陳豐酆,廖樂(lè)琴,俞笛揚(yáng),朱恩國(guó),陶亮奇,王朝福,凌騰芳,康樂(lè)*

(1.西華師范大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,四川 南充 637000;2.韓國(guó)生命工學(xué)研究院,韓國(guó) 大田 34141)

金屬鎘是一種受到社會(huì)各界廣泛關(guān)注的有毒重金屬元素,過(guò)量攝入鎘對(duì)人體和動(dòng)植物體等都有著巨大的危害作用。人體研究表明鎘對(duì)細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性具有抑制作用,促使細(xì)胞的氧化脅迫加劇,最終對(duì)人體的健康造成傷害[1-2]。鎘進(jìn)入人體的主要途徑是通過(guò)食物鏈,長(zhǎng)期食用含鎘食物會(huì)使鎘大量積存于肝或腎臟,對(duì)其造成危害,尤其是對(duì)腎臟危害最為明顯,極少數(shù)嚴(yán)重的病人會(huì)出現(xiàn)骨骼病變,1931年日本出現(xiàn)的“骨痛病”就是由于過(guò)度攝入鎘而產(chǎn)生。近些年在自然原因以及人為因素的雙重影響下,部分地區(qū)耕作地內(nèi)土壤中的鎘含量逐漸增加,從而導(dǎo)致土壤毒性增加[3-5],使得其中的栽種的作物減產(chǎn)甚至絕收[6]。鎘對(duì)植物的途徑主要通過(guò)根系與葉片進(jìn)入植物體內(nèi),可以破壞植物細(xì)胞內(nèi)的線粒體與葉綠體結(jié)構(gòu),從而影響植物的光合作用和呼吸作用[7-8]。同時(shí)與人體研究結(jié)果類(lèi)似的是高濃度鎘也能抑制植物體內(nèi)酶的合成,部分酶甚至?xí)Щ頪8],與之同時(shí)植物細(xì)胞也會(huì)受到明顯的氧化傷害,最終導(dǎo)致植物生長(zhǎng)和發(fā)育受到抑制[9-10]。

甘薯又名紅薯、番薯、地瓜,為旋花科植物,是中國(guó)四大糧食作物之一,在世界糧食地位中同樣占有重要地位[11]。它具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和防癌作用,其體內(nèi)豐富的胡蘿卜素還能夠有效地清除自由基,,而自由基是誘發(fā)癌癥等疾病的原因之一[12-13]。Kumar等研究表明,在鉻處理?xiàng)l件下,甘薯會(huì)通過(guò)增加體內(nèi)POD、CAT、SOD等抗氧化酶活性來(lái)減少該種重金屬對(duì)甘薯的傷害,在鎳處理時(shí),體內(nèi)抗氧化酶活性也會(huì)增加,在高濃度鎳的處理?xiàng)l件下,甘薯還可以通過(guò)減少氧化應(yīng)激來(lái)減少鎳對(duì)其傷害[14-15]。Lai等發(fā)現(xiàn)紫甘薯在受到鈾(U)毒害時(shí),減輕毒害的主要途徑是通過(guò)改善自身能量供應(yīng)和增加初級(jí)代謝物的合成,當(dāng)U對(duì)紅薯進(jìn)行毒害時(shí),會(huì)顯著誘導(dǎo)甘薯防御相關(guān)基因的表達(dá),包括抗氧化物質(zhì)或酶等含量的增加來(lái)抵御重金屬U的毒害[16]。

通常來(lái)說(shuō)植物細(xì)胞內(nèi)的活性氧是通過(guò)酶促系統(tǒng)(如SOD、CAT和POD等物質(zhì))和非酶促系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行清除的[17],它們相互協(xié)調(diào),清除細(xì)胞體內(nèi)多余的活性氧,從而減輕活性氧對(duì)植物的傷害[18-19]。但當(dāng)植物長(zhǎng)期處于重金屬脅迫下,其體內(nèi)的活性氧會(huì)大量增加[20],超過(guò)了植物本身的活性氧清除限度,使得植物細(xì)胞正常功能受到嚴(yán)重影響,最終引起作物衰老甚至死亡。因此,在重金屬脅迫下,植物體內(nèi)活性氧的清除能力可以影響到植物的抗重金屬的脅迫的能力[21-22]?；诖?本研究以10種不同的甘薯植株材料探討鎘處理對(duì)其生理生化指標(biāo)的影響,比較其體內(nèi)葉綠素、H2O2、各種抗氧化酶含量的差異,揭示甘薯在鎘脅迫下的調(diào)節(jié)機(jī)制,并進(jìn)行甘薯品種的抗性分析。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

