謝桂元,劉向國(guó),方 芳,于芳春,吳柏合,趙晶燕,方 遠(yuǎn)

(安徽中醫(yī)藥大學(xué),安徽 合肥 230000)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種常見(jiàn)的呼吸系統(tǒng)疾病,常被認(rèn)為由肺衰老加速和炎癥反應(yīng)引起,目前已成為全球第三大死亡因素。COPD的肺部衰老主要有氧化應(yīng)激、細(xì)胞衰老與炎性衰老、端粒功能障礙和抗衰老分子等參與[1],其中炎性衰老可激活核因子κB (NF-κB)信號(hào)通路,引起腫瘤壞死因-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素- 6(IL-6)等相關(guān)炎性因子的表達(dá),促進(jìn)肺部炎癥和肺部衰老[2]。衰老相關(guān)分泌表型(SASP)最早由Coppé等[3]提出,可分泌一系列炎性細(xì)胞因子(TNF-α、IL-6等)、生長(zhǎng)因子、蛋白酶等,可刺激炎性反應(yīng)的發(fā)生,促使衰老。p53蛋白是衰老常見(jiàn)指標(biāo),其不僅可以通過(guò)下調(diào)TNF-α對(duì)機(jī)體衰老起調(diào)控作用,還可以通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)延緩COPD的發(fā)展進(jìn)程。沉默信息調(diào)節(jié)因子相關(guān)酶1(SIRT-1) 是一種組蛋白去乙?；?可以反向調(diào)控NF-κB信號(hào)通路炎性反應(yīng)的發(fā)生,再由NF-κB信號(hào)通路調(diào)控p53蛋白,其也可直接作用于p53蛋白,減少DNA損傷,抑制細(xì)胞衰老和炎癥反應(yīng),延緩SASP進(jìn)程,從而調(diào)控COPD肺部衰老的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程[4-5]。六味補(bǔ)氣方是安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院治療COPD的經(jīng)驗(yàn)方,本課題組前期研究證實(shí)該方可通過(guò)調(diào)節(jié)干擾素-γ(IFN-γ)、TLR4等增強(qiáng)免疫功能,減輕炎癥反應(yīng),延緩COPD的發(fā)展進(jìn)程[6-7]。但六味補(bǔ)氣方對(duì)于 COPD肺部衰老和SASP的影響機(jī)制研究尚不明確,故本研究基于SIRT-1/NF-кB/p53信號(hào)通路探討了六味補(bǔ)氣方對(duì)COPD大鼠肺部SASP的作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)大鼠60只,體重190～210 g,購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁殖有限公司,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(魯)20190003。所有大鼠飼養(yǎng)于安徽中醫(yī)藥大學(xué)新安醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物室,室溫19～24 ℃,濕度48%～62%。本實(shí)驗(yàn)已通過(guò)安徽中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核(動(dòng)物倫理編號(hào):AHUCM-rats-2021069)。

1.2藥物 六味補(bǔ)氣方組方:炙黃芪15 g、生曬參10 g、玉竹10 g、益智仁6 g、陳皮6 g、肉桂3 g(藥材購(gòu)自安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房),將上述藥物加入300 mL水浸泡50 min,武火沸騰換文火煎藥40 min,生曬參單獨(dú)煎。將藥湯倒至燒杯,置于水浴鍋中加溫濃縮,配置六味補(bǔ)氣方低、中、高劑量濃度分別為0.27 g/kg、0.52 g/kg、1.05 g/kg,相當(dāng)于臨床等效量的3.1,6.2,12.4倍;桂龍咳喘寧片(桂龍藥業(yè)安徽有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字Z20053135,規(guī)格:0.3 g/片)。

