張 玲,曾微微,羊章凱,麥聯(lián)任

(海南省中醫(yī)院,海南 海口 570000)

慢性萎縮性胃炎為臨床中常見的消化系統(tǒng)疾病,以腹部不適、食欲不振為主要臨床特點,如不及時干預(yù),可能進展為癌前病變,甚至進展為胃癌。目前,臨床中對于慢性萎縮性胃炎的治療藥物有限,同時表現(xiàn)出有效率低、療程長、患者依從性差等特點[1-2],所以對于慢性萎縮性胃炎治療藥物的研發(fā)仍是當(dāng)前的工作重點。去整合素金屬蛋白酶17(ADAM17)/表皮生長因子受體(EGFR)通路是近年來研究發(fā)現(xiàn)的與慢性萎縮性胃炎的發(fā)生及進展密切相關(guān)的重要信號通路,林海燕等[3]研究發(fā)現(xiàn)抑制EGFR的過度表達(dá)可修復(fù)慢性萎縮性胃炎大鼠胃黏膜病理損傷;Chen等[4]研究證實調(diào)節(jié)ADAM17/EGFR通路能夠顯著抑制胃黏膜炎癥損傷,增強胃黏膜組織細(xì)胞防御能力,進而修復(fù)胃黏膜,抑制慢性萎縮性胃炎大鼠疾病進展。苓桂術(shù)甘湯為經(jīng)典祛濕劑,其在消化系統(tǒng)疾病特別是胃病治療中顯示出較好療效[5]。本研究基于ADAM17/EGFR通路探討了苓桂術(shù)甘湯對慢性萎縮性胃炎大鼠的作用,旨在為該藥的作用提供新的理論依據(jù)。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 健康清潔級雄性SD大鼠63只,6周齡,體重200～220 g,購自海南藥物研究所有限責(zé)任公司,實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(瓊)2020-0007,飼養(yǎng)于實驗動物房,溫度20～25 ℃,相對濕度40%～70%,晝夜交替12 h。實驗動物的使用經(jīng)倫理委員會審批通過(K20220420108)。

1.2藥品及試劑 苓桂術(shù)甘湯由藥材飲片茯苓(批號:190811)12 g、桂枝(批號:191012)9 g、白術(shù)(批號:190527)9 g、炙甘草(批號:190326)6 g組成,飲片由北京同仁堂藥業(yè)有限公司生產(chǎn),將飲片置于1 000 mL蒸餾水中浸泡4 h,煎煮2 h,過濾,收集濾液,將藥材殘渣置于1000mL蒸餾水中再次煎煮30 min,過濾并收集濾液,合并2次濾液,蒸發(fā)濃縮制成生藥含量為0.72 g/mL的藥液;維酶素,四川大冢制藥有限公司,批號:210702;1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍(MNNG,貨號:HY-128612)購自美國MedChemExpress公司;二喹啉甲酸(BCA,貨號:PC0020)、磷酸鹽緩沖液(PBS,貨號P1020)、化學(xué)發(fā)光液(貨號:PE0010)、組織裂解液(貨號:R0010)、酚酞指示劑(貨號:G2860)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)檢測試劑盒(貨號:SEKR-0009)、C反應(yīng)蛋白(CRP)檢測試劑盒(貨號:SEKR-0017)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)檢測試劑盒(貨號:SEKR-0002)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)檢測試劑盒(貨號:SEKR-0006)、胃蛋白酶活性測定試劑盒(貨號:BC2320)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測定試劑盒(貨號:BC1195)、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔抗體(貨號:SE134)購自北京索萊寶生物科技有限公司;氫氧化鈉(NaOH,貨號:1310-73-2)購自西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司;胃泌素(GAS)檢測試劑盒(貨號:FY-A014832)購自上海富雨生物科技有限公司;胃動素(MTL)檢測試劑盒(貨號E-EL-R0639c)購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司;一氧化氮(NO)測定試劑盒(貨號:E1030-8)購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司;P選擇素(SELP)測定試劑盒(貨號:ER0124)購自武漢菲恩生物科技有限公司;白細(xì)胞內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1(LECAM-1)測定試劑盒(貨號:E07431r)購自武漢華美生物工程有限公司;內(nèi)皮素-1(ET-1)測定試劑盒(貨號:ARB12078)購自北京百奧萊博科技有限公司;超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒(貨號:S0101)、丙二醛(MDA)測定試劑盒(貨號:S0131)、HE染色試劑盒(貨號:C0105)購自碧云天生物科技有限公司;RNA提取試劑盒(貨號:WLA088)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號:WLA101)、2×PCR Master Mix With Indicator(貨號:WLA071)購自沈陽萬類生物科技有限公司;表皮生長因子(EGF,貨號:ab184265)、EGFR(貨號:ab52894)、ADAM17(貨號:ab39162)、GAPDH(貨號:ab181602)兔抗體購自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司;PCR引物設(shè)計與合成由賽默飛世爾科技有限公司完成。

