肖 峰

(貴州省貴陽市第六醫(yī)院泌尿外科,貴州 貴陽 550006)

各種先天性和獲得性疾病如癌癥、創(chuàng)傷、結(jié)核等往往導(dǎo)致膀胱組織發(fā)生嚴(yán)重的病理性缺損[1]。臨床上,膀胱缺損患者常采用手術(shù)切除聯(lián)合胃腸道替換的方法重建膀胱,以維持患者儲水排尿的生理需求[2]。雖然從短期來看,能夠修復(fù)膀胱缺損,但是這些方法受到機(jī)械、結(jié)構(gòu)、功能或生物兼容性問題的限制,并不能滿足臨床需求。近些年來,隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展,為完全修復(fù)膀胱缺損提供了可能的新方法。一般來說,組織工程通常包括三個(gè)基本要素:種子細(xì)胞、生物支架和生長因子。膀胱支架的理想材料應(yīng)具備良好的生物相容性、機(jī)械性以及生物安全性等特點(diǎn)[3-4]。目前,通過一系列物理化學(xué)手段去除異體組織中的細(xì)胞成分得到的脫細(xì)胞基質(zhì)材料,因其具備完整的細(xì)胞外支架結(jié)構(gòu),免疫原性低,并且含有的膠原和彈性纖維等利于細(xì)胞的黏附生長與增殖等特點(diǎn)使其成為一種理想的生物支架材料[5-6]。因此,異種脫細(xì)胞基質(zhì)已經(jīng)成為組織工程技術(shù)修復(fù)膀胱損傷的重點(diǎn)研究對象。本研究通過不同濃度的疊氮鈉溶液對豬膀胱進(jìn)行預(yù)處理,利用低滲-液氮反復(fù)凍融-NaOH溶解法等一系列程序?qū)ΟB氮鈉溶液處理過的豬膀胱進(jìn)一步脫細(xì)胞處理,獲得豬膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)(bladder acellular matrix graft,BAMG),即異種脫細(xì)胞膀胱黏膜下層支架。隨后通過組織學(xué)檢測、DNA殘留實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)、以及皮下植入實(shí)驗(yàn)等方法進(jìn)一步驗(yàn)證制備的BAMG的生物安全性,為其臨床應(yīng)用奠定一定的理論基礎(chǔ)。報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物與細(xì)胞 健康豬膀胱由黔康肉食品經(jīng)營有限公司提供,取材3 h內(nèi)進(jìn)行脫細(xì)胞處理。SPF級7～8周的SD大鼠(雌)購自北京華阜康生物科技有限公司,體重210～230 g。動物飼養(yǎng)于屏障環(huán)境中的獨(dú)立通氣籠盒內(nèi),適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。飼養(yǎng)密度不超過6只/籠,環(huán)境溫度控制在22～26 ℃,相對濕度40%～60%,籠具、墊料、飲用水和標(biāo)準(zhǔn)飼料均經(jīng)滅菌處理,小鼠自由活動及進(jìn)食。人源膀胱平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM完全培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)20%胎牛血清),由本院病理研究室提供。

所有動物實(shí)驗(yàn)均通過貴陽市第六醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)通過(許可證號:202109122)。

1.2主要試劑 疊氮鈉由翌圣生物科技(上海)股份有限公司提供。無菌磷酸鹽緩沖鹽水(phosphate buffer saline,PBS),蘇木素伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色試劑盒以及Hoechst 33258染色液均由Solarbio公司提供,貨號P1020,G1120和C0021。四唑鹽(methyl thiazolyltetrazolium,MTT)比色法試劑盒由Sigma公司提供,貨號:CT01-5。胎牛血清由Hyclone公司提供,貨號:SH30070.031。DMEM高糖培養(yǎng)基由博士德生物工程有限公司提供,貨號:PYG0070。人源膀胱平滑肌細(xì)胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司,貨號:CP-H069。青霉素-鏈霉素溶液(含100 U/mL青霉素、100 g/L鏈霉素),兩性霉素B溶液(250 mg/L)均購自武漢普諾賽生命科技有限公司,貨號:PB180120,PB180127。DNase和RNase均購自上海碧云天生物科技有限公司,貨號:R0127。MagMAX-96 DNA多樣品試劑盒購自賽默飛公司,貨號:4413021。

