費福林,劉麗莎,谷鑫,龍正串,趙勇,3,4,劉海泉,3,4,5*,白莉*

1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院,上海,201306)2(國家食品安全風(fēng)險評估中心,國家衛(wèi)生健康委員會食品安全風(fēng)險評估重點實驗室,中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院創(chuàng)新單元(2019RU014),北京,100022) 3(上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心,上海,201306) 4(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室,上海,201306) 5(上海海洋大學(xué),食品熱加工工程技術(shù)研究中心,上海,201306)

單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)簡稱單增李斯特菌,能在廣泛的鹽濃度、溫度和pH值條件下生存,是全球重要食源性致病菌[1-2],易感人群為老年人、新生兒、孕婦和免疫功能低下的患者,致死率高達(dá)20%～30%[3]。李斯特菌病主要通過食用受污染的食品傳播給人類,例如肉類、蔬菜、魚類、加工食品、即食食品和乳制品等食品[4],食源性比例高達(dá)99%[5]。2011年,美國28個州的147人因食用污染的哈密瓜感染李斯特菌病,其中33名患者死亡[6];2018年,南非因豬肉香腸污染,導(dǎo)致1 034例病例和204例死亡,預(yù)估損失近3億美元[7]。在中國2008—2017年部分臨床病例(759例)報告中,有128人(18%)死亡,其中新生兒93人,占73%[8]。

近年來,隨著居民飲食習(xí)慣的改變、冷鏈物流的成熟以及即食食品的消費需求增加,我國居民發(fā)生李斯特菌病的風(fēng)險呈上升態(tài)勢[9]。因此,我國亟需開展相關(guān)食品的單增李斯物菌的風(fēng)險評估工作。已有研究發(fā)現(xiàn),從不同環(huán)境中分離的致病菌在生長、毒力、生物被膜形成和耐藥性等表型方面存在廣泛的差異性,即微生物的異質(zhì)性[10-12]。研究者們[13-15]探究了不同來源和不同基因型的副溶血性弧菌在純培養(yǎng)、食品基質(zhì)和人工模擬胃液環(huán)境下的生長異質(zhì)性,結(jié)果表明致病基因型(tlh+/tdh+/trh-)菌株在純培養(yǎng)和模擬胃液環(huán)境下表現(xiàn)出更大的生長異質(zhì)性。微生物的生長異質(zhì)性直接影響風(fēng)險評估“危害特性描述”和“暴露評估”過程,影響劑量反應(yīng)模型結(jié)果的可靠性,給風(fēng)險評估工作帶來巨大的挑戰(zhàn)[16]。

根據(jù)菌體抗原H和鞭毛抗原O的特異性不同,L.monocytogenes可分為13個血清型(1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4ab、4b、4c、4d、4e和7),其中1/2a、1/2b、1/2c和4b為主要血清型,占食品和臨床分離株的95%以上[2,17]。1/2a和1/2b型菌株在食品中檢出較高,感染后可導(dǎo)致腹瀉、發(fā)燒、嘔吐等癥狀[18]。在李斯特菌病的流行暴發(fā)中,4b型菌株為優(yōu)勢致病血清型,患者感染4b型菌株時的死亡率為26%,而感染1/2a或1/2b型菌株的患者死亡率為16%[19]。在我國,食品和臨床病例中最常見的是1/2b型菌株[20]。

因此,為了構(gòu)建基于“中國國情”的異質(zhì)性數(shù)據(jù)庫以減少異質(zhì)性對風(fēng)險評估的影響,本文選取了來自我國不同地區(qū)的40株L.monocytogenes,通過Biosceen C全自動微生物生長曲線分析儀測定不同來源及血清型的L.monocytogenes在37、25、10 ℃下的生長數(shù)據(jù),建立生長預(yù)測模型擬合得到以μmax為主的生長參數(shù),分析不同來源和血清型的菌株之間的差異,豐富具有“中國特色”的L.monocytogenes生長異質(zhì)性數(shù)據(jù)庫,為開展L.monocytogenes精準(zhǔn)定量風(fēng)險評估提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