1.3儀器與設(shè)備 Gel Doc EZ凝膠成像儀(美國BIO-RAD公司);DMi8熒光倒置顯微鏡(德國Leica公司);NX-1R高速冷凍離心機(鼎昊源生物科技有限公司);CLARIOstar PLUS酶標(biāo)儀(德國BMG LABTECH公司)。

1.4實驗方法 隨機取10只大鼠作為正常對照組,其余大鼠參照文獻[6]方法制備慢性萎縮性胃炎模型,即大鼠自由飲用100 μg/mL的MNNG溶液,同時飽食1 d、禁食1 d交替喂養(yǎng),共持續(xù)56 d,隨機取3只大鼠進行胃組織病理學(xué)檢查,以胃黏膜及腺體萎縮視為造模成功。將造模成功的大鼠采用隨機數(shù)字表法分為萎縮性胃炎組,維酶素組及苓桂術(shù)甘湯低、中、高劑量組,每組10只。苓桂術(shù)甘湯低、中、高劑量組參考文獻[7]給藥劑量分別給予1.8 g/kg、3.6 g/kg、7.2 g/kg的苓桂術(shù)甘湯灌胃,維酶素組參考文獻[8]給藥劑量給予0.2 g/kg維酶素灌胃,萎縮性胃炎組及正常對照組給予生理鹽水灌胃,均1次/d,連續(xù)30 d。

1.5檢測指標(biāo)及方法

1.5.1體重 分別于造模完成后及末次灌胃結(jié)束12 h后測量各組大鼠體重。

1.5.2血清GAS、MTL、TNF-α、CRP、IL-1β、IL-10水平 大鼠禁食12 h,腹腔注射戊巴比妥鈉(45 mg/kg)麻醉大鼠后,取仰臥位,沿腹部正中切開,腹主動脈取血,4 ℃靜置30 min,4 ℃下3 500 r/min離心15 min,取上清,使用試劑盒測定各指標(biāo)水平。

1.5.3胃液酸度及胃蛋白酶活性 取血后,結(jié)扎幽門并向胃內(nèi)注射2 mL蒸餾水,15 min后分離全胃并收集胃液,取一部分胃液,以酚酞為指示劑,使用NaOH滴定分析胃液總酸度;另一部分胃液以8 000 r/min室溫離心10 min,取上清液,使用試劑盒測定胃蛋白酶活性。

1.5.4胃黏膜組織中NO、SELP、LECAM-1、ET-1、SOD、MDA、GSH-Px含量 取大鼠胃黏膜組織,研磨勻漿,4 ℃下8 000 r/min離心10 min,取上清液,使用試劑盒測定各指標(biāo)含量。

1.5.5胃黏膜組織病理學(xué)形態(tài) 取大鼠胃黏膜組織,置于10%中性福爾馬林溶液中浸泡24 h,使用石蠟包埋后制成5 μm切片,常規(guī)HE染色后置于光學(xué)顯微鏡下觀察拍照。

1.5.6胃黏膜組織中EGF、EGFR、ADAM17 mRNA表達(dá)情況 取大鼠胃黏膜組織,提取分離總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,PCR試劑盒測定EGF、EGFR及ADAM17 mRNA表達(dá)量。反應(yīng)體系:正反向引物各2 μL,模板DNA 2 μL,2×PCR Master Mix With Indicator 25 μL,使用蒸餾水補充至50 μL。反應(yīng)程序:94 ℃起始變性3 min,94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72℃延伸1min,進行30個循環(huán),72℃最終延伸10 min。結(jié)果以GAPDH為內(nèi)參,采用2-ΔΔCT法計算相對表達(dá)量。EGF、EGFR、ADAM17、GAPDH引物序列見表1。

