薛丕良,李星宇,王向偉,王文文,莊 巖

(黑龍江省中醫(yī)藥科學院·黑龍江 哈爾濱 150036)

膜性腎病(membranous nephropathy,MN)是以腎小球基底膜上皮細胞下彌漫的免疫復合物沉積伴基底膜彌漫增厚為主要病理表現(xiàn),以腎病綜合征或無癥狀性蛋白尿為主要表現(xiàn)的慢性腎臟疾病。研究表明,足細胞凋亡在MN發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用,足細胞的損傷或凋亡是MN及蛋白尿發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵[1-3],因此,預防和治療膜性腎病,抑制足細胞凋亡可能是其關(guān)鍵手段之一[4]。隨著激素和免疫抑制劑臨床嚴重不良反應的增多[5],中藥治療膜性腎病逐漸得到認可和應用[6]。參芪蛭龍湯是黑龍江省中醫(yī)藥科學院治療MN的有效處方[7-8]。本研究擬建立膜性腎病小鼠模型,探討參芪蛭龍湯對膜性腎病小鼠腎臟的保護作用及其對Bcl-2、Bax、Caspase-3信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物 參芪蛭龍湯組方中藥(黨參、黃芪、當歸、川芎、水蛭、地龍、僵蠶、虎杖等)飲片均由黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院提供,經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院田明教授鑒定均為真品;以上藥味,加10倍量水(約1 800 mL)浸泡1 h,煎煮1 h后,濾過,藥渣再加10 倍量水(約1 800 mL),煎煮1 h,濾過,合并2 次濾液,濃縮至1.2 g/mL(按生藥總量計),分裝后,-80 ℃冰箱凍存。雷公藤多苷片:湖南千金協(xié)力有限公司,批號:1901113B,規(guī)格:10 mg/片。

1.3 試劑 陽離子牛血清白蛋白(c-BSA):美國Chondrex公司;ECL發(fā)光液:沈陽萬類生物科技有限公司;TRIpure:北京百泰克生物技術(shù)有限公司;BeyoRT II M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶:上海碧云天生物技術(shù)有限公司;RNase inhibitor:北京百泰克生物技術(shù)有限公司;2×Taq PCR MasterMix:北京索萊寶科技有限公司;SYBR Green:北京索萊寶科技有限公司。一抗(Caspase-3、Bax、Bcl-2):沈陽萬類生物科技有限公司;二抗羊抗兔IgG-HRP:沈陽萬類生物科技有限公司;過碘酸-雪芙(PAS)染色試劑盒:上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.4 儀器 H-2050R超速冷凍離心機:湖南湘儀離心機儀器有限公司;ELX-800酶標儀:美國BIOTEK;Exicycler 96熒光定量PCR儀:韓國BIONEER;DYY-7C型電泳儀:北京市六一儀器廠;IX53顯微鏡:日本OLYMPUS。

1.5 實驗方法

1.5.1 動物造模、分組及給藥 小鼠適應性喂養(yǎng)3 d后,將160 mgC-BSA凍干粉溶于30 mLPBS磷酸緩沖液中,與等量的不完全弗氏佐劑混合后,超聲使其完全乳化。在小鼠腋窩和腹股溝區(qū)域內(nèi)的6處進行皮下注射,每處皮下注射量不超過0.05 mL,每只0.3 mL[9]。預免疫1 周后,對造模小鼠尾靜脈注射乳化液,注射量為16 mg/kg,每周注射3 次。在6 周內(nèi)將注射量逐漸增加至25 mg/kg。于造模第3周,測定小鼠24 h尿蛋白定量(UTP),若超過20 mg即為造模成功。

將造模成功的小鼠40只按體質(zhì)量隨機分為模型組,參芪蛭龍湯高劑量(24 g/kg,成人臨床等效劑量0.5 倍,按體表面積法換算而得)、低劑量組(12 g/kg,成人臨床等效劑量的0.25倍),雷公藤多苷片組(陽對組)(14 mg/kg),每組10只,另取10只未造模的小鼠作為正常組。正常對照組和模型對照組小鼠灌胃等體積生理鹽水,各給藥組小鼠灌胃相應藥物10 mL/kg,每日1 次,連續(xù)給藥4 周后處死小鼠。

