雷雪，張培源，王美玉，張紅月，馮雪影

[大慶龍南醫(yī)院（齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院第五附屬醫(yī)院） 臨床藥學(xué)科，黑龍江 大慶163453]

肺結(jié)核是由于機(jī)體免疫功能下降導(dǎo)致的一種肺部感染性疾病。我國(guó)肺結(jié)核疫情嚴(yán)重，且目前治療方案療效不佳，尋找治療肺結(jié)核的新型有效藥物至關(guān)重要[1-2]。肺結(jié)核化療僅對(duì)結(jié)核桿菌具有一定的殺菌作用，在改善機(jī)體免疫上療效不佳[3]。匹多莫德是一種二肽小分子，可有效改善固有免疫及獲得性免疫，已有研究證實(shí)其對(duì)兒童哮喘、復(fù)發(fā)性生殖器皰疹T淋巴細(xì)胞亞群具有重要的調(diào)節(jié)作用[4-5]。但目前匹多莫德輔助化療對(duì)肺結(jié)核的T淋巴細(xì)胞亞群影響較少，且作用機(jī)制尚不明確。本研究通過(guò)復(fù)制肺結(jié)核大鼠模型，探究匹多莫德輔助化療對(duì)肺結(jié)核大鼠療效及外周血T淋巴細(xì)胞亞群的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)、SD雄性大鼠65只，8周齡，體重185～235 g，平均（210±15）g，購(gòu)自北京中國(guó)食品藥品檢定研究院，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0017，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（黑）2022-013。結(jié)核分歧桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（H37Rv）購(gòu)自北京結(jié)核病防治所。

1.2 主要試劑與儀器

異煙肼（國(guó)藥準(zhǔn)字H44020699，廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司，規(guī)格：0.1 g），注射液用利福霉素鈉（賽瑞辰）（國(guó)藥準(zhǔn)字H20050375，江西贛南海欣藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格：0.25 g），匹多莫德片（國(guó)藥準(zhǔn)字H20010091，唐山太陽(yáng)石藥業(yè)有限公司，規(guī)格：0.4 g），中性多聚甲醛上海（赫澎生物科技有限公司），大鼠免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）酶聯(lián)免疫試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），CD3、CD4、CD8 FITC單克隆抗體（湖北艾美捷科技有限公司），兔抗大鼠Toll樣受體4（toll like receptor 4,TLR4）、核轉(zhuǎn)因子κB（nuclear factor-κB,NF-κB）、髓樣細(xì)胞分化因子88（myeloid differentiation factor 88,MyD88）單克隆抗體及山羊抗兔TLR4、MyD88、NF-κB二抗（湖北艾美捷科技有限公司）。

高速冷凍離心機(jī)（型號(hào)：Neofuge13，武漢益普生物科技有限公司），全光譜流式細(xì)胞儀（型號(hào)：Northern Lights，美國(guó)Cytek Biosciences公司），全自動(dòng)生化分析儀（型號(hào)：PUZS-300，上海帝博思生物科技有限公司），石蠟切片機(jī)（型號(hào)：HS-3315，北京巴古頓生物科技有限公司），伯樂(lè)同用電泳儀（型號(hào)：XY-11014，上海信裕生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 大鼠模型復(fù)制及分組 隨機(jī)選取15只大鼠為對(duì)照組，其余大鼠復(fù)制肺結(jié)核模型。將H37Rv菌株培養(yǎng)20 d后，取部分菌落，加生理鹽水（含5%吐溫80）制成1×107cfu/mL菌懸液，取0.4 mL菌懸液，對(duì)大鼠進(jìn)行尾靜脈注射。約1個(gè)月后，大鼠出現(xiàn)皮毛顏色暗淡、稀疏凌亂，食欲不振，體重下降，活動(dòng)明顯減少，嗜睡，即大鼠肺結(jié)核模型復(fù)制成功[6]。其中5只大鼠模型復(fù)制過(guò)程中死亡，其余大鼠隨機(jī)分為模型組、化療組和聯(lián)合治療組，每組15只。