表1 EGF、EGFR、ADAM17、GAPDH引物序列

1.5.7胃黏膜組織中EGF、EGFR、ADAM17蛋白表達(dá)情況 取大鼠胃黏膜組織,使用組織裂解液在勻漿器中研磨勻漿后,4 ℃下8 000 r/min離心10 min,取上清,使用BCA試劑盒測定蛋白總濃度并取相當(dāng)于50 μg蛋白的上清液,上樣、電泳分離,電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜,使用體積分?jǐn)?shù)為5%的脫脂奶粉作為封閉液,室溫封閉1 h,PBS清洗3次,分別加入EGF、EGFR、ADAM17、GAPDH兔抗體(1∶500稀釋),4 ℃條件下孵育過夜,PBS再次清洗3次,加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體(1∶2 000稀釋),室溫孵育2 h,PBS清洗3次后,置于凝膠分析儀,滴加化學(xué)發(fā)光液,顯影拍照,使用Image 1.12.0軟件,以GAPDH為內(nèi)參,計算各蛋白相對表達(dá)量。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)使用SPSS 26.0軟件進行數(shù)據(jù)處理分析,計量資料均呈正態(tài)分布,多組間比較采有單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠體重比較 造模完成后,各造模組大鼠體重均明顯低于正常對照組(P均<0.05),各造模組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。灌胃結(jié)束后,萎縮性胃炎組大鼠體重明顯低于正常對照組(P<0.05);苓桂術(shù)甘湯各組及維酶素組大鼠體重均明顯高于萎縮性胃炎組(P均<0.05);苓桂術(shù)甘湯各組隨著苓桂術(shù)甘湯劑量的增加,大鼠體重逐漸增加,組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。見表2。

表2 正常對照組和慢性萎縮性胃炎各組大鼠體重比較

2.2各組大鼠血清GAS、MTL、TNF-α、CRP、IL-1β、IL-10水平比較 與正常對照組比較,萎縮性胃炎組大鼠血清GAS、IL-10水平均明顯降低(P均<0.05),血清MTL、TNF-α、CRP、IL-1β水平均明顯升高(P均<0.05);與萎縮性胃炎組比較,苓桂術(shù)甘湯各組及維酶素組大鼠血清GAS、IL-10水平均明顯升高(P均<0.05),血清MTL、TNF-α、CRP、IL-1β水平均明顯降低(P均<0.05);苓桂術(shù)甘湯各組隨著苓桂術(shù)甘湯劑量的增加,血清GAS、IL-10水平均逐漸升高,血清MTL、TNF-α、CRP、IL-1β水平均逐漸降低,組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。見表3。

表3 正常對照組和慢性萎縮性胃炎各組大鼠血清GAS、MTL、TNF-α、CRP、IL-1β及IL-10水平比較

2.3各組大鼠胃液酸度及胃蛋白酶活性比較 萎縮性胃炎組大鼠胃液酸度及胃蛋白酶活性均明顯低于正常對照組(P均<0.05);苓桂術(shù)甘湯各組及維酶素組大鼠胃液酸度及胃蛋白酶活性均明顯高于萎縮性胃炎組(P均<0.05);苓桂術(shù)甘湯各組隨著苓桂術(shù)甘湯劑量的增加,大鼠胃液酸度及胃蛋白酶活性均逐漸升高,組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。見表4。

表4 正常對照組和慢性萎縮性胃炎各組大鼠胃液酸度及胃蛋白酶活性比較

2.4各組大鼠胃黏膜組織中NO、SELP、LECAM-1、ET-1、SOD、MDA、GSH-Px含量比較 與正常對照組比較,萎縮性胃炎組大鼠胃黏膜組織中SOD及GSH-Px含量均明顯降低(P均<0.05),NO、SELP、LECAM-1、ET-1、MDA含量均明顯升高(P均<0.05);與萎縮性胃炎組比較,苓桂術(shù)甘湯各組及維酶素組大鼠胃黏膜組織中SOD及GSH-Px含量均明顯升高(P均<0.05),NO、SELP、LECAM-1、ET-1、MDA含量均明顯降低(P均<0.05);苓桂術(shù)甘湯各組隨著苓桂術(shù)甘湯劑量的增加,胃黏膜組織中SOD及GSH-Px含量均逐漸升高,NO、SELP、LECAM-1、ET-1、MDA含量均逐漸降低,組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。見表5。

表5 正常對照組和慢性萎縮性胃炎各組大鼠胃黏膜組織NO、SELP、LECAM-1、ET-1、SOD、MDA、GSH-Px含量比較

2.5各組大鼠胃黏膜組織病理形態(tài) 正常對照組大鼠胃黏膜組織無明顯病理學(xué)改變;萎縮性胃炎組大鼠胃黏膜組織萎縮性改變,炎癥細(xì)胞浸潤,胃黏膜細(xì)胞脫落,腺體萎縮;與萎縮性胃炎組比較,苓桂術(shù)甘湯各組及維酶素組大鼠胃黏膜組織病理學(xué)明顯改善。見圖1。

圖1 正常對照組和慢性萎縮性胃炎各組大鼠胃黏膜組織病理學(xué)形態(tài)(HE,×200)