1.5.2 觀察指標及測定

1.5.2.1 腎臟病理學觀察

七哥不帥，但五官很立體，皮膚微黑，不多言。搞戶外的沒有小白臉，肌肉線條不用說，讓女生見了就忍不住流口水。

HE 染色:取小鼠腎組織放置于組織包埋盒中,福爾馬林固定,石蠟包埋后制成4 μm切片,蘇木素、伊紅染色,封片。在光學顯微鏡200 倍視野下觀察各組病理變化。

Masson 染色:切片脫蠟入水,蘇木精染液5 min,充分水洗后1%鹽酸乙醇分化,經(jīng)麗春紅染色5 min,2%冰醋酸水溶液浸洗1 min,沖洗后滴加1 %磷鉬酸溶液分化5 min, 隨后用苯胺藍液復染5 min,再用2%冰醋酸處理1 min,之后脫水、透化、中性樹膠封片固定,顯微鏡下觀察組織形態(tài)。

PAS染色:石蠟切片常規(guī)脫蠟后蒸餾水洗滌,過碘酸溶液平衡至室溫后滴加100 μL,在濕盒中避光反應10 min后,去除過碘酸溶液,蒸餾水中洗滌5 min。滴加100 μLSchiff試劑,放入濕盒中,置于37 ℃烘箱避光染色1 h。去除染色液,蒸餾水中洗滌5 min。滴加100 μL蘇木素染色液,染色30 s。去除染色液,蒸餾水漂洗兩次以上,每次3 s,直到浮色洗去。使用鹽酸乙醇分化液分化30 s,自來水返藍5 min。中性樹膠封片,顯微鏡下觀察和拍照。

1.5.2.2 RT-PCR檢測腎組織Bcl-2、Bax、Caspase3 mRNA表達

腎組織加入TRIpure裂解液、氯仿、異丙醇等提取樣本總RNA。酶標儀檢測RNA濃度稀釋至100 mg/L。

反轉(zhuǎn)錄得到對應的cDNA后進行實時熒光定量分析,反應體系為1 μLcDNA模板,上下游引物(10 μmol/L) 各0.5 μL,10 μLSYBR GREEN mastermix,用ddH2O補足至20 μL。擴增條件為94 ℃、5 min,94 ℃、10 s,60 ℃、20 s,72 ℃、30 s,40 個循環(huán); 溶解曲線分析94 ℃、10 s,臺階采樣,臺階溫度0.5 ℃。引物序列見表 1。結(jié)果采用 2-△△ CT方法進行分析。

表1 實時熒光定量PCR引物

1.5.2.3 Western-blot檢測腎組織Caspase3、Bax、Bcl-2蛋白表達

將小鼠腎組織用裂解液裂解后,離心取上清后進行蛋白定量,上樣量為40 μg。制備聚丙烯酰胺凝膠,5 %的濃縮膠,10 %～12 %的分離膠。轉(zhuǎn)膜后,脫脂奶粉封閉,1∶(500～1000)稀釋一抗,4 ℃過夜,二抗避光孵育2 h,ECL化學發(fā)光。將PVDF膜進行掃描,用凝膠成像處理系統(tǒng)分析目標條帶的光密度值,以各組光密度與空白組光密度的比值計算蛋白相對表達量。

1.6 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用 SPSS 26 統(tǒng)計軟件進行分析,單因素方差分析方法分析多組間差異,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠腎組織病理學變化

HE染色可見正常組小鼠腎小球結(jié)構(gòu)完整,模型組小鼠腎小球體積增大,腎小球毛細血管袢擴張,血細胞溢出,空泡、變性等,腎小球系膜增厚,局部腎小囊腔壁上皮嚴重破損。與模型組比較,參芪蛭龍湯高劑量組腎小球體積減小,僅有炎性細胞浸潤減少。Masson 染色可見藍色膠原纖維組織,與模型組比較,各給藥組可見腎小球體積有所減小,基底膜增厚及組織纖維化有所減輕。PAS染色發(fā)現(xiàn),模型組小鼠基底膜增厚明顯,皺縮,出現(xiàn)釘突樣及空泡狀改變,各給藥組基底膜病變狀態(tài)較模型組顯著減輕,參芪蛭龍湯高劑量組并未出現(xiàn)明顯基底膜增厚等改變。見圖1。