1.3.2 藥物處理 模型復(fù)制成功后，根據(jù)人與大鼠的體重及給藥劑量換算公式[7]，化療組給予異煙肼50 mg/（kg·d），利福霉素鈉50 mg/（kg·d），均腹腔注射。聯(lián)合治療組給予異煙肼50 mg/（kg·d），利福霉素SV鈉50 mg/（kg·d），匹多莫德200 mg/（kg·d），均腹腔注射[8]。對(duì)照組與模型組給予等量的生理鹽水。均連續(xù)治療8周。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血T淋巴細(xì)胞亞群 治療8周后，采集大鼠眼眶靜脈血2 mL，加入肝素抗凝劑及紅細(xì)胞裂解液，混勻后加入1 mL緩沖液，2 000 r/min離心10 min，去除上清液再加入緩沖液0.1 mL，沖洗2次后分別加入CD3+、CD4+及CD8+T淋巴細(xì)胞單抗各1 μL，混勻后孵育30 min，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，記錄細(xì)胞陽(yáng)性染色百分比[9]。

1.3.4 大鼠胸腺指數(shù)和血清IgG水平 治療8周后，采集大鼠眼眶靜脈血2 mL，離心后取上清液，采用IgG酶聯(lián)免疫試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品100 μL，加入50 μL上清液后混勻，依次加入酶標(biāo)記物，顯色劑A、B進(jìn)行顯色及終止液終止反應(yīng)后，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清IgG水平。采集血液后，對(duì)所有大鼠進(jìn)行稱重，并記錄其體重。稱重后所有大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉處理，每組取4只大鼠處死，取胸腺，采用濾紙擦干胸腺表面水分，采用電子天平進(jìn)行稱重，根據(jù)公式計(jì)算胸腺指數(shù)（胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量/體重）[10]。

1.3.5 大鼠肺組織病理學(xué)變化 取出4只大鼠胸腺后，立即取出其肺組織，清洗后置于4%中性多聚甲醛固定，使肺組織蛋白質(zhì)凝固，采用酒精脫去肺組織中的水分，再溶于二甲苯中進(jìn)行透明處理，將透明后的肺組織于溶化的石蠟中包埋，冷卻后用石蠟切片機(jī)切成厚度為4 μm的切片，脫蠟后進(jìn)行蘇木精-伊紅（hematoxylin eosin,HE）染色，于光鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化[11]。

1.3.6 Western blotting檢測(cè)脾臟TLR4、MyD88、NF-kB蛋白的表達(dá) 另取5只大鼠，處死后取出肺組織，液氮中冷凍。取100 mg冷凍肺組織，研磨成勻漿后加入細(xì)胞裂解液，對(duì)肺組織細(xì)胞進(jìn)行裂解，測(cè)定肺組織蛋白濃度，在蛋白樣品中加入上樣緩沖液，進(jìn)行電泳，分離TLR4、MyD88、NF-κB蛋白，轉(zhuǎn)膜后洗去轉(zhuǎn)膜液，室溫封閉60 min，分別加入TLR4、MyD88、NF-κB及內(nèi)參一抗、二抗，孵育后進(jìn)行顯影、定影，洗片后計(jì)算TLR4、MyD88、NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量。蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白光密度值/β-Actin光密度值[12]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群變化

對(duì)照組、模型組、化療組、聯(lián)合治療組CD3+、CD4+、CD8+比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與對(duì)照組比較，模型組、化療組CD3+、CD4+降低，CD8+升高（P<0.05）；與模型組比較，化療組及聯(lián)合治療組CD3+、CD4+升高，CD8+降低（P<0.05）；與化療組比較，聯(lián)合治療組CD3+、CD4+升高，CD8+降低（P<0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群變化 （n =15，%，±s）