以南紫薯020、渝薯153、漯徐2號(hào)、冀薯4號(hào)、渝薯1號(hào)、南渝薯02、冀薯5號(hào)、淮薯3號(hào)、渝薯33、煙薯25為供試材料。將10種甘薯植株分別種入含鎘苗床及其對(duì)照苗床,最后取其葉片作為實(shí)驗(yàn)材料。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

選取10種不同品種的甘薯植株,對(duì)照組用含改良霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液的苗床進(jìn)行水培培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)組則采用含450 μmol/L鎘的改良霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng),通過(guò)觀察甘薯植株表現(xiàn)性狀,當(dāng)甘薯植株對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)明顯差異時(shí)(如圖1～2),將選取其植株第3片至第5片葉進(jìn)行實(shí)驗(yàn)指標(biāo)測(cè)定。

圖1 CK處理

1.3 測(cè)量方法

葉綠素含量的測(cè)定方法選取乙醇提取-紫外分光光度法進(jìn)行測(cè)定[23],H2O2、SOD、GSH、CAT、POD的測(cè)定使用來(lái)自中國(guó)蘇州格瑞思生物科技有限公司的市售檢測(cè)試劑盒,并使用紫外分光光度計(jì)測(cè)量吸光度,實(shí)驗(yàn)均重復(fù)測(cè)定3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 鎘處理對(duì)甘薯葉片內(nèi)葉綠素含量的影響

葉綠素是植物光合系統(tǒng)中重要組分之一, 其在葉片中的含量能直接影響到植物葉片光合作用的效率,進(jìn)而影響到植物生長(zhǎng)和發(fā)育。 通常測(cè)定葉綠素含量可以獲得植物生長(zhǎng)狀態(tài),因而長(zhǎng)勢(shì)良好的植物會(huì)含有更高含量的葉綠素。由圖3可知,對(duì)照組漯徐2號(hào)、冀薯5號(hào)、南渝薯02、煙薯25、南紫薯020五類(lèi)甘薯葉片葉綠素含量分別是實(shí)驗(yàn)組甘薯葉片葉綠素含量的2.06倍、2.21倍、2.09倍、2.83倍、2.5倍,差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01),對(duì)照組渝薯33、渝薯153、淮薯3號(hào)、冀薯4號(hào)、渝薯1號(hào)五種甘薯葉片葉綠素含量分別是實(shí)驗(yàn)組甘薯葉片葉綠素含量的1.49,1.29,1.46,1.86,1.79倍,差異達(dá)到顯著水平(0.01

圖2 Cd處理

表示鎘脅迫組與對(duì)照組相比差異顯著(0.01

2.2 鎘處理對(duì)甘薯葉片內(nèi)過(guò)氧化氫(H2O2)含量的影響

H2O2是生物體內(nèi)常見(jiàn)的活性氧之一,它能損傷和修飾生物大分子例如蛋白質(zhì)分子和脫氧核糖核酸(DNA)。高濃度的過(guò)氧化氫能攻擊這些分子產(chǎn)生細(xì)胞毒害。而低濃度的過(guò)氧化氫細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子,在生物和非生物脅迫應(yīng)激中以及植物生長(zhǎng)發(fā)育中起重要的調(diào)節(jié)作用。由圖4可見(jiàn),南紫薯020、煙薯25、淮薯3號(hào)、漯徐2號(hào)、南渝薯02、漯徐2號(hào)、渝薯1號(hào)、渝薯33、冀薯4號(hào)、渝薯153甘薯葉片實(shí)驗(yàn)組H2O2含量分別是對(duì)照組甘薯葉片H2O2含量的5.33,5.2,5.67,4.72,5.22,3.91,4,4.68,4.23,4.27倍,差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01);鎘處理?xiàng)l件下,各品種H2O2從少到多依次為渝薯153、冀薯4號(hào)、渝薯33、渝薯1號(hào)、冀薯5號(hào)、南渝薯02、漯徐2號(hào)、淮薯3號(hào)、煙薯25、南紫薯020。結(jié)果表明隨著鎘脅迫程度加深,甘薯葉片中H2O2含量會(huì)不斷增加,使甘薯細(xì)胞受到毒害,從而抑制植株生長(zhǎng)。