1.3主要試劑及儀器 脂多糖(LPS ,Solarbio生物科技公司, L8880);紅塔山香煙(焦油含量13 mg, 煙堿含量1.1 mg),滁州煙卷廠。IL-6 ELISA檢測(cè)試劑盒(武漢基因美科技有限公司,JYM0646Ra);TNF-α ELISA檢測(cè)試劑盒(武漢基因美科技有限公司,JYM0635Ra);NF-κB抗體(abcam,GR3422076-1);抗兔兩步法檢測(cè)試劑盒(ebiogo,11162110);SIRT-1(Bioworld,AAD33161);p53(bsm-33058M,AH06013022);山羊抗小鼠抗體(Zsbio,140193);山羊抗兔抗體(Zsbio,202700514); ECL超敏發(fā)光試劑盒(Thermo,VC298015)。自制煙熏箱(1 m3),動(dòng)物肺功能檢測(cè)儀(北京貝蘭博公司,Ani Rws 2005),石蠟切片機(jī)(上海徠卡有限公司,RM2016),生物組織石蠟包埋機(jī)(湖北亞光,YB-7LF),光學(xué)顯微鏡(Nikon EcliPse CI),PAP Pen免疫組化筆(ebiogo,B007),自動(dòng)曝光儀(上海培清科技有限公司,JS-1070P)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法 將大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、桂龍咳喘寧組和六味補(bǔ)氣低、中、高劑量組,每組10只。正常組無(wú)特殊處理,其余各組大鼠采用香煙煙霧聯(lián)合氣管滴注LPS的方法[7-8]進(jìn)行COPD造模:于實(shí)驗(yàn)第1天和第14天采用3%巴比妥麻醉大鼠后,切開(kāi)頸部暴露氣管,從氣管注入LPS 200 μL(1 mL/1 mg);非LPS滴注日,將大鼠放入自制煙熏箱中,18支香煙混合60 g鋸齒末點(diǎn)燃,每日煙熏2次,每次25 min,共造模6周。根據(jù)大鼠的生理學(xué)特性、肺功能和肺組織病理變化判定造模是否成功。于造模第7周第1天開(kāi)始,六味補(bǔ)氣低、中、高劑量組分別灌胃0.27 g/kg、0.52 g/kg、1.05 g/kg的六味補(bǔ)氣方混懸液,桂龍咳喘寧組灌胃0.8 mg/kg的桂龍咳喘寧片混懸液,正常組和模型組灌胃等體積生理鹽水,均每日2次,連續(xù)6周。

1.5檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.5.1大鼠一般情況 每日記錄各組大鼠的一般情況與呼吸系統(tǒng)情況。

1.5.2肺功能 灌胃結(jié)束后第2天,采用3%的戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉大鼠,手術(shù)暴露氣管并進(jìn)行插管,連接肺功能檢測(cè)儀器進(jìn)行檢測(cè),記錄呼氣峰流速(PEF)、第0.3秒用力呼氣容積(FEV0.3)及FEV0.3與用力肺活量(FVC)比值(FEV0.3/FVC)。

1.5.3肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6含量 待大鼠肺功能測(cè)定完畢后,暴露頸部氣管,插入灌胃針并扎緊,注入生理鹽水來(lái)回抽吸5次后獲得肺泡灌洗液,將其注入試管中,3 000 r/min離心5 min,取上清液于EP管中-80 ℃保存,采用ELISA法測(cè)定TNF-α、IL-6含量。

1.5.4肺組織病理學(xué)形態(tài) 打開(kāi)大鼠胸腔,取出肺組織,用4%多聚甲醛溶液進(jìn)行固定,常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋,連續(xù)5 μm厚切片, HE染色,光鏡觀察肺組織病理學(xué)形態(tài)并攝片。

1.5.5肺組織中NF-κB表達(dá)情況 采用免疫組化SP法檢測(cè):將組織學(xué)切片依次經(jīng)過(guò)脫蠟水化、抗原修復(fù)、阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶、封閉、加入1∶2 000的兔抗NF-кB抗體、加入1∶2 000的兔抗二抗NF-κB抗體、DAB顯色、蘇木精復(fù)染、封片,光鏡觀察并攝片。細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為NF-κB陽(yáng)性表達(dá)。

1.5.6肺組織中SIRT-1和p53蛋白表達(dá)情況采用Western blot 法檢測(cè):將肺組織置于液氮中速凍,肺組織樣本裂解后離心取上清液,進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉。分別加入1∶1 000的兔抗SIRT-1抗體、1∶1 000的鼠抗p53抗體和1∶2 000的鼠抗GAPDH抗體,孵育過(guò)夜洗膜后,加入1∶20 000 HPR標(biāo)記的山羊抗兔二抗和山羊抗鼠二抗,室溫孵育1.2 h,洗去二抗,使用ECL試劑盒檢測(cè)蛋白表達(dá)情況,采用Image J分析膠狀條帶,計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠一般情況 正常組大鼠精神狀態(tài)良好,進(jìn)食正常,反應(yīng)靈敏,二便正常,體重正常增加,呼吸均勻無(wú)喘息、咳嗽等問(wèn)題;模型組大鼠精神萎靡,食欲不振,體型瘦小,反應(yīng)遲鈍,呼吸困難伴有喘息甚至有張口呼吸,口鼻有分泌物,煙熏過(guò)程中會(huì)有出汗表現(xiàn),部分有脫毛;與模型組比較,各藥物組大鼠精神、食欲、體型、呼吸情況等均有不同程度改善,其中六味補(bǔ)氣高劑量組改善效果與桂龍咳喘寧組相似。