表1 各組大鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群變化 （n =15，%，±s）

注：①與對(duì)照組比較，P <0.05；②與模型組比較，P <0.05；③與化療組比較，P <0.05。

CD8+11.64±0.69 16.10±0.61①14.20±0.79①②13.83±0.79②③95.738 0.000組別對(duì)照組模型組化療組聯(lián)合治療組F 值P 值CD3+43.20±8.61 37.61±4.87①41.23±6.42①②45.98±8.89②③3.406 0.024 CD4+35.57±7.91 23.62±5.40①31.54±6.30①②34.69±7.40②③9.534 0.000

2.2 各組大鼠胸腺指數(shù)和血清IgG水平比較

對(duì)照組、模型組、化療組、聯(lián)合治療組胸腺指數(shù)和IgG水平比較，經(jīng)方差分析，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與對(duì)照組比較，模型組，化療組胸腺指數(shù)和IgG水平均降低（P<0.05）；與模型組比較，化療組及聯(lián)合治療組胸腺指數(shù)和IgG水平均升高（P<0.05）；與化療組比較，聯(lián)合治療組胸腺指數(shù)和IgG水平升高（P<0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠胸腺指數(shù)和血清IgG水平比較 （n =15，±s）

表2 各組大鼠胸腺指數(shù)和血清IgG水平比較 （n =15，±s）

注：①與對(duì)照組比較，P <0.05；②與模型組比較，P <0.05；③與化療組比較，P <0.05。

IgG/（g/L）14.10±2.09 7.26±1.15①②10.23±2.01①②12.89±1.27②③48.847 0.000組別對(duì)照組模型組化療組聯(lián)合治療組F 值P 值胸腺指數(shù)/（mg/g）0.37±0.05 0.22±0.05①0.27±0.04①②0.35±0.06②③28.775 0.000

2.3 各組大鼠肺組織的病理檢測(cè)結(jié)果

對(duì)照組肺組織形態(tài)完整，肺泡清晰可見(jiàn)，無(wú)明顯病理變化；模型組肺組織出現(xiàn)壞死、滲出，可見(jiàn)纖維組織增生及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；化療組肺組織局部可見(jiàn)壞死、滲出，纖維組織增生及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少；聯(lián)合治療組肺組織形態(tài)基本完整，僅少量纖維組織增生及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺組織壞死、滲出基本改善。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠肺組織病理切片 （HE染色×100）

2.4 各組大鼠肺組織TLR4、MyD88、NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

對(duì)照組、模型組、化療組、聯(lián)合治療組肺組織TLR4、MyD88、NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與對(duì)照組比較，模型組、化療組TLR4、MyD88、NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量均升高（P<0.05）；與模型組比較，化療組和聯(lián)合治療組TLR4、MyD88、NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量均降低（P<0.05）；與化療組比較，聯(lián)合治療組TLR4、MyD88、NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量均降低（P<0.05）。見(jiàn)表3和圖2。

圖2 各組大鼠肺組織TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)

表3 各組大鼠肺組織TLR4、MyD88、NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （n =5，±s）

表3 各組大鼠肺組織TLR4、MyD88、NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （n =5，±s）

注：①與對(duì)照組比較，P <0.05；②與模型組比較，P <0.05；③與化療組比較，P <0.05。

NF-κB 0.28±0.06 1.25±0.24①0.69±0.17①②0.35±0.08②③121.922 0.000組別對(duì)照組模型組化療組聯(lián)合治療組F 值P 值MyD88 0.59±0.12 1.46±0.21①0.93±0.18①②0.53±0.09②③110.197 0.000 TLR4 0.32±0.10 1.72±0.35①0.84±0.16①②0.47±0.18②③124.060 0.000