表示鎘脅迫組與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)。圖4 鎘處理對(duì)10種甘薯過(guò)氧化氫(H2O2)含量的影響

2.3 鎘處理對(duì)甘薯葉片內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響

SOD是生物體內(nèi)一種不可或缺的抗氧化酶,在生物體內(nèi)普遍存在,主要負(fù)責(zé)清除·O2-發(fā)生歧化反應(yīng)從而生成H2O2,它具有抗衰老和提高機(jī)體對(duì)疾病抵抗力等功能,還能幫助機(jī)體適應(yīng)不同的外界環(huán)境,以減少植物體受到的氧化脅迫。由圖5可知,冀薯4號(hào)、淮薯3號(hào)、煙薯25、南渝薯02、渝薯1號(hào)、漯徐2號(hào)六種甘薯葉片實(shí)驗(yàn)組SOD含量分別是對(duì)照組葉片SOD含量的2.29,2.79,2.66,2.02,2.42,2.16倍,差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01),渝薯33、渝薯153、冀薯5號(hào)、南紫薯020四種甘薯葉片實(shí)驗(yàn)組SOD含量分別是對(duì)照組葉片SOD含量的1.84,1.93,1.71,1.37倍,差異達(dá)到顯著水平(0.01

△表示鎘脅迫組與對(duì)照組相比差異顯著(0.01

2.4 鎘處理對(duì)甘薯葉片內(nèi)還原型谷胱甘肽(GSH)含量的影響

GSH是細(xì)胞內(nèi)主要的抗氧化巰基物質(zhì)之一,具有清除代謝產(chǎn)生的多余活性氧自由基等功能,以減少活性氧對(duì)細(xì)胞造成的傷害,它還可以在抗氧化、蛋白質(zhì)巰基保護(hù)和氨基酸跨膜運(yùn)輸?shù)劝l(fā)揮重要作用,因此,GSH可以作為細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的主要?jiǎng)討B(tài)指標(biāo)之一,檢測(cè)其含量,細(xì)胞所處的氧化還原狀態(tài)能夠很好地被反映出來(lái)。由圖6所見(jiàn),南渝薯02、渝薯33、淮薯3號(hào)、漯徐2號(hào)四種甘薯實(shí)驗(yàn)組GSH含量分別是對(duì)照組甘薯GSH含量的2.1,2.93,2.18,2倍,差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01),渝薯153、冀薯4號(hào)、渝薯1號(hào)、冀薯5號(hào)、南紫薯020、煙薯25六種甘薯實(shí)驗(yàn)組GSH含量分別是對(duì)照組GSH含量的1.63,1.35,1.36,1.33,1.83,1.83倍,差異達(dá)到顯著水平(0.01

△表示鎘脅迫組與對(duì)照組相比差異顯著(0.01P

2.5 鎘處理對(duì)甘薯葉片內(nèi)過(guò)氧化氫酶(CAT)活性的影響

CAT具有催化過(guò)氧化氫分解為分子氧和水的活性,能使細(xì)胞免受過(guò)氧化氫毒害的功能,普遍存在于動(dòng)植物組織,其活性可以一定程度反映生物體的代謝強(qiáng)度及抗寒、抗病能力。由圖7可知,渝薯1號(hào)實(shí)驗(yàn)組甘薯CAT含量是對(duì)照組CAT含量的2.02倍,差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01),渝薯153、渝薯33、冀薯4號(hào)、南紫薯020、冀薯5號(hào)、淮薯3號(hào)、南渝薯02、煙薯25、漯徐2號(hào)九種甘薯實(shí)驗(yàn)組CAT含量分別是對(duì)照組CAT含量的1.65,1.83,1.65,1.25,1.42,1.43,1.35,1.36,1.52倍,差異達(dá)到顯著水平(0.01

△表示鎘脅迫組與對(duì)照組相比差異顯著(0.01

2.6 鎘處理對(duì)甘薯葉片內(nèi)過(guò)氧化物酶(POD)活性的影響

POD廣泛存在于生物中,是一種重要的氧化還原酶,其具有參與光呼吸作用、可催化過(guò)氧化氫生成水和氧氣來(lái)消除過(guò)氧化氫毒性作用的功能。由圖8可知,冀薯4號(hào)、渝薯33、南渝薯02、渝薯153、渝薯1號(hào)、煙薯25六種甘薯實(shí)驗(yàn)組POD含量分別是對(duì)照組甘薯含量的2.73,2.26,2.34,2.2,2.87, 2.22倍,差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01),冀薯5號(hào)、淮薯3號(hào)、南紫薯020、漯徐2號(hào)四種甘薯實(shí)驗(yàn)組POD含量分別是對(duì)照組甘薯含量的1.64,1.77,1.77,1.53倍,差異達(dá)到顯著水平(0.01