1.3構(gòu)建豬BAMG ①將得到的豬膀胱,用含抗生素(100 U/mL青霉素、100 g/L鏈霉素)和抗真菌藥物(2.5 mg/L兩性霉素B)的PBS緩沖液沖洗。②將洗凈的豬膀胱分別置于濃度為0.1 g/L、0.2 g/L、0.3 g/L、0.5 g/L、0.7 g/L、1g/L疊氮鈉溶液中浸泡共2 h。③用薄玻片刮去膀胱黏膜層浸入蒸餾水中6 h,每2 h換液1次。④-80 ℃條件下反復(fù)凍融3次,60 min/次。⑤加入40 U/mL DNase和RNase混合液,37 ℃,靜置2 h。⑥浸入4% NaOH溶液,4 ℃,靜置24 h,每6 h換液1次。⑦PBS緩沖液震蕩漂洗5次,30 min/次。⑧置于冷凍干燥機(jī)中凍干,60CO消毒,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4組織學(xué)檢測細(xì)胞殘留 豬膀胱經(jīng)脫細(xì)胞處理后,用10%多聚甲醛固定,石蠟包埋,切片(5 μm),HE染色,封片,光鏡觀察。

1.5紫外分光光度法檢測BAMG中的DNA含量 取合適大小BAMG(10 mg),隨后利用MagMAX-96 DNA多樣品試劑盒提取BAMG中總DNA含量,并用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行檢測。

1.6MTT比色法檢測BAMG的體外生物相容性 將4 cm2的BAMG浸泡在1 mL含10%胎牛血清的DMEM中,37 ℃,靜置24 h,即可得到獲得BAMG的浸提液。隨后,將人源膀胱平滑肌細(xì)胞懸液接種于96孔板內(nèi),待細(xì)胞貼壁后加入上述浸提液培養(yǎng)細(xì)胞,空白對照加入DMEM培養(yǎng)基,于37 ℃、5% CO2孵箱中分別培養(yǎng)細(xì)胞12 h、24 h和48 h。然后棄掉培養(yǎng)基,每孔加入等的量MTT試劑。避光培養(yǎng)2 h后,去除MTT試劑并加入200 μL二甲基亞砜。上機(jī)測定490 nm處的吸光度。

1.7細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)確定BAMG的黏附性 將人平滑肌細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液,并稀釋為1×107個(gè)/mL。取200 μL單細(xì)胞懸液接種到BAMG表面并在,在含10%胎生牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)1周后,BAMG經(jīng)培養(yǎng)基沖洗后通過Hoechst 33258染色檢測BAMG表面的DNA濃度確定細(xì)胞黏附情況。

1.8皮下植入試驗(yàn)觀察BAMG與周圍組織的相容性 在成年SD大鼠脊柱中線兩側(cè)約2 cm處平行各取2點(diǎn)作為皮下注入點(diǎn)。水合氯醛麻醉動物,無菌條件植入BAMG作為實(shí)驗(yàn)組,假手術(shù)組作為對照組。每天觀察皮膚手術(shù)切口及動物反應(yīng)變化。在術(shù)后第2周和第4周處死大鼠,切開皮膚仔細(xì)觀察樣品與周圍組織的粘連情況并進(jìn)一步切片作組織學(xué)評價(jià)。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)、單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1組織學(xué)觀察檢測脫細(xì)胞效率 通過組織學(xué)觀察檢測脫細(xì)胞效率,初步發(fā)現(xiàn),經(jīng)脫細(xì)胞處理后,豬膀胱組織中僅可見基質(zhì)結(jié)構(gòu)和膠原纖維,其中膠原纖維排列整齊,結(jié)構(gòu)完整;并且可見視野內(nèi)的細(xì)胞核數(shù)量顯著減少,未見明顯的細(xì)胞殘留。表明該方法處理得到的BAMG符合無細(xì)胞的要求(圖1)。

