黃霞，魏津鈿，蘇琪，周志迎，項(xiàng)琪

（1.暨南大學(xué) 口腔醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510632；2.暨南大學(xué)第一附屬醫(yī)院 口腔科，廣東 廣州 510630；3.暨南大學(xué) 生物醫(yī)藥研究院，廣東 廣州 510632）

細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles,EVs）作為細(xì)胞間通訊的傳遞者，是細(xì)胞釋放的包含重要生物信息的雙層脂質(zhì)囊泡。干細(xì)胞經(jīng)旁分泌釋放的細(xì)胞外囊泡（stem cell-derived extracellular vesicles,SC-EVs）在修復(fù)損傷和組織再生方面具有重要作用。在功能上，SC-EVs抑制炎癥反應(yīng)和修復(fù)再生組織；在生物安全方面，SC-EVs的無細(xì)胞移植形式顯著降低了自我排斥的風(fēng)險(xiǎn)[1]。SC-EVs增強(qiáng)成骨相關(guān)的因子表達(dá)，激活核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL）/核因子κB受體活化因子（receptor activator of nuclear factor-κB,RANK）/骨保護(hù)素（recombinant osteoprotegerin,OPG）信號通路，促進(jìn)成骨反應(yīng)。運(yùn)用SC-EVs治療臨床牙槽骨不足、促進(jìn)牙槽骨成骨修復(fù)，是未來有利的治療方法。

1 SC-EVs概述

1.1 EVs的生物學(xué)特性

EVs廣泛存在于人體各種體液中，攜帶多種生物活性物質(zhì)，包括DNA、mRNA、miRNA、脂類、蛋白質(zhì)等，特定mRNA和miRNA的水平轉(zhuǎn)移是EVs誘導(dǎo)受損組織的表觀遺傳重編程和加速再生的關(guān)鍵[2]。EVs在生物物質(zhì)的成分和組成上的差異決定了EVs功能的特異性。根據(jù)發(fā)生機(jī)制和直徑大小，EVs主要分為微囊泡、外泌體和凋亡小體。微囊泡是質(zhì)膜直接向外出芽形成，直徑在100～1 000 nm；外泌體的直徑在30～150 nm，其形成是由細(xì)胞內(nèi)多泡體與細(xì)胞膜融合后釋放的膜性小泡；凋亡小體是細(xì)胞在凋亡過程中釋放的、直徑為50～2 000 nm的細(xì)胞外囊泡[3]。其中外泌體是EVs的一種重要類型，直徑< 200 nm的外泌體同屬于小細(xì)胞外囊泡（small extracellular vesicles,sEVs）一類。外泌體分離的常用方法主要包括超速離心法、密度梯度離心法、超濾法、尺寸排阻色譜法和微流控技術(shù)等，超速離心法是分離EVs的金標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 SC-EVs的生物學(xué)功能

干細(xì)胞具有多向分化及自我復(fù)制的能力，SCEVs可以表現(xiàn)出與親緣干細(xì)胞相近的生物功能，如促進(jìn)組織細(xì)胞增殖分化、細(xì)胞遷移、血管神經(jīng)再生及免疫調(diào)節(jié)等。在炎癥刺激下或組織缺損時，運(yùn)用干細(xì)胞移植進(jìn)行再生治療，干細(xì)胞分化為不同功能的細(xì)胞進(jìn)行修復(fù)，例如心肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等。相似情況下，用SC-EVs同樣能實(shí)現(xiàn)組織器官缺損修復(fù)。JARRIGE等[4]認(rèn)為SC-EVs的作用與SC-EVs的膜性結(jié)構(gòu)特點(diǎn)更易被靶細(xì)胞攝取，并通過其包含的各種信息物質(zhì)miRNA、mRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄表達(dá)。