3 討論

肺結(jié)核一般發(fā)生于免疫力低下時(shí)，發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，涉及結(jié)核分枝桿菌的感染、復(fù)活和存活，免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)等多個(gè)環(huán)節(jié)[13]。臨床上一般采用抗結(jié)核桿菌藥物進(jìn)行治療，但療效欠佳[14]。T淋巴細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，可通過(guò)分泌細(xì)胞因子和表達(dá)受體來(lái)調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，在肺結(jié)核感染后，特別是在原發(fā)性感染時(shí)，T淋巴細(xì)胞參與對(duì)抗結(jié)核分枝桿菌的免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)，激活巨噬細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞，促進(jìn)免疫反應(yīng)形成[15-16]。因此，探究可有效改善T淋巴細(xì)胞亞群的方式對(duì)提高肺結(jié)核療效具有重要意義。

胸腺是機(jī)體的免疫器官及T淋巴細(xì)胞分化成熟的部位，胸腺指數(shù)可直接反映機(jī)體的免疫能力[17]。本研究中肺結(jié)核大鼠外周血T細(xì)胞亞群及肺組織病理結(jié)果顯示，模型組能夠降低胸腺指數(shù)及CD3+、CD4+，提高CD8+，同時(shí)大鼠肺組織出現(xiàn)壞死、滲出、纖維組織增生及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等現(xiàn)象，表明機(jī)體免疫功能下降，肺組織損傷。經(jīng)過(guò)化療或匹多莫德輔助化療后，胸腺指數(shù)及CD3+、CD4+升高，CD8+下降，免疫反應(yīng)增強(qiáng)，肺組織病理明顯改善。匹多莫德作為一種免疫調(diào)節(jié)劑，可調(diào)節(jié)Th1和Th2免疫應(yīng)答平衡，促進(jìn)細(xì)胞免疫應(yīng)答（增加免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量和功能，有助于調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞的活性；促進(jìn)干擾素γ、白細(xì)胞介素-2生成，促進(jìn)T細(xì)胞的活化和功能增強(qiáng)）。此外，匹多莫德還有抗氧化和抗炎作用，可減輕炎癥反應(yīng)并保護(hù)免疫細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損害，有助于維持T淋巴細(xì)胞的正常功能和活性[18-19]。張輝等[20]研究認(rèn)為，匹多莫德可有效調(diào)節(jié)病毒感染相關(guān)性疾病CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞及兩者比值，從而改善療效。

本研究結(jié)果顯示，治療后模型組TLR4、MyD88、NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量升高，而化療組與聯(lián)合治療組降低，表明肺結(jié)核能夠激活TLR/NF-κB通路，化療及聯(lián)合化療均能抑制該通路。有研究發(fā)現(xiàn)，TLR/NF-κB信號(hào)通路在結(jié)核分歧桿菌感染中發(fā)揮重要作用[12]。結(jié)核分歧桿菌通過(guò)其表面的抗原與宿主TLR相互作用激活下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)NF-κB信號(hào)通路。NF-κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)控多種炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在肺結(jié)核中，TLR激活可促使NFκB進(jìn)入細(xì)胞核并結(jié)合到靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域，從而引發(fā)炎癥因子和免疫調(diào)節(jié)因子的啟動(dòng)。匹多莫德能夠通過(guò)優(yōu)化Th1/Th2免疫功能，抑制TLR/NF-κB通路，緩解炎癥反應(yīng)，部分炎癥因子會(huì)引發(fā)機(jī)體固有免疫反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞免疫應(yīng)答，并將固有免疫逐步轉(zhuǎn)化為獲得性免疫反應(yīng)，從而發(fā)揮更好的治療效果。

綜上所述，匹多莫德輔助化療可改善肺結(jié)核大鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群，增強(qiáng)免疫功能，其作用機(jī)制可能與抑制TLR/NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。本研究仍存在一定不足，如盡管人類(lèi)與大鼠存在諸多相似之處，但仍面臨著許多重要的生物學(xué)差異。通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)獲得的結(jié)果未必能直接適用于人類(lèi)，可能會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的困境，即難以將動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果推廣到人類(lèi)疾病的治療上。因此，今后研究中應(yīng)鼓勵(lì)和支持使用替代方法，如體外細(xì)胞模型、計(jì)算模擬和人體志愿者研究等，以提高研究結(jié)果的可靠性和可轉(zhuǎn)化性。