圖1 組織學(xué)觀察脫細(xì)胞效率

2.2脫細(xì)胞處理對BAMG中DNA含量的影響 利用紫外分光光度法檢測經(jīng)脫細(xì)胞處理后BAMG中殘留的DNA含量。結(jié)果顯示,脫細(xì)胞處理組的DNA含量顯著低于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。表明,經(jīng)脫細(xì)胞處理能夠顯著降低BAMG中的DNA含量,即本實(shí)驗(yàn)中所采用的制備方法比較成功地實(shí)現(xiàn)的脫細(xì)胞的目的。

表1 紫外分光光度法檢測DNA殘留含量

2.3BAMG的體外生物相容性檢測 利用MTT法檢測經(jīng)脫細(xì)胞處理后BAMG浸提液在不同時(shí)間點(diǎn)對人膀胱平滑肌細(xì)胞細(xì)胞活性的影響。結(jié)果顯示,2組細(xì)胞生長狀態(tài)良好,隨培養(yǎng)時(shí)間的延長,細(xì)胞數(shù)量穩(wěn)定增長,細(xì)胞增殖能力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.989,0.636,1.608,1.403,P>0.05)。結(jié)果表明,經(jīng)脫細(xì)胞處理的BAMG浸提液對培養(yǎng)的人平滑肌細(xì)胞沒有顯著的細(xì)胞毒性,見表2。

表2 BAMG浸提液對人膀胱平滑肌細(xì)胞細(xì)胞活性的影響

2.4BAMG的細(xì)胞黏附能力檢測 通過Hoechst 33258染色液確定BAMG表面的DNA含量,間接檢測BAMG 的細(xì)胞黏附能力。結(jié)果顯示,與對照組相比,接種細(xì)胞后BAMG表面的DNA含量顯著增加。這提示人膀胱平滑肌細(xì)胞能夠黏附在BAMG表面生長,BAMG具有一定的細(xì)胞黏附力。上述結(jié)果間接闡明了BAMG能夠與人平滑肌細(xì)胞的緊密黏附(圖2)。

圖2 組織觀察法確定BAMG的細(xì)胞黏附情況

2.5BAMG的組織相容性檢測 利用透射電子顯微鏡確定BAMG植入后組織中由中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞組成的炎性細(xì)胞。結(jié)果顯示,BAMG植入后,傷口處未見明顯的炎癥反應(yīng),如水腫、化膿以及發(fā)炎等。植入部位未見異常。術(shù)后1周取出BAMG,發(fā)現(xiàn)其與周圍組織輕微粘連,出現(xiàn)輕微的炎性細(xì)胞浸潤(白色箭頭);術(shù)后4周取出BAMG,發(fā)現(xiàn)其與周圍組織黏附,未見炎性細(xì)胞浸潤(圖3)。

圖3 透射電子顯微鏡檢測不同時(shí)期的炎性細(xì)胞( ×100)

3 討 論

在組織工程學(xué)中,支架為種子細(xì)胞的生長分化提供了穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)。事實(shí)上,細(xì)胞的生長發(fā)育受到支架提供的微環(huán)境影響[7]。由于膀胱在充盈和排空過程中會受到不同的機(jī)械力,因此需要一個(gè)動態(tài)支架來提供機(jī)械支撐。細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrices,ECM)是一種天然理想的生物支架材料,其細(xì)胞成分和抗原均已去除,尤其是以脫細(xì)胞基質(zhì)為代表的ECM材料已廣泛用于各種組織重建應(yīng)用。脫細(xì)胞基質(zhì)主要由結(jié)構(gòu)蛋白和各種功能分子組成,如膠原蛋白、糖胺聚糖、生長因子、黏附分子和細(xì)胞因子[8]。功能上,能夠?yàn)榧?xì)胞提供物理支架并調(diào)節(jié)細(xì)胞反應(yīng),包括細(xì)胞增殖、存活、分化、遷移、穩(wěn)態(tài)和形態(tài)發(fā)生[9]。其特點(diǎn)是能夠保持組織的機(jī)械性能和結(jié)構(gòu)蛋白,不需要進(jìn)行二次工程設(shè)計(jì)。在眾多組織來源的脫細(xì)胞基質(zhì)生物材料中,BAMG無需體外細(xì)胞種植即可促進(jìn)膀胱再生,并可被宿主組織重塑和取代;同時(shí),保留了組織再生所需的生物活性蛋白,包括血管內(nèi)皮生長因子和胰島素樣生長因子[10-11]。

