǎo)致皮膚起皺和下垂[1],且能刺激皮膚黑色素細(xì)胞產(chǎn)生色沉,因此,防治皮膚光老化和減少皮膚色沉是皮膚科重要研究方向。蛻皮甾酮是中藥牛膝中甾酮類的主要成分[2],其具有良好的清除自由基和抗氧化活性[3],可抑制紫外線誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡和白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞退變[4-5]。牛膝具有顯著的抗衰老、養(yǎng)生與美容作用[6],蛻皮甾酮作為中藥牛膝的主要成分之一,是否具有抗光老化和抗黑色素生成作用尚不清楚。本研究以角質(zhì)形成細(xì)胞(HaCaT細(xì)胞)、黑素細(xì)胞(B16F10細(xì)胞)和人真皮成纖維細(xì)胞(HDF細(xì)胞)為研究對象,觀察了蛻皮甾酮抗光老化和抗黑色素生成的作用,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1材料 蛻皮甾酮(純度≥95%),中國藥品生物制品檢定所生產(chǎn),批號(hào):111638-202102。 HaCaT細(xì)胞株、B16F10細(xì)胞株和HDF細(xì)胞株均購于武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.2試劑和儀器 0.25%胰酶、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購于美國Gibco公司。MTT試劑盒購于Abcam公司。Hoechst 33258為美國Sigma公司產(chǎn)品。Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司?；|(zhì)金屬蛋白酶-1(MMP-1)抗體(GTX636661,1∶3 000)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)抗體(GTX100458,1∶2 000)、環(huán)氧化酶-2(COX-2)抗體(GTX100656,1∶2 000)、Ⅰ型膠原蛋白Iα1肽鏈(COL1A1)抗體(GTX112731,1∶1 000)、透明質(zhì)酸合成酶2(HAS-2)抗體(GTX01068,1∶1 000)、沉默調(diào)節(jié)蛋白1(Sirt-1)抗體(GTX00951,1∶1 000)、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶1(TGM1)抗體(GTX32921,1∶1 000)、GAPDH( GTX100118,1∶3 000) 均購于美國GeneTex公司;蘑菇酪氨酸酶購于美國 Sigma-Aldrich公司;左旋多巴、熊果苷購于麥克林公司;人α-黑色素細(xì)胞刺激素(α-MSH)購于美國Sigma-Aldrich公司。UVB輻照儀為德國Waldmann Medizintechnik公司生產(chǎn),輻射波長為280～320 nm,工作強(qiáng)度為1.35 mW/cm2。3111型細(xì)胞培養(yǎng)箱購于美國熱電公司;BD FACSCanto Ⅱ型流式細(xì)胞儀購于美國BD FACScan 公司;SpectraMax250酶標(biāo)儀購于美國Molecular Devices公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1細(xì)胞存活率檢測 實(shí)驗(yàn)設(shè)正常對照組、1.0 μmol/L蛻皮甾酮組、1.5 μmol/L蛻皮甾酮組、2.0 μmol/L蛻皮甾酮組。將 HaCaT細(xì)胞、B16F10細(xì)胞和HDF細(xì)胞以1×105/L的密度接種于96孔板中,待細(xì)胞生長至80%融合時(shí),蛻皮甾酮各組加入相應(yīng)濃度的蛻皮甾酮處理24 h。然后每孔加入10 μL MTT孵育液培養(yǎng)3 h,棄去上清,加入100 μL MTT終止液(10%十二烷基硫酸鈉、10%鹽酸),8 h后在570 nm處使用紫外分光光度計(jì)測量吸光度。

1.3.2細(xì)胞凋亡檢測 實(shí)驗(yàn)設(shè)正常對照組、UVB組、1.0 μmol/L 蛻皮甾酮組、1.5 μmol/L蛻皮甾酮組、2.0 μmol/L蛻皮甾酮組。將HaCaT細(xì)胞以1×105/L的密度接種于96孔板中,待細(xì)胞生長至80%融合時(shí),蛻皮甾酮各組加入相應(yīng)濃度的蛻皮甾酮處理24 h。打開平皿蓋,除正常對照組外,其余組均在避光暗處進(jìn)行UVB照射(30 mJ/cm2),然后加入完全培養(yǎng)液,于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6 h。各組HaCaT細(xì)胞處理后,消化,洗滌,收集細(xì)胞,制備細(xì)胞懸液,冰浴避光中操作:采用結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞,使其密度為 5×104/L,加入 Annexin-FITC和PI,共同孵育15 min染色,1 h內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.3.3細(xì)胞凋亡形態(tài)觀察 收集處理后的HaCaT細(xì)胞,消化,洗滌,制備細(xì)胞懸液,密度為1×109/L,接種于培養(yǎng)瓶中,實(shí)驗(yàn)分組及HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)同1.3.2,UVB照射處理后,加入完全培養(yǎng)液,于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6 h,收集細(xì)胞并洗滌,4%多聚甲醛溶液固定后,PBS洗滌,Hoechst33258染色15 min,采用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài),并照相保存。