40株L.monocytogenes由國家食品安全風(fēng)險評估中心鑒定保存,具體菌株信息如表1所示。

表1 四十株單增李斯特菌菌株信息Table 1 Information of 40 L.monocytogenes strains

BHI肉湯、PALCAM培養(yǎng)基基礎(chǔ)、PALCAM選擇性添加劑,北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Bioscreen FP-1100C型全自動微生物生長曲線分析儀,芬蘭Oy Growth Curves Ab公司;ZQZY-70B振蕩培養(yǎng)箱,上海知楚儀器有限公司;GHP-9270型隔水式恒溫培養(yǎng)箱,上海一恒科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 不同溫度條件下L.monocytogenes的生長實驗

將L.monocytogenes從-80 ℃保存的甘油管中活化,劃線至PALCAM平板,37 ℃培養(yǎng)48 h。挑取單菌落接種至9 mL BHI肉湯中,振蕩培養(yǎng),37 ℃,150 r/min,培養(yǎng)5～8 h,再次接種至BHI肉湯中,37 ℃振蕩培養(yǎng),菌株生長到達(dá)指數(shù)中期,以此為初始接種液。

參考LIU等[13]的方法,在Bioscreen C配套的100微孔板中進(jìn)行梯度稀釋。吸取初始接種液20 μL接種至第一孔180 μL BHI肉湯中,以此為第一稀釋梯度。用移液器吹吸混勻后進(jìn)行逐級稀釋,依次梯度稀釋到第5孔(～104CFU/mL)BHI肉湯中,按相同方式做3個平行。Bioscreen C設(shè)置吸光度為600 nm的寬波段,溫度分別為37、2、和10 ℃,時間分別為24、48、96 h,測定生長曲線,每組試驗重復(fù)3次。

1.3.2 生長參數(shù)擬合

采用修正Gomperz生長模型[21],得到菌株的延滯期(λ)、最大比生長速率(μmax)、最大最小生長密度之差(ymax),計算擬合決定系數(shù)(R2)、變異系數(shù)(coefficient of variation,CV)。調(diào)整優(yōu)化后的修正Gomperz生長模型表達(dá)式如公式(1)所示:

(1)

式中:A為最初的細(xì)菌接種量OD值;C為最大菌種量與初始菌種量OD值之差;μmax為最大比增長速率,OD/h;t為時間,h;λ為延滯期,h。模型評價采用R2,決定系數(shù)R2值在0～1,且越靠近1即表明預(yù)測模型的參考價值越高。

CV的計算如公式(2)所示:

(2)

1.3.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

生長曲線擬合分析采用Origin Pro 2021軟件,顯著性差異比較采用SPSS statistics 26.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA),P<0.05,差異顯著,具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度下40株L.monocytogenes的μmax分析

40株L.monocytogenes在37、25、10 ℃下的生長數(shù)據(jù)均可用修正Gomperz生長模型進(jìn)行擬合,擬合決定系數(shù)R2在0.972～0.998,表明所選模型擬合效果良好。37、25、10 ℃條件下40株L.monocytogenes的μmax值分別為0.206～0.332、0.167～0.232、0.036～0.066 OD/h,結(jié)果見圖1。

圖1 四十株不同來源L.monocytogenes在37、25和10 ℃下的μmaxFig.1 Specific growth rate μmax of 40 L.monocytogenes strains from different sources at 37、25, and 10 ℃

由圖1可知,隨著溫度降低,L.monocytogenes菌株的μmax顯著減小。以37 ℃的最佳生長條件為參照,LM1～LM40菌株在37 ℃條件下的平均μmax值呈現(xiàn)階梯狀增長的趨勢。與37 ℃條件相比,25、10 ℃條件下菌株的生長是隨機(jī)的,沒有固定的趨勢,這與LIU等[13]的研究中的現(xiàn)象相同。25 ℃條件下,LM28菌株的μmax值最大,LM23菌株的μmax值最小,但在10 ℃條件下,LM23菌株的μmax值最大,LM27菌株的μmax值最小。

2.2 不同溫度對40株L.monocytogenes的動力學(xué)生長參數(shù)影響

采用修正Gomperz生長模型對40株L.monocytogenes在不同溫度下的生長數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合,得到40株不同來源的L.monocytogenes在37、25、10 ℃條件下的延滯期(λ)、最大比生長速率(μmax),計算CV,結(jié)果見表2。