△表示鎘脅迫組與對(duì)照組相比差異顯著(0.01

3 小結(jié)和討論

葉綠素作為葉片中光合系統(tǒng)的最重要的基本組成之一,其含量多少直接決定光合作用強(qiáng)度。植物在鎘處理的條件下將直接導(dǎo)致其葉綠素含量降低,使光合作用減弱。本研究中,在鎘脅迫下,渝薯33、渝薯153兩種甘薯葉綠素含量相對(duì)較高,因此其光合作用的效率相較其他八種甘薯更高,淮薯3號(hào)、冀薯4號(hào)、漯徐2號(hào)、渝薯1號(hào)四種甘薯葉綠素含量在10種甘薯中相對(duì)均衡,冀薯5號(hào)、南渝薯02、煙薯25、南紫薯020四種甘薯葉綠素含量最少,其光合作用也最弱;同時(shí),10種甘薯葉片都表現(xiàn)出變黃、萎蔫的癥狀,相比于對(duì)照組,葉綠素含量都極大的降低,這與以往研究結(jié)果類(lèi)似。黃等研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)環(huán)境中的鎘達(dá)到一定含量時(shí),會(huì)導(dǎo)致稻苗葉子停止生長(zhǎng),最終枯黃[24]。孫等研究發(fā)現(xiàn)隨著鎘處理的時(shí)間變長(zhǎng),黃瓜幼苗中葉綠素含量逐漸降低[25]。劉等發(fā)現(xiàn)隨著鎘處理濃度的增加,金銀花葉片逐漸失綠,其葉綠素的含量呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)[26]。這種現(xiàn)象出現(xiàn)的原因可能是鎘影響了葉綠素合成所需要的酶,從而導(dǎo)致葉綠素含量下降,葉片發(fā)黃。鎘處理會(huì)導(dǎo)致植物葉片內(nèi)葉綠素含量下降,影響植物體內(nèi)的光合作用及其他生理活動(dòng),包括植物對(duì)光能的吸收受到影響、植物光合系統(tǒng)所需物質(zhì)的合成過(guò)程也會(huì)遭到破壞等。

鎘脅迫條件下,植物體內(nèi)將產(chǎn)生大量的活性氧,這些多余的活性氧將引起生物大分子受到損傷甚至細(xì)胞的死亡。本研究中,在鎘脅迫條件下,過(guò)氧化氫含量最低的是渝薯153、冀薯4號(hào)兩種甘薯,因此,其受鎘脅迫的毒害相對(duì)較低,其次是渝薯33、渝薯1號(hào)、漯徐2號(hào)、南渝薯02四種甘薯,含量最高的則是冀薯5號(hào)、淮薯3號(hào)、煙薯25、南紫薯020四種甘薯,這四種甘薯受鎘脅迫毒害最嚴(yán)重;同時(shí),鎘處理?xiàng)l件下甘薯體內(nèi)過(guò)氧化氫的含量會(huì)大量增加,這與以往研究類(lèi)似。于等研究發(fā)現(xiàn)鎘處理?xiàng)l件下黃瓜胚軸與胚根中的過(guò)氧化氫含量顯著提高[27]。于研究發(fā)現(xiàn)隨著鎘處理濃度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng),小白菜幼苗葉片中過(guò)氧化氫的含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)[28]。邱等研究得到在鎘脅迫下,小麥幼苗生長(zhǎng)受到抑制,體內(nèi)過(guò)氧化氫的產(chǎn)生速率顯著增加[29]。過(guò)氧化氫的增長(zhǎng)在某種程度上說(shuō)明了重金屬鎘對(duì)植物造成的傷害,鎘對(duì)甘薯植株的毒害隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)更嚴(yán)重,最終導(dǎo)致甘薯細(xì)胞的穩(wěn)定性和功能性遭到破壞。