1.3.4HaCaT細(xì)胞中MMP-1、MMP-9、COX-2、Sirt-1蛋白表達(dá)Western blot檢測 實(shí)驗(yàn)分組及細(xì)胞培養(yǎng),處理同1.3.2。收集各組處理后的細(xì)胞,PBS 洗滌,冰上裂解 30 min,裂解后提取總蛋白,BCA 檢測試劑盒測定蛋白濃度。用10% SDS-PAGE分離蛋白并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,PBS洗膜,5%脫脂牛奶在室溫下封閉1 h。在4 ℃下用一抗孵育過夜,隨后用PBS洗滌膜3次,加入HRP結(jié)合的二抗在室溫下孵育2 h;洗膜;使用化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)顯示蛋白質(zhì)條帶,然后使用Image Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行定量分析。

1.3.5HaCaT細(xì)胞中HAS-2、TGM1和HDF細(xì)胞中COL1A1蛋白表達(dá)Western blot檢測 實(shí)驗(yàn)設(shè)正常對照組、1.0 μmol/L蛻皮甾酮組、1.5 μmol/L蛻皮甾酮組、2.0 μmol/L蛻皮甾酮組。分別將HaCaT細(xì)胞、HDF細(xì)胞以1×105/L的密度接種于96孔板中,待細(xì)胞生長至80%融合時(shí),蛻皮甾酮各組加入相應(yīng)濃度的蛻皮甾酮處理24 h。收集各組細(xì)胞,按照1.3.4中方法檢測HAS-2、TGM1和COL1A1蛋白表達(dá)情況。

1.3.6黑色素生成和分泌測定 實(shí)驗(yàn)設(shè)正常對照組、黑色細(xì)胞刺激素組、1.0 μmol/L 蛻皮甾酮組、1.5 μmol/L蛻皮甾酮組、2.0 μmol/L蛻皮甾酮組、熊果苷組。將B16F10細(xì)胞0.5×105/孔接種于12孔板中,加入培養(yǎng)基,在加濕的5%CO2培養(yǎng)箱中,孵育12 h,更換培養(yǎng)基后,正常對照組:正常培養(yǎng);黑色細(xì)胞刺激素組加入100 nmol/L α-MSH;1.0 μmol/L蛻皮甾酮組加入1.0μmol/L 蛻皮甾酮+100nmol/Lα-MSH;1.5 μmol/L 蛻皮甾酮組加入1.5 μmol/L蛻皮甾酮+100 nmol/L α-MSH;2.0 μmol/L蛻皮甾酮組加入2.0 μmol/L蛻皮甾酮+ 100 nmol/L α-MSH ;熊果苷組加入1 mmol/L熊果苷+100 nmol/L α-MSH ,處理B16F10細(xì)胞48 h。黑色素分泌情況測定方法:使用Spectramax 250微孔板讀取器,在475 nm處測量細(xì)胞培養(yǎng)基的吸光度值。黑色素生成情況測定方法:用冷PBS洗滌細(xì)胞并收獲細(xì)胞,用20 mL細(xì)胞裂解緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl pH 7.5、20 mmol/L NaF、25 mmol/L β-甘油磷酸pH 7.5、120 mmol/L NaCl、2%NP-40和蒸餾水)裂解細(xì)胞,并在12 000 r/min下離心10 min。去除上清液,將顆粒溶解在100 μL 1 mol/L NaOH(含有10%二甲基亞砜)中,60 ℃持續(xù)30 min,使用Spectramax 250微孔板讀取器,在405 nm處測量吸光度值。

1.3.7酪氨酸酶活力測定 實(shí)驗(yàn)設(shè)正常對照組、左旋多巴組、1.0 μmol/L 蛻皮甾酮組、1.5 μmol/L蛻皮甾酮組、2.0 μmol/L蛻皮甾酮組。在加濕的5%CO2培養(yǎng)箱中,蛻皮甾酮各組將蘑菇酪氨酸酶(100 IU/mL)與相應(yīng)濃度蛻皮甾酮共同孵育30 min,然后除正常對照組外,其余組均加入左旋多巴(2 mmol/L)處理5 min。使用SpectraMax 250微板讀取器測量混合物在475 nm處的吸光度值即為酪氨酸酶活性。