表2 四十株L.monocytogenes在37、25、10 ℃下的動力學(xué)生長參數(shù)Table 2 Kinetic growth parameters of 40 L.monocytogenes strains at 37、25, and 10 ℃

由表2可知,40株L.monocytogenes的平均λ值隨著溫度的升高而減少,平均μmax值隨著溫度的升高而增大(P<0.05)。菌株的最大比生長速率的CV值代表了L.monocytogenes菌株的生長異質(zhì)性。隨著溫度的升高,L.monocytogenes菌株的CV值先降低后增加。在25 ℃條件下,L.monocytogenes菌株的CV值最小,此時L.monocytogenes菌株對環(huán)境變化的響應(yīng)小。另外,在37、10 ℃的生長環(huán)境中進(jìn)行菌株選育,有助于減小菌株生長異質(zhì)性對風(fēng)險評估的影響。

2.3 不同來源對L.monocytogenes菌株的生長異質(zhì)性影響

統(tǒng)計臨床和食品分離菌株在不同溫度下的平均μmax值進(jìn)行顯著性差異分析,結(jié)果見圖2。在37、25、10 ℃下,臨床菌株的平均μmax值均大于食品分離菌株。在25 ℃下,臨床和食品分離菌株的μmax值分別為(0.212±0.014)、(0.191±0.013) OD/h,存在顯著性差異,其他條件下差異不顯著。

圖2 37、25、10 ℃下40株臨床和食品分離L.monocytogenes菌株之間的箱線圖Fig.2 Box plot between 40 clinical and food isolates of L.monocytogenes strains at 37, 25, and 10 ℃注:*表示與臨床株相比差異顯著(P<0.05)。

如圖3所示,隨著溫度升高,臨床和食品分離菌株的CV值均是先減少后增大,在25 ℃時,菌株的生長異質(zhì)性最小,與表2顯示的整體40株菌株在不同溫度下的CV值的趨勢相同。臨床菌株在37、25、10 ℃下的CV值均小于食品分離菌株,這表明臨床菌株的生長異質(zhì)性小于食品分離株。已有研究發(fā)現(xiàn),與食品分離菌株相比,臨床菌株往往具有更強(qiáng)的毒力和致病力,更好地適應(yīng)宿主腸道環(huán)境[22-23]。37 ℃條件下,強(qiáng)致病力的臨床菌株表現(xiàn)出較小的生長異質(zhì)性,可能導(dǎo)致其更好地定植于腸腔,更有效地侵入宿主組織,增加感染人員健康風(fēng)險。

圖3 不同來源的L.monocytogenes菌株在37、25、10 ℃下的CV值Fig.3 The CV values of L.monocytogenes strains from different sources at 37, 25, and 10 ℃

2.4 不同血清型L.monocytogenes菌株的生長異質(zhì)性

不同血清型L.monocytogenes菌株在不同溫度下的μmax值呈現(xiàn)出不同程度的差異性,結(jié)果見表3。在不同溫度條件下,不同血清型菌株之間的μmax值沒有明顯規(guī)律。在25 ℃下,1/2b、1/2c和4b型菌株的μmax值顯著大于1/2a型菌株(P<0.05)。在10、37 ℃下,不同血清型的菌株之間的μmax值并沒有顯著性差異。

表3 不同血清型的L.monocytogenes菌株在37、25、10 ℃下的μmax均值 單位:OD/h

不同血清型的L.monocytogenes菌株的致病力有所不同。絕大多數(shù)暴發(fā)或散發(fā)的侵襲型李斯特菌病病例由4b型引起,而腸胃炎型病例多由1/2a和1/2b引起,其中1/2b和4b型屬于譜系I,1/2a和1/2c型屬于譜系Ⅱ[24-25],而譜系I的菌株的毒力強(qiáng)于譜系Ⅱ內(nèi)的菌株[22]。在25 ℃下,致病力更強(qiáng)的1/2b和4b型菌株的μmax值顯著大于1/2a型菌株;譜系I內(nèi)不同血清型菌株之間在不同溫度下的μmax值無明顯差異,譜系Ⅱ的1/2c型菌株在25 ℃時的μmax值顯著大于1/2a型菌株。