1.3 SC-EVs骨組織工程

干細(xì)胞骨組織工程常用于修復(fù)損傷組織或器官，通過將自體或異體的干細(xì)胞附著在生物支架上，再移植到組織器官缺損處進(jìn)行修復(fù)，例如在頜骨缺損處放置載有干細(xì)胞的3D打印支架進(jìn)行頜骨修復(fù)。在干細(xì)胞骨組織工程的基礎(chǔ)上，SC-EVs剔除了干細(xì)胞載量不足及免疫原性等問題，因而SC-EVs骨組織工程具有更大優(yōu)勢，含SC-EVs的生物材料同樣可以實(shí)現(xiàn)成骨，如從人第三磨牙中提取的人牙髓干細(xì)胞的外泌體，經(jīng)過物理方式吸附到特定的納米纖維支架上，修復(fù)小鼠頜骨缺損，同時產(chǎn)生新生骨[5]。此外，人牙周膜干細(xì)胞[6]、人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞[7]以及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMSCs）[8]等干細(xì)胞的EVs植入頜骨后，對靶細(xì)胞都具有誘導(dǎo)成骨分化的能力，并且與水凝膠、殼聚糖以及介孔生物活性玻璃等生物材料整合后，能夠用于牙槽骨修復(fù)。不同的干細(xì)胞選擇為組織再生的無細(xì)胞治療構(gòu)建了遠(yuǎn)大前景。

SC-EVs治療疾病的另一優(yōu)勢是可以通過加載外源蛋白質(zhì)或核酸進(jìn)行工程化改造SC-EVs，增強(qiáng)SC-EVs的結(jié)合能力、靶向能力和穩(wěn)定性，提高療效[9]；還有種修飾SC-EVs的方法是在初始的干細(xì)胞培養(yǎng)階段對干細(xì)胞進(jìn)行負(fù)荷工程處理，誘導(dǎo)SCEVs轉(zhuǎn)錄特定分子，使SC-EVs變成高效的藥物輸送工具，實(shí)現(xiàn)腫瘤化療藥物、傳染病疫苗和基因治療藥物的精準(zhǔn)治療。

2 牙槽骨改建機(jī)制

頜骨骨穩(wěn)態(tài)依賴于成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞之間的平衡。成骨細(xì)胞的主要作用是沉積骨，并通過旁分泌活性因子影響破骨細(xì)胞形成。在口腔疾病中，牙周炎和根尖周炎的發(fā)生是病理性牙槽骨吸收，而拔牙骨愈合和正畸治療主要是指生理性骨再生，但兩者都涉及炎癥反應(yīng)。牙槽骨吸收始于菌斑的脂多糖或機(jī)械刺激釋放的促炎因子，刺激組織內(nèi)的免疫細(xì)胞及成骨細(xì)胞釋放炎性介質(zhì)，激活巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，誘導(dǎo)大量的破骨細(xì)胞形成和牙槽骨吸收。

促炎因子在骨吸收和骨愈合過程中起著至關(guān)重要的作用。在距炎癥中心較遠(yuǎn)處，局部同時進(jìn)行牙槽骨的修復(fù)性再生，發(fā)生類骨質(zhì)及新骨的沉積。研究證實(shí)促炎因子通過增強(qiáng)骨髓干細(xì)胞、成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞中的RANKL生成來刺激新骨形成[10]，破骨細(xì)胞的分化和單核細(xì)胞前體的活化均受成骨細(xì)胞分泌的RANKL和OPG之間的平衡進(jìn)行調(diào)節(jié)。

3 RANKL/RANK/OPG信號通路參與SCEVs促進(jìn)牙槽骨成骨

3.1 RANKL/RANK/OPG信號通路

RANK是破骨細(xì)胞上的Ⅰ型三聚化的跨膜蛋白，是在成骨細(xì)胞表面的同聚Ⅱ型跨膜蛋白。RANKL與RANK結(jié)合激活靜止的破骨細(xì)胞，轉(zhuǎn)導(dǎo)到核因子κB（nuclear factor kappa-B,NF-κB）信號通路，使NF-κB易位到細(xì)胞核中，觸發(fā)破骨細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄。

OPG是RANKL的可溶性誘餌受體，OPG與RANK競爭結(jié)合RANKL，且OPG與RANKL間更強(qiáng)的親和力，阻斷了破骨細(xì)胞分化和激活。在成骨細(xì)胞中，RANKL/RANK/OPG通路和Wnt/β-連環(huán)蛋白途徑相互作用，下調(diào)OPG和誘導(dǎo)成骨細(xì)胞合成RANKL來控制骨重塑[11]。