與任鵬程等[12]報(bào)告的脫細(xì)胞方法相比,本研究主要采用一系列濃度梯度的疊氮鈉溶液對豬膀胱進(jìn)行脫細(xì)胞處理,建立了一種高效快速的制備豬膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)的方法。首先將滅菌處理的健康豬膀胱分別浸泡于不同濃度的(濃度為0.1 g/L、0.2 g/L、0.3 g/L、0.5 g/L、0.7 g/L、1 g/L)疊氮鈉溶液,充分裂解基質(zhì)細(xì)胞并釋放胞內(nèi)內(nèi)容物。隨后浸入蒸餾水6 h,以達(dá)到水解細(xì)胞的目的。而液氮凍融法使膀胱組織內(nèi)的細(xì)胞發(fā)生腫脹破碎,進(jìn)一步增強(qiáng)脫細(xì)胞效果。此外,DNA酶及RNA酶可以消化處理膀胱基質(zhì)內(nèi)的核酸成分。最后,采用NaOH溶解法使細(xì)胞脫水壞死、脂肪皂化,徹底去除膀胱組織中的殘留細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和胞內(nèi)脂質(zhì)?？傊?將整個(gè)制備過程分為6個(gè)質(zhì)量控制環(huán)節(jié):疊氮鈉裂解細(xì)胞、滲透溶液法水解細(xì)胞、液氮凍融法破碎細(xì)胞、酶消化法去除核酸、NaOH溶解法清除細(xì)胞脂質(zhì)和PBS溶液清洗等步驟。經(jīng)過上述操作過程實(shí)現(xiàn)豬膀胱組織高效的脫細(xì)胞處理,獲得較理想的BAMG。隨后對該方法的脫細(xì)胞效率和BAMG的生物安全性評價(jià)進(jìn)行了廣泛的研究。

為了鑒定所制備的BAMG是否能作為生物支架材料應(yīng)用于組織工程膀胱的構(gòu)建,主要從形態(tài)學(xué)、細(xì)胞相容性及移植后反應(yīng)等3個(gè)方面對制備的BAMG進(jìn)行了綜合評價(jià)。首先,通過HE染色確定制備的BAMG的脫細(xì)胞效率[13]。HE染色結(jié)果顯示,脫細(xì)胞處理后,膠原纖維排列整齊,結(jié)構(gòu)完整;與對照組相比,可見視野內(nèi)無細(xì)胞核出現(xiàn),未見明顯的細(xì)胞殘留。另外,供體DNA殘留量也是評價(jià)脫細(xì)胞效率的主要指標(biāo)之一[14]。初步研究發(fā)現(xiàn),與正常對照組相比,脫細(xì)胞處理組能顯著降低膀胱組織的DNA含量(P<0.01)。因此,本次建立的脫細(xì)胞方法效率高,且經(jīng)脫細(xì)胞處理得到的BAMG符合無細(xì)胞的要求。隨后,依照醫(yī)療器械生物學(xué)評價(jià)的標(biāo)準(zhǔn),選擇MTT法對細(xì)胞增殖率進(jìn)行測定,了解BAMG的體外生物相容性[15-17]。目前,MTT法在大多數(shù)研究中已經(jīng)成為檢測生物材料體外生物相容性的必要手段。本研究結(jié)果顯示,BAMG的浸提液對人原代膀胱平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞增殖能力無顯著影響。最后,通過體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)觀察材料與周圍組織的相容性[16]。研究發(fā)現(xiàn),該材料具有較低的免疫原性,移植后周圍組織炎性癥狀輕微,并未發(fā)生組織壞死及排斥現(xiàn)象,上述結(jié)果證明該材料在體內(nèi)具有較好的生物相容性。

綜上所述,利用不同濃度疊氮鈉快速制備BAMG的方法,制作過程快速簡單,且成本低廉。同時(shí),利用該方法制備的BAMG具有良好的組織相容性,可以作為組織工程膀胱缺損的理想支架,實(shí)現(xiàn)重建膀胱的目的。因此,該方法的提出為膀胱缺損修復(fù)提供了一種新的思路。