植物具有抗氧化系統(tǒng)會(huì)幫助植物抵抗環(huán)境脅迫誘導(dǎo)的氧化損傷[30],其在植物對(duì)抗外部環(huán)境壓力時(shí)可以發(fā)揮重要作用[31]。本實(shí)驗(yàn)研究了抗氧化系統(tǒng)在甘薯植株遭受環(huán)境脅迫時(shí)的保護(hù)機(jī)制,由圖5、圖6、圖7、圖8可知,在鎘脅迫下,SOD表現(xiàn)活性較高的是冀薯4號(hào)、淮薯3號(hào)、渝薯33三種甘薯,南渝薯02、渝薯1號(hào)等七種甘薯SOD活性較低;GSH表現(xiàn)活性較高的是渝薯153、冀薯4號(hào)等五種甘薯,冀薯5號(hào)、淮薯3號(hào)等五種甘薯GSH活性相對(duì)較低;CAT表現(xiàn)活性較高的是渝薯153、渝薯1號(hào)等五種甘薯,表現(xiàn)活性較低的則是冀薯5號(hào)、淮薯3號(hào)等五種甘薯;POD表現(xiàn)活性較高的五種甘薯是冀薯4號(hào)、渝薯33等,表現(xiàn)活性較低的是渝薯1號(hào)、淮薯3號(hào)等五種甘薯。鎘處理導(dǎo)致活性氧含量增加,從而引起SOD、POD等抗氧化酶活性增加,而抗氧化酶活性的增加對(duì)于甘薯抵抗鎘脅迫具有重要作用。這與以往研究結(jié)果類(lèi)似。曹等研究發(fā)現(xiàn),玉米隨著鎘濃度的增加其中的SOD等抗氧化酶的活性增加[32]。劉等發(fā)現(xiàn),隨著鎘濃度的增加,龍葵中的SOD、POD等抗氧化酶的活性增大[33]。趙研究發(fā)現(xiàn),鎘脅迫條件下,大豆體內(nèi)SOD、POD、CAT的活性顯著增加[34]。本實(shí)驗(yàn)中,鎘處理?xiàng)l件下,雖然各類(lèi)甘薯品種體內(nèi)的抗氧化酶的活性相比于其對(duì)照組都有所增加,但由于品種的不同,抗氧化酶活性的增加也不相同,其中抗氧化酶含量越多,說(shuō)明其甘薯在鎘處理下的抗性也越強(qiáng),這是由于抗氧化酶的活性直接決定植物在鎘脅迫中的耐性所致?？傊?在甘薯植株遭受鎘脅迫時(shí),體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)會(huì)發(fā)揮作用,通過(guò)抗氧化酶活性的增加,減少重金屬鎘對(duì)甘薯植株造成的傷害。

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)可以知道,在甘薯遭遇鎘脅迫,導(dǎo)致其體內(nèi)活性氧含量上升,會(huì)引起甘薯激發(fā)自我保護(hù)機(jī)制,從而使得甘薯體內(nèi)抗氧化酶活性增加,例如超氧化物歧化酶(SOD)、還原型谷胱甘肽(GSH)等,抗氧化酶活性的提升可以催化活性氧分解成氧氣、水等物質(zhì),降低甘薯細(xì)胞內(nèi)的氧化脅迫,減輕甘薯細(xì)胞受到的毒害,增強(qiáng)甘薯細(xì)胞對(duì)鎘的耐受性,但隨著鎘毒害加深,超過(guò)甘薯所能承受的最大程度,植株葉片便會(huì)變黃,最終枯萎。同時(shí),本實(shí)驗(yàn)也表明,不同甘薯品種對(duì)鎘的耐受性不同,部分甘薯體內(nèi)的抗氧化酶在面對(duì)鎘脅迫時(shí)相比于其他甘薯植株表現(xiàn)的活性更高,葉綠素含量更高,受過(guò)氧化氫毒害程度更低。因此,綜合葉綠素、過(guò)氧化氫毒害、四種抗氧化酶活性分析,渝153、冀薯4號(hào)、渝薯33三種甘薯在鎘脅迫中受過(guò)氧化氫毒害最低,在葉綠素含量、抗氧化酶活性的表現(xiàn)中都相對(duì)較好,其對(duì)重金屬鎘抗性潛力最大,淮薯3號(hào)、冀薯5號(hào)、南渝薯02、渝薯1號(hào)四種甘薯在鎘脅迫作用下表現(xiàn)次之,南紫薯020、漯徐2號(hào)、煙薯25三種甘薯綜合葉綠素含量、受過(guò)氧化氫毒害程度以及抗氧化酶的活性來(lái)觀察,這三種甘薯是對(duì)鎘毒害最為敏感的甘薯。