2.6各組大鼠胃黏膜組織中EGF、EGFR、ADAM17 mRNA相對表達(dá)量比較 萎縮性胃炎組大鼠胃黏膜組織中EGF、EGFR、ADAM17 mRNA相對表達(dá)量均明顯高于正常對照組(P均<0.05);苓桂術(shù)甘湯各組及維酶素組大鼠胃黏膜組織中EGF、EGFR、ADAM17 mRNA相對表達(dá)量均明顯低于萎縮性胃炎組(P均<0.05);苓桂術(shù)甘湯各組隨著苓桂術(shù)甘湯劑量的增加,胃黏膜組織中EGF、EGFR、ADAM17 mRNA相對表達(dá)量均逐漸降低,組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。見表6。

表6 正常對照組和慢性萎縮性胃炎各組大鼠胃黏膜組織中EGF、EGFR、ADAM17 mRNA相對表達(dá)量比較

2.7各組大鼠胃黏膜組織中EGF、EGFR、ADAM17蛋白表達(dá)情況比較 萎縮性胃炎組大鼠胃黏膜組織中EGF、EGFR、ADAM17蛋白相對表達(dá)量均明顯高于正常對照組(P均<0.05);苓桂術(shù)甘湯各組及維酶素組大鼠胃黏膜組織中EGF、EGFR、ADAM17 蛋白相對表達(dá)量均明顯低于萎縮性胃炎組(P均<0.05);苓桂術(shù)甘湯各組隨著苓桂術(shù)甘湯劑量的增加,胃黏膜組織中EGF、EGFR、ADAM17 蛋白相對表達(dá)量均逐漸降低,組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。見圖2。

圖2 正常對照組和慢性萎縮性胃炎各組大鼠胃黏膜組織中EGF、EGFR、ADAM17蛋白表達(dá)情況

3 討 論

慢性萎縮性胃炎的發(fā)生與幽門螺桿菌感染、飲酒等不良生活習(xí)慣、遺傳因素、自身免疫系統(tǒng)紊亂等多種因素有關(guān)[9]。目前,臨床中對于慢性萎縮性胃炎的治療主要以抑制胃酸、改善胃動力、保護胃黏膜為主,但有些患者病情仍然會進展[10],因此中西醫(yī)結(jié)合治療萎縮性胃炎成為研究熱點。

中醫(yī)理論認(rèn)為,慢性萎縮性胃炎是由于脾胃虛弱,陽氣虛衰,運化失司,痰濕內(nèi)生而致胃絡(luò)瘀阻。因此,慢性萎縮性胃炎的治療以益氣健脾、清熱化濕為主。苓桂術(shù)甘湯具有溫陽健脾、利水消腫之功效,方中茯苓健脾利濕、溫陽化飲,桂枝通陽化氣、平?jīng)_降逆,白術(shù)燥濕利水、健脾益氣,甘草調(diào)和諸藥。趙松峰[11]研究表明,苓桂術(shù)甘湯聯(lián)合西藥治療較單獨使用西藥治療能夠顯著減輕脾胃病患者胃脘疼痛、泛酸等癥狀;李杰等[12]研究發(fā)現(xiàn),苓桂術(shù)甘湯能夠改善慢性心力衰竭胃動力下降患者胃腸道癥狀及胃排空時間,恢復(fù)胃腸道功能;林博等[13]研究證實,苓桂術(shù)甘湯能夠顯著改善功能型消化不良患者血流動力學(xué)狀態(tài),調(diào)節(jié)胃蛋白酶活性。由此可見,苓桂術(shù)甘湯在胃腸道系統(tǒng)疾病的治療中具有較大潛力,但其是否可用于慢性萎縮性胃炎的治療及機制尚不明確,所以本實驗進行相關(guān)探討。