2 結(jié) 果

2.1各組HaCaT細(xì)胞、B16F10細(xì)胞、HDF細(xì)胞增殖存活率比較 HaCaT細(xì)胞存活率分別為(97.74±2.36)%、(98.50±2.18)%、(97.89±1.89)%、(97.40±1.89)%,B16F10細(xì)胞存活率分別為(98.36±2.19)%、(98.18±1.57)%、(97.53±2.38)%、(97.34±0.90)%,HDF細(xì)胞存活率分別為(98.52±2.12)%、(97.94±2.26)%、(96.63±2.13)%、(96.55±1.84)%,各組間各細(xì)胞存活率比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。因此選定1.0 μmol/L、1.5 μmol/L、2.0 μmol/L蛻皮甾酮進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2各組HaCaT細(xì)胞凋亡情況及形態(tài)比較 UVB組細(xì)胞凋亡率明顯高于正常對照組(P<0.05);蛻皮甾酮各組細(xì)胞凋亡率均明顯低于UVB組(P均<0.05);蛻皮甾酮各組間細(xì)胞凋亡率呈濃度依賴性降低,組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。Hoechst33258染色顯示正常對照組HaCaT細(xì)胞大而飽滿,呈均勻藍(lán)色熒光;UVB組HaCaT細(xì)胞變小,胞核皺縮、碎裂,染色質(zhì)濃縮,聚集在核膜邊緣,出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài);蛻皮甾酮各組隨著蛻皮甾酮濃度增高,HaCaT細(xì)胞凋亡形態(tài)明顯減少。見圖1。

1為正常對照組;2為UVB組;3為1.0 μmol/L 蛻皮甾酮組;4為1.5 μmol/L蛻皮甾酮組;5 為2.0 μmol/L蛻皮甾酮組圖1 正常對照組和 UVB輻射各組HaCaT細(xì)胞凋亡情況

2.3各組HaCaT細(xì)胞中MMP-1、MMP-9、COX-2、Sirt-1蛋白表達(dá)情況比較 與正常對照組比較,UVB組HaCaT細(xì)胞中MMP-1、MMP-9、COX-2蛋白相對表達(dá)量均明顯升高(P均<0.05),Sirt-1蛋白相對表達(dá)量明顯降低(P均<0.05);與UVB組比較,蛻皮甾酮各組 HaCaT細(xì)胞中MMP-1、MMP-9、COX-2蛋白相對表達(dá)量均明顯降低(P均<0.05),Sirt-1蛋白相對表達(dá)量均明顯升高(P均<0.05);蛻皮甾酮各組間MMP-1、MMP-9、COX-2、Sirt-1蛋白相對表達(dá)量呈濃度依賴性升高或降低,組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見圖2。

1為正常對照組;2為UVB組;3為1.0 μmol/L 蛻皮甾酮組;4為1.5 μmol/L蛻皮甾酮組;5 為2.0 μmol/L蛻皮甾酮組圖2 正常對照組和 UVB輻射各組HaCaT細(xì)胞中光老化相關(guān)蛋白表達(dá)情況

2.4各組HaCaT細(xì)胞中HAS-2、TGM1蛋白和HDF細(xì)胞中COL1A1蛋白表達(dá)情況比較 蛻皮甾酮各組HaCaT細(xì)胞中HAS-2、TGM1蛋白相對表達(dá)量和HDF細(xì)胞中COL1A1蛋白相對表達(dá)量均明顯高于正常對照組,且蛻皮甾酮各組間HaCaT細(xì)胞中HAS-2、TGM1蛋白相對表達(dá)量和HDF細(xì)胞中COL1A1蛋白相對表達(dá)量均呈濃度依賴性升高,組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見圖3。

1為正常對照組;2為1.0 μmol/L 蛻皮甾酮組;3為1.5 μmol/L蛻皮甾酮組;4 為2.0 μmol/L蛻皮甾酮組圖3 正常對照組和蛻皮甾酮各組HaCaT細(xì)胞中保濕相關(guān)蛋白和HDF細(xì)胞中膠原生成相關(guān)蛋白表達(dá)情況

2.5各組B16F10細(xì)胞黑色素生成、分泌情況比較黑色細(xì)胞刺激素組B16F10細(xì)胞黑色素生成和分泌吸光度值均明顯高于正常對照組(P均<0.05),蛻皮甾酮各組和熊果苷組B16F10細(xì)胞黑色素生成和分泌吸光度值均明顯低于黑色細(xì)胞刺激素組(P均<0.05)。見圖4。