2.2各組大鼠肺功能比較 模型組大鼠PEF、FEV0.3、FEV0.3/FVC均明顯低于正常組(P均<0.05);各藥物組大鼠PEF、FEV0.3、FEV0.3/FVC均明顯高于模型組(P均<0.05),六味補(bǔ)氣各組PEF、FEV0.3、FEV0.3/FVC均明顯低于桂龍咳喘寧組(P均<0.05),其中六味補(bǔ)氣高劑量組各指標(biāo)與桂龍咳喘寧組差距最小。見(jiàn)表1。

表1 正常組和慢性阻塞性肺疾病各組大鼠肺功能指標(biāo)比較

2.3各組大鼠肺組織病理學(xué)形態(tài) 正常組大鼠肺內(nèi)細(xì)支氣管黏膜存在皺襞且完整,管壁內(nèi)上皮排列正常,腺體結(jié)構(gòu)完整;肺泡大小正常,肺泡間隔完整。模型組大鼠細(xì)支氣管黏膜結(jié)構(gòu)不完整,管壁結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞且管腔變窄,管壁內(nèi)纖毛排列不規(guī)整,存在倒伏,腺體增生肥大;肺泡壁變薄塌陷,肺泡腔發(fā)生融合,肺泡腔和肺間質(zhì)內(nèi)發(fā)生炎性浸潤(rùn)。與模型組比較,各藥物組大鼠細(xì)支氣管結(jié)構(gòu)壁和黏膜相對(duì)完整,肺泡塌陷和肺泡腔融合有所改善,肺泡腔和肺間質(zhì)炎性浸潤(rùn)減少,其中以六味補(bǔ)氣高劑量組改善更為明顯。見(jiàn)圖1。

圖1 正常組和慢性阻塞性肺疾病各組大鼠肺組織病理學(xué)形態(tài)(HE染色,×200)

2.4各組大鼠肺泡灌洗液中IL-6和TNF-α含量比較 模型組大鼠肺泡灌洗液中IL-6和TNF-α含量均明顯高于正常組(P均<0.05);各藥物組大鼠肺泡灌洗液中IL-6和TNF-α含量均明顯低于模型組(P均<0.05),且六味補(bǔ)氣各組IL-6和TNF-α含量均明顯低于桂龍咳喘寧組(P均<0.05),其中六味補(bǔ)氣高劑量組IL-6和TNF-α含量均明顯低于六味補(bǔ)氣低、中劑量組(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 正常組和慢性阻塞性肺疾病各組大鼠肺泡灌洗液中IL-6和TNF-α含量比較

2.5各組大鼠肺組織NF-κB蛋白陽(yáng)性表達(dá)情況正常組大鼠肺組織中無(wú)NF-κB蛋白表達(dá);模型組大鼠肺組織中NF-κB蛋白呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá);各藥物組大鼠肺組織中NF-κB蛋白陽(yáng)性表達(dá)較模型組少,其中六味補(bǔ)氣低、中劑量組及桂龍咳喘寧組呈中度表達(dá),六味補(bǔ)氣高劑量組呈低度表達(dá)。見(jiàn)圖2。2.6各組大鼠肺組織SIRT-1和p53蛋白表達(dá)情況比較 與正常組比較,模型組大鼠肺組織中SIRT-1蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低(P<0.05),p53蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯升高(P<0.05)。與模型組比較,各藥物組大鼠肺組織中SIRT-1蛋白相對(duì)表達(dá)量均不同程度升高(P均<0.05),p53蛋白相對(duì)表達(dá)量均不同程度降低(P均<0.05)。與桂龍咳喘寧組比較,六味補(bǔ)氣低、中劑量組大鼠肺組織中SIRT-1蛋白相對(duì)表達(dá)量和六味補(bǔ)氣中、高劑量組大鼠肺組織中p53蛋白相對(duì)表達(dá)量更低(P均<0.05),六味補(bǔ)氣高劑量組大鼠肺組織中SIRT-1蛋白相對(duì)表達(dá)量和六味補(bǔ)氣低劑量組大鼠肺組織中p53蛋白相對(duì)表達(dá)量更高(P均<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖2 正常組和慢性阻塞性肺疾病各組大鼠肺組織中NF-κB蛋白陽(yáng)性表達(dá)情況(免疫組化SP染色,×200)