血清GAS、MTL水平與慢性萎縮性胃炎的發(fā)生及進展有關(guān)。楊國紅等[14]研究證實GAS、MTL水平是慢性萎縮性胃炎不同中醫(yī)證候轉(zhuǎn)化的客觀物質(zhì)基礎(chǔ)及重要參考指標(biāo)。朱萱萱等[15]實驗研究表明脾氣虛證大鼠血清GAS水平降低,血清MTL水平升高,二者可一定程度反映胃黏膜功能受損情況。炎癥反應(yīng)水平與慢性萎縮性胃炎患者胃黏膜病變程度正相關(guān),成映霞等[16]研究報道,慢性萎縮性胃炎大鼠胃組織中TNF-α、IL-1β含量顯著升高,抑制炎癥因異常分泌可保護胃黏膜。黃銘涵等[17]報道,慢性萎縮性胃炎大鼠血清IL-10水平降低,上調(diào)其表達(dá)可減輕胃黏膜損傷。胃液酸度與慢性萎縮性胃炎相關(guān)性癌前病變的發(fā)生密切相關(guān),提高胃液酸度能夠抑制胃癌前病變[18];胃蛋白酶活性是反映胃黏膜完整性及腺體功能的常用指標(biāo),該酶活性降低提示胃黏膜及腺體功能下降[19]。本實驗結(jié)果表明,與正常對照組比較,萎縮性胃炎組大鼠血清GAS及IL-10水平、胃液酸度及胃蛋白酶活性均明顯降低;血清MTL、TNF-α、CRP、IL-1β水平均明顯升高,胃黏膜組織出現(xiàn)明顯病理改變;與萎縮性胃炎組比較,苓桂術(shù)甘湯各組大鼠血清GAS及IL-10水平、胃液酸度及胃蛋白酶活性均明顯升高,血清MTL、TNF-α、CRP、IL-1β水平均明顯降低,胃黏膜病理改變明顯改善,且苓桂術(shù)甘湯各組隨著苓桂術(shù)甘湯劑量的增加,各項指標(biāo)變化更明顯。提示苓桂術(shù)甘湯能夠呈劑量依賴性減輕慢性萎縮性胃炎大鼠炎癥反應(yīng),修復(fù)胃黏膜,促進胃黏膜腺體功能的恢復(fù)。

目前研究證實,慢性萎縮性胃炎的發(fā)生發(fā)展與氧化應(yīng)激損傷、炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。李寧寧等[20]研究報道,慢性萎縮性胃炎大鼠胃黏膜組織中SOD、GSH-Px活性較正常大鼠顯著降低,MDA活性較正常大鼠明顯升高,證實慢性萎縮性胃炎大鼠存在氧化應(yīng)激損傷。魏盛等[21]研究證實,NO會影響慢性萎縮性胃炎大鼠胃內(nèi)pH與胃黏液量,進而影響胃黏膜病理進展。白敏等[22]研究證實慢性萎縮性胃炎大鼠胃黏膜組織誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)表達(dá)上調(diào),內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)表達(dá)下調(diào), 下游因子NO、SELP、LECAM-1、ET-1分泌增加。李萬瑀等[23]研究表明,ET-1水平升高與慢性萎縮性胃炎患者免疫功能紊亂及胃黏膜損傷密切相關(guān)。本實驗結(jié)果顯示,苓桂術(shù)甘湯能夠顯著降低大鼠胃黏膜組織中NO、SELP、LECAM-1、ET-1、MDA含量,升高SOD及GSH-Px含量,提示苓桂術(shù)甘湯可抑制慢性萎縮性胃炎大鼠胃黏膜炎癥和氧化應(yīng)激損傷。

近年來關(guān)于慢性萎縮性胃炎發(fā)生發(fā)展的相應(yīng)機制研究發(fā)現(xiàn),胃黏膜組織中EGF、EGFR表達(dá)上調(diào)與慢性萎縮性胃炎的發(fā)生及胃黏膜細(xì)胞的過度增殖密切相關(guān),抑制胃黏膜中EGF、EGFR表達(dá)能促進胃黏膜修復(fù)[24-25]。白雪峰等[26]研究證實,慢性萎縮性胃炎大鼠胃黏膜組織中ADAM17、EGFR蛋白水平明顯升高,下調(diào)ADAM17、EGFR表達(dá)能夠修復(fù)胃黏膜,促進胃黏膜功能恢復(fù),抑制病情進展。本實驗結(jié)果顯示,萎縮性胃炎組大鼠胃黏膜組織中EGF、EGFR、ADAM17 mRNA及蛋白表達(dá)量均較正常對照組明顯升高,苓桂術(shù)甘湯各組大鼠胃黏膜組織中EGF、EGFR、ADAM17 mRNA及蛋白表達(dá)量均明顯降低,提示苓桂術(shù)甘湯能夠通過調(diào)控EGF、EGFR、ADAM17的表達(dá)而修復(fù)慢性萎縮性胃炎大鼠胃黏膜組織病變。

綜上所述,苓桂術(shù)甘湯能夠抑制慢性萎縮性胃炎大鼠胃黏膜組織炎癥損傷,調(diào)節(jié)胃液酸度及胃蛋白酶活性,促進胃黏膜組織病理學(xué)改變及功能的恢復(fù),其機制可能與調(diào)節(jié)ADAM17/EGFR通路有關(guān)。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。