RANKL/RANK/OPG信號通路與牙槽骨成骨關(guān)系密切。首先，口腔中的牙囊和牙周膜均可表達(dá)RANK和RANKL。RANK表達(dá)升高可促進(jìn)成骨細(xì)胞發(fā)生調(diào)節(jié)因子Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2轉(zhuǎn)錄，牙槽骨吸收加快，牙齒萌出骨阻力減輕，導(dǎo)致牙齒早萌[12]。RANKL封閉抗體則可阻止RANKL與RANK結(jié)合，使骨吸收暫時抑制，導(dǎo)致牙齒遲萌。其次，OPG在口腔牙齦上皮細(xì)胞和結(jié)締組織中表達(dá)[13]。OZAKI等[14]發(fā)現(xiàn)當(dāng)OPG缺陷小鼠患上牙周炎時，該小鼠的牙周破壞程度進(jìn)一步加重，此時使用RANKL結(jié)合肽便可治療牙周炎，因?yàn)槠茐暮笙骂M第一磨牙牙根間隔骨質(zhì)在結(jié)合肽治療后有了明顯成骨現(xiàn)象。同樣，在正畸牙齒移動過程中，正畸牙的受壓側(cè)和牽張側(cè)的齦溝液中，RANKL、OPG的含量會隨正畸力大小產(chǎn)生相應(yīng)變化。

3.2 SC-EVs與RANKL/RANK/OPG信號通路

SC-EVs通過攜帶的生物活性成分誘導(dǎo)受體細(xì)胞發(fā)生信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。SC-EVs的作用機(jī)制是同時影響受體細(xì)胞多個基因和多條信號通路，激活受體細(xì)胞的生物功能。針對SC-EVs促進(jìn)牙槽骨再生修復(fù)方面，其機(jī)制主要包括以下幾種方式：通過上調(diào)骨誘導(dǎo)性miRNA和下調(diào)骨抑制性miRNA激活PI3K/Akt和MAPK等信號通路從而發(fā)揮作用；通過激活蛋白激酶B，影響ERK/AMPK等信號通路；在細(xì)胞間高效地遞送SC-EVs攜帶的信號分子，促進(jìn)RANKL/RANK/OPG信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)。RANKL、RANK與OPG 3者間的比例變化刺激胞內(nèi)NF-κB經(jīng)典和非經(jīng)典途徑的骨代謝途徑，引起骨代謝發(fā)生轉(zhuǎn)換。RANKL/RANK/OPG信號通路對調(diào)節(jié)骨重建有重要作用，確認(rèn)SC-EVs通過RANKL/RANK/OPG信號通路促進(jìn)牙槽骨成骨，也是闡明EVs作用機(jī)制的重要切入點(diǎn)。

ALI等[15]研究表明，齦溝液RANKL含量增加或RANKL/OPG比值增高常預(yù)示骨量減少，并伴牙槽骨吸收或牙周炎的風(fēng)險(xiǎn)。因此，降低RANKL表達(dá)或調(diào)節(jié)RANKL/OPG比值是預(yù)防牙槽骨吸收、輔助成骨的有效策略。在體內(nèi)，含有RANKL的骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞與含有RANK的破骨細(xì)胞往往在空間上距離較遠(yuǎn)[16]，局部注射SC-EVs可以保證SC-EVs被靶細(xì)胞高效攝取并在局部較長時間保留，有利于充分發(fā)揮治療作用[17]。此外，SC-EVs可以在體內(nèi)模擬親緣干細(xì)胞的歸巢效應(yīng)，這解釋了SC-EVs為什么能在骨組織中發(fā)生定向遷移，誘導(dǎo)成骨分化。