圖1 各組小鼠腎組織病理變化(20×)

2.2 各組小鼠腎組織Bcl-2、Bax、Caspase3 mRNA表達的RT-PCR檢測結(jié)果 見表2。

表2 各組小鼠腎組織Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA表達的比較

2.3 各組小鼠腎組織Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達的Western-blot檢測結(jié)果 見圖2,表3。

注:A.模型組;B.正常組;C.參芪高劑量組;D.參芪低劑量組;E.雷公藤組圖2 各組小鼠腎組織Bcl-2、Bax、Caspase3蛋白表達的Western blot 檢測結(jié)果

表3 各組小鼠腎組織Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白相對表達量比較

3 討論

膜性腎病在古代中醫(yī)典籍未有相關(guān)的論述,根據(jù)其具有水腫、大量蛋白尿的臨床特征,可將其歸屬于中醫(yī)“水腫”“尿濁”范疇。目前大多數(shù)醫(yī)家認為正氣不足是膜性腎病的基本病機,屬本虛標實證;以氣(陽)虧虛為主,主要累及腎、脾兩臟,與肺、肝相關(guān),水濕、濕熱、瘀血等在病機演變過程中既是病理產(chǎn)物,又是病情加重、纏錦難愈的重要因素。以脾腎虧虛為本,濕濁瘀血為標。

參芪蛭龍湯是本院治療膜性腎病的經(jīng)驗方,方中以黨參、黃芪、淫羊藿為君藥,其中黃芪補氣升陽、利水消腫,適用于氣虛失運、水濕停聚引起的肢體面目浮腫、小便不利;黨參補中益氣,為脾胃氣虛之要藥;淫羊藿補益腎陽、鼓舞腎氣;當歸、川芎、水蛭、地龍、僵蠶為臣藥,其中當歸、川芎活血化瘀;水蛭、地龍、僵蠶蟲類藥入絡、化瘀消癥;虎杖、鳳尾草活血化瘀、利水消腫為佐藥。全方共奏補益脾腎、化瘀利濕之效。

腎小球濾過膜主要由毛細血管內(nèi)皮細胞、腎小球基膜和臟層上皮細胞組成。臟層上皮細胞又稱足細胞,是腎小球濾過膜的最后一道防線。足細胞的損傷程度及數(shù)量變化直接導致腎小球濾過功能不可逆性的受損,是膜性腎病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素,因而抑制足細胞的凋亡,保護足細胞數(shù)量及結(jié)構(gòu)正常是治療膜性腎病的關(guān)鍵[10-13]。研究表明,Caspase-3是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶,Caspase-3激活后將啟動細胞凋亡[14];抗凋亡蛋白Bcl-2與促凋亡蛋白Bax 同屬于Bcl-2家族,二者可形成更加穩(wěn)固的Bax-Bcl-2異源二聚體抑制細胞凋亡[15],Bcl-2/Bax比值是衡量細胞凋亡的重要指標,可決定Caspase-3激活狀況和細胞凋亡的嚴重程度。本實驗顯示,經(jīng)參芪蛭龍湯治療的MN小鼠腎組織Bax、Caspase-3蛋白表達比模型組下降顯著,Bcl-2蛋白表達比模型組升高顯著,提示凋亡減少。表明參芪蛭龍湯抑制MN小鼠鼠腎臟足細胞凋亡可能與調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax、Caspase-3信號通路有關(guān)。

因此,參芪蛭龍湯可明顯改善MN小鼠腎組織的病理狀態(tài),Bcl-2、Bax、Caspase-3信號通路可能是參芪蛭龍湯改善膜性腎病小鼠腎組織細胞凋亡的作用靶點。