不同血清型菌株在不同溫度條件下的μmax的CV值如圖4所示。隨著溫度的升高,不同血清型菌株的生長異質(zhì)性都先減小后增大,在25 ℃時,菌株的生長異質(zhì)性最小,與表2顯示的整體40株菌株在不同溫度下的CV值的趨勢相同。除1/2b型菌株外,其他血清型菌株的CV在37 ℃條件下達(dá)到最大,表現(xiàn)出最大的生長異質(zhì)性;在25 ℃時,1/2a的CV值最低;在10 ℃時,4b型菌株的生長異質(zhì)性最小,表現(xiàn)出對較低溫環(huán)境的良好適應(yīng)。

圖4 血清型對L.monocytogenes在37、25、10 ℃下的生長異質(zhì)性的影響Fig.4 The influence of serotype on the growth heterogeneity of L.monocytogenes at 37, 25, and 10 ℃

3 結(jié)論與討論

本研究發(fā)現(xiàn),37、10 ℃下,不同來源、不同致病力的L.monocytogenes之間的μmax無顯著性差異,這表明在人體環(huán)境下,溫度對不同致病力的L.monocytogenes的生長速率無顯著影響。在25 ℃條件(常溫環(huán)境)下,1/2b型菌株具有顯著的生長優(yōu)勢,其在我國的臨床和食品樣本的高檢出率可能與此有關(guān)[20]。另外,譜系I內(nèi)的1/2b和4b菌株在25 ℃條件時表現(xiàn)出更佳的生長狀況,這表明在常溫條件下,致病力強(qiáng)的1/2b和4b型L.monocytogenes菌株在食品中的污染水平更高。感染李斯特菌病的關(guān)鍵因素之一是食物帶菌量,被污染食物可能因達(dá)不到感染量而不引起疾病[3]。因此,污染水平更高的1/2b和4b型L.monocytogenes菌株進(jìn)入人體后,更容易穿過消化道、血胎和血腦屏障,從而增加嬰兒死亡、腦膜炎和敗血癥等疾病風(fēng)險[32]。1/2b和4b菌株在常溫下的生長優(yōu)勢可能是導(dǎo)致其具有強(qiáng)致病力的原因之一。

微生物生長異質(zhì)性是為了適應(yīng)復(fù)雜多變的生存環(huán)境,從而表現(xiàn)出生長行為的差異,是微生物變異和多樣性的基礎(chǔ)。L.monocytogenes作為一種高度多樣化的物種,寬泛的生存環(huán)境決定了L.monocytogenes菌株在生長、毒力等表型存在不同程度的異質(zhì)性。正是由于這種菌株間的生長異質(zhì)性,導(dǎo)致劑量-反應(yīng)模型結(jié)果的不準(zhǔn)確性,直接影響了風(fēng)險評估“危害特性描述”和“暴露評估”過程,從而夸大或降低了食源性致病菌的真實風(fēng)險,威脅我國人民的健康安全。然而這種菌株之間的差異源于其固有屬性,無法降低或消除。因此,只有將生長異質(zhì)性作為微生物風(fēng)險評估中篩選特征良好菌株或混合菌株的科學(xué)依據(jù),并納入精準(zhǔn)劑量-反應(yīng)模型及風(fēng)險表征的考量范疇,才能更加科學(xué)、準(zhǔn)確地描述食源性致病菌在食品中的存在情況,客觀、精準(zhǔn)地評估微生物對不同人群的健康風(fēng)險,保障人民的生命安全。

綜上,本研究對40株不同來源和不同血清型的單增李斯特菌在不同溫度(10、25、37 ℃)下的生長動力學(xué)特征進(jìn)行了研究。研究結(jié)果表明,不同溫度下臨床菌株的平均μmax值大于食品分離株,臨床菌株的生長變異系數(shù)小于食品分離株,表現(xiàn)出較小的溫度生長異質(zhì)性;同時在25 ℃時,強(qiáng)致病力的1/2b和4b型菌株表現(xiàn)出了更顯著的生長優(yōu)勢;4b型菌株對較低溫度具有更好的適應(yīng)性。本研究結(jié)果將為我國L.monocytogenes精準(zhǔn)風(fēng)險評估以及實驗中的菌株選擇提供數(shù)據(jù)支撐,為科學(xué)地進(jìn)行食源性致病菌疾病防控提供依據(jù)。