LIU等[18]研究發(fā)現(xiàn)在體外運(yùn)用BMSCs的sEVs（BMSCs-sEVs）可以促進(jìn)人牙周膜細(xì)胞的遷移、增殖和成骨分化。將BMSC-sEVs與水凝膠整合后注入大鼠牙周炎部位，可以在微型CT下觀察到牙槽骨質(zhì)流失減輕和牙周骨再生的影像；也同時定向檢測到實(shí)驗(yàn)組大鼠RANKL/OPG比值降低，轉(zhuǎn)化生長因子-β1的表達(dá)和2型巨噬細(xì)胞與1型巨噬細(xì)胞的比例增加。說明BMSCs-sEVs通過RANKL/RANK/OPG信號通路激活破骨細(xì)胞的功能，同時通過影響巨噬細(xì)胞極化和轉(zhuǎn)化生長因子-β1表達(dá)，調(diào)節(jié)炎癥免疫反應(yīng)，抑制牙周炎的發(fā)展和牙周組織的免疫損傷[18]。HUANG等[19]證實(shí)脂肪干細(xì)胞釋放的EVs可以作為骨質(zhì)疏松癥的無細(xì)胞治療劑，其中的2種miRNA：miR-21-5p和let-7b-5p具有減輕骨吸收作用。miR-21-5p是骨誘導(dǎo)性miRNA，可以促進(jìn)RANKL與OPG結(jié)合，因而近來被認(rèn)為是骨質(zhì)疏松癥的治療靶點(diǎn)[20]。

牙囊干細(xì)胞來源于外胚層間充質(zhì)，是牙周組織的前體細(xì)胞，可分化成牙周膜細(xì)胞、成骨細(xì)胞及成牙骨質(zhì)細(xì)胞。SHI等[21]發(fā)現(xiàn)用脂多糖預(yù)處理過的牙囊干細(xì)胞釋放的sEVs（L-D-sEVs）在治療牙周炎方面效果顯著。不僅治療初期牙槽骨流失得到修復(fù)，治療后期也能維持一定水平的牙槽骨量。該研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)用L-D-sEVs-水凝膠后，牙周組織中RANKL/OPG比值和活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平明顯降低，骨質(zhì)破壞范圍更小、骨吸收程度減輕。L-D-sEVs減輕牙槽骨吸收的機(jī)制可能與牙周炎組織ROS產(chǎn)生減少有關(guān)。因?yàn)镽OS過度積累會導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷，同時ROS介導(dǎo)的JNK信號通路可反向激活RANKL誘導(dǎo)的破骨形成，加重骨流失[22]。類似的研究也證實(shí)，牙源性干細(xì)胞如牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞[23]和根尖牙乳頭干細(xì)胞[24]等來源的外泌體可以促進(jìn)牙槽骨再生修復(fù)。對正畸治療和牙周治療來說，SC-EVs是新的潛在治療手段。對比其他間充質(zhì)干細(xì)胞，牙源性干細(xì)胞來源的SCEVs具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)組織再生功能。SC-EVs促進(jìn)牙槽骨骨量不足時的骨改建，增加了正畸牙移動的速率，減輕牙周病骨量流失，為臨床醫(yī)生提供了新思路。

4 問題與展望

SC-EVs治療方案是牙槽骨組織再生修復(fù)的新方向，作為納米級的無細(xì)胞治療手段，完善了干細(xì)胞移植治療的不足之處，在減輕骨量流失和促進(jìn)骨修復(fù)中都有確切作用。SC-EVs具有較高的生物異質(zhì)性，但因缺乏更完善的分離和提純實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)，以及質(zhì)量檢測手段，在現(xiàn)實(shí)的實(shí)驗(yàn)操作中存在許多困難，限制了SC-EVs的深入研究和臨床轉(zhuǎn)化。當(dāng)前SC-EVs的應(yīng)用大多數(shù)局限于體外實(shí)驗(yàn)和小鼠試驗(yàn)，而大型動物實(shí)驗(yàn)開展較少。骨組織工程學(xué)是個快速發(fā)展的領(lǐng)域，現(xiàn)有骨組織工程支架材料如生物陶瓷材料、聚合物材料及醫(yī)用金屬材料，在修復(fù)骨缺損上取得了一定成果。但仍需不斷探索能更好滿足組織特征、組織孔隙度、良好機(jī)械性能和生物相容性及骨誘導(dǎo)能力的個性化復(fù)合支架，供日后臨床治療使用。