圖3 正常組和慢性阻塞性肺疾病各組大鼠肺組織中SIRT-1和p53蛋白表達(dá)情況

3 討 論

肺部衰老與COPD的發(fā)展關(guān)系密切[9-10]。

COPD被認(rèn)為是一種“加速衰老”的表型,但同時(shí)衰老也可能導(dǎo)致COPD的發(fā)生發(fā)展[11]。COPD可表現(xiàn)為慢性非特異性炎癥,衰老是引起COPD肺部炎癥的關(guān)鍵因素。COPD發(fā)生過(guò)程中,氧化應(yīng)激反應(yīng)可引起DNA的損傷,導(dǎo)致出現(xiàn)衰老相關(guān)表型特征,表現(xiàn)為NF-κB信號(hào)通路的激活,并出現(xiàn)SASP,其中包括IL-6、IL-8、TNF-α等促炎細(xì)胞因子,TNF-α增加可激活NF-κB信號(hào)通路上的IκBα對(duì)IL-6進(jìn)行上調(diào),NF-κB信號(hào)通路的激活又可以正向反饋對(duì)TNF-α進(jìn)行上調(diào)[12],且可調(diào)控p53蛋白,引起細(xì)胞損傷和衰老。Kim等[13]研究表明,NF-κB信號(hào)通路可以調(diào)節(jié)以TNF-α為主的SASP的分泌,進(jìn)而延緩老年COPD患者的衰微。Adnot等[14]研究發(fā)現(xiàn),來(lái)源于肺的SASP可將衰老過(guò)程傳播給附近的肺組織和細(xì)胞,引起持續(xù)性的炎性反應(yīng),使COPD癥狀持續(xù)存在。

SIRT-1是一種核蛋白,與人體衰老密切相關(guān),通過(guò)參與去乙?；M蛋白、轉(zhuǎn)錄因子和其他蛋白修飾參與氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡抵抗的調(diào)節(jié),這些反應(yīng)與COPD 的發(fā)展密切相關(guān)。在吸煙患者肺部上皮細(xì)胞發(fā)現(xiàn)SIRT-1的表達(dá)量下降[15-16],吸煙使肺泡巨噬細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞中SIRT-1的表達(dá)減少,SIRT-1活性降低,通過(guò)SIRT-1去乙?；倪^(guò)程N(yùn)F-κB p50的活性升高,NF-κB被激活,炎性因子IL-6、TNF-α水平升高[17]。研究發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞衰老過(guò)程中,SIRT-1被敲除會(huì)加快SASP的進(jìn)程,SASP進(jìn)程加快會(huì)讓IL-6、TNF-α水平升高[18]。劉珊等[19]研究證明白藜蘆醇通過(guò)SIRT-1/NF-κB信號(hào)通路抑制SASP進(jìn)程,延緩衰老。p53是一種腫瘤抑制因子,具有許多不同的翻譯后修飾包括乙?；⒘姿峄?其中乙?；稍鰪?qiáng)p53穩(wěn)定性,在細(xì)胞衰老和凋亡方面發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)SIRT-1可通過(guò)對(duì)p53去乙酰化抑制細(xì)胞衰老和凋亡,也可直接降低p53表達(dá),促進(jìn)米色脂肪合成而抑制衰老[20]。SIRT-1/NF-κB/p53信號(hào)通路一方面由SIRT-1參與抑制NF-κB p50去乙酰化的過(guò)程, NF-κB信號(hào)通路被抑制,下調(diào)p53蛋白,NF-κB信號(hào)通路上的亞基IκBα被抑制,下調(diào) IL-6、TNF-α等炎性因子,另一方面SIRT-1直接去乙酰化p53蛋白,使p53蛋白下調(diào),抑制衰老,減慢SASP進(jìn)程,降低炎癥反應(yīng)而延緩衰老。

中醫(yī)認(rèn)為COPD發(fā)生的根本是肺脾腎氣虛交雜,臨床上通常通過(guò)補(bǔ)宗氣、調(diào)脾腎來(lái)改善COPD的炎癥反應(yīng)和衰老影響[21]。六味補(bǔ)氣方可益氣固表、補(bǔ)脾益肺固腎。方中生曬參含人參多糖、人參皂苷,能調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能,降低IL-1、IL-6、IL-8水平,具有明顯抗炎作用[22];黃芪中黃芪多糖可以通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路減輕炎癥反應(yīng),還可以通過(guò)Akt等靶點(diǎn)的作用發(fā)揮抗衰老作用[23];肉桂可改善衰老小鼠腸道微生物菌群,具有抗衰老作用[24];益智仁能通過(guò)提高抗氧化酶活力和抗氧化基因表達(dá)水平,延緩衰老[25]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,COPD模型大鼠FEV0.3、FEV0.3/FVC、PEF均下降,肺泡灌洗液中IL-6、TNF-α含量升高,肺組織中SIRT-1蛋白表達(dá)減少,NF-κB和p53蛋白表達(dá)增加;用六味補(bǔ)氣方干預(yù)后,大鼠肺功能有一定改善,肺泡灌洗液中IL-6、TNF-α含量降低,SIRT-1蛋白表達(dá)增加,NF-κB和p53蛋白表達(dá)被抑制。因此推測(cè)六味補(bǔ)氣方通過(guò)對(duì)SIRT-1/NF-κB/p53信號(hào)通路的調(diào)控,抑制COPD模型大鼠肺部SASP的表達(dá),從而減輕炎癥性衰老,延緩COPD發(fā)展。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。