1為正常對照組;2為黑色細(xì)胞刺激素組;3為1.0 μmol/L 蛻皮甾酮組;4為1.5 μmol/L蛻皮甾酮組;5 為2.0 μmol/L蛻皮甾酮組;6為熊果苷組圖4 正常對照組和黑色細(xì)胞刺激素各組B16F10細(xì)胞黑色素生成、分泌情況

2.6各組蘑菇酪氨酸酶活性比較 左旋多巴組蘑菇酪氨酸酶活性明顯高于正常對照組(P<0.05),蛻皮甾酮各組蘑菇酪氨酸酶活性均明顯低于左旋多巴組(P均<0.05)。見圖5。

1為正常對照組;2為左旋多巴組;3為1.0 μmol/L 蛻皮甾酮組;4為1.5 μmol/L蛻皮甾酮組;5 為2.0 μmol/L蛻皮甾酮組圖5 正常對照組和左旋多巴各組蘑菇酪氨酸酶活性

3 討 論

蛻皮甾酮是一種天然存在的類固醇,具有抗內(nèi)毒素[7]、調(diào)節(jié)糖脂代謝[8]、改善心肌缺血[9]、保護(hù)血管內(nèi)皮[10]等多種作用,在醫(yī)療保健領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用。胡惠清等[11]研究表明,蛻皮甾酮能顯著抑制紫外線輻射后HaCaT細(xì)胞中MMP-l和MMP-9蛋白的表達(dá)。紫外線輻射在皮膚光老化和黑色素生成中發(fā)揮著重要作用[12],據(jù)此推測蛻皮甾酮具有抗皮膚光老化作用,為了進(jìn)行驗(yàn)證,筆者進(jìn)行了相關(guān)研究。

MMPs作為一類作用廣泛的間質(zhì)膠原酶,對真皮的Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維有明顯降解作用[13],與皮膚光老化密切相關(guān)。COX-2在光老化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用,光老化皮損中COX-2的表達(dá)明顯增高[14]。Sirt-1 是皮膚衰老表觀修飾的一個(gè)重要調(diào)控靶點(diǎn),光老化皮損中Sirt-1的表達(dá)明顯降低[15]。此外,保持充足的皮膚水化和生成新的膠原蛋白是維持健康皮膚的重要過程,相關(guān)研究顯示保濕相關(guān)蛋白如HAS-2和TGM1[16]、膠原蛋白COL1A1在光老化皮損中表達(dá)顯著減少[17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在所選濃度內(nèi),蛻皮甾酮對HaCaT細(xì)胞、B16F10細(xì)胞和HDF細(xì)胞的增殖無明顯影響,提示蛻皮甾酮細(xì)胞毒作用較弱。細(xì)胞凋亡及蛋白表達(dá)檢測顯示,蛻皮甾酮可明顯抑制UVB輻射后HaCaT細(xì)胞的凋亡及MMP-1、MMP-9、COX-2的表達(dá),促進(jìn)UVB輻射后HaCaT細(xì)胞中Sirt-1 的表達(dá),且蛻皮甾酮能顯著促進(jìn)HaCaT細(xì)胞中保濕相關(guān)蛋白HAS-2、TGM1和HDF細(xì)胞中膠原蛋白COL1A1的表達(dá),說明蛻皮甾酮對UVB輻射引起的角質(zhì)形成細(xì)胞炎癥及光老化有明顯抑制作用,并可影響保濕相關(guān)蛋白、膠原蛋白的表達(dá),具有保護(hù)皮膚作用。

盡管黑色素在保護(hù)皮膚免受紫外線輻射方面有重要作用,但大多數(shù)人群更喜歡使皮膚變亮變白,故如何抑制黑色素產(chǎn)生也是重點(diǎn)研究問題。本研究采用B16F10細(xì)胞檢測了蛻皮甾酮對黑色素產(chǎn)生和分泌的影響,結(jié)果顯示蛻皮甾酮能顯著減少α-MSH作用下B16F10細(xì)胞黑色素產(chǎn)生和分泌。蘑菇酪氨酸酶是最常作為人類酪氨酸酶的藥理檢測模型,它與哺乳動(dòng)物酪氨酸酶具有高度的同源性[18]。故本研究還觀察了蛻皮甾酮對蘑菇酪氨酸酶活力的影響,結(jié)果顯示蛻皮甾酮能顯著抑制蘑菇酪氨酸酶的活性。上述結(jié)果證實(shí)蛻皮甾酮能減少黑色素生成,具有一定的減少色沉作用。

綜上所述,蛻皮甾酮具有抗光老化、保濕和抗黑素生成活性,可以被認(rèn)為是一種良好的延緩皮膚衰老的候選藥物,但其抗光老化、保濕、抗黑素生成的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究明確。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。