陳星,周哲旭,尚藝婉,劉洋,劉婭茹,胡嘯博,樊李妍,陳玉龍

河南中醫(yī)藥大學(xué)/河南省中醫(yī)方證信號(hào)傳導(dǎo)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 鄭州 450046

食管癌是世界上常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,在全球癌癥相關(guān)死亡原因中排第六位,我國(guó)食管癌的發(fā)病率與病死率較高[1-2]。目前,針對(duì)食管癌患者的主要治療手段是放化療及聯(lián)合手術(shù),但由于大多數(shù)患者在晚期確診,導(dǎo)致其5年生存率極低[3-4]。多項(xiàng)研究表明,信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)信號(hào)通路參與了食管癌的發(fā)生和發(fā)展,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、抗凋亡、抗耐藥等,嚴(yán)重影響其預(yù)后,已成為食管癌治療的潛在靶點(diǎn)[5-9]。丹參酮ⅡA作為中藥丹參的有效成分之一,具有抗炎、抗氧化、抗過(guò)敏、抗纖維化、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗癌等作用[10-11]。研究證實(shí),丹參酮 ⅡA 可以通過(guò)抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)食管癌EC9706和KYSE70細(xì)胞凋亡,抑制其侵襲、遷移[12]。同時(shí),丹參酮ⅡA可以通過(guò)下調(diào)p-STAT3抑制人胃癌細(xì)胞的增殖[13]。前期預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),不同濃度的丹參酮ⅡA能夠有效抑制STAT3、p-STAT3的表達(dá),并且隨濃度梯度抑制食管癌Ec109細(xì)胞的增殖。但是丹參酮ⅡA能否通過(guò)抑制STAT3通路促進(jìn)食管癌細(xì)胞周期阻滯進(jìn)而促進(jìn)其凋亡尚未見(jiàn)報(bào)道。基于此,本實(shí)驗(yàn)擬從丹參酮ⅡA抑制食管癌細(xì)胞Ec109增殖的基礎(chǔ)上,探討其能否通過(guò)抑制STAT3信號(hào)通路發(fā)揮其抗腫瘤作用,為食管癌的臨床治療提供新的思路與靶點(diǎn)。

1 材料

1.1 動(dòng)物與細(xì)胞人食管癌Ec109細(xì)胞,由本實(shí)驗(yàn)室傳代凍存。70只4周齡SPF級(jí)BALB/c雌鼠,體質(zhì)量11～15 g,購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,合格證號(hào):NO.110011220106561335,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(京)2021-0006。動(dòng)物飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(23±2) ℃的SPF動(dòng)物房中,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn),倫理編號(hào):ZWLL202003215。

1.2 藥物與試劑STAT3抑制劑stattic(Selleckchem公司,批號(hào):S7024);丹參酮ⅡA(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%,成都曼斯特公司,批號(hào):568-72-9);RPMI Medium1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibico公司,批號(hào):2357161);胰蛋白酶-EDTA消化液、胰蛋白酶不含EDTA消化液、四甲基偶氮唑鹽(thiazolyl blue tetrazolium bromide,MTT)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、高效RIPA裂解液、PMSF、蛋白磷酸酶抑制劑混合物(北京索萊寶科技有限公司,批號(hào):T1300、T1350、M8180、D8370、R0010、P0100、P1260);胎牛血清(Hyclone公司,貨號(hào):RB39736);STAT3鼠抗人抗體、半胱氨酸蛋白酶-9(caspase-9)鼠抗人抗體、c-Myc兔單克隆抗體、CyclinB1抗體、α-tublin兔單克隆抗體、山羊抗小鼠IgG二抗、山羊抗兔IgG二抗(美國(guó)CST公司,貨號(hào):9145S、9508S、18583S、4138S、2125S、7056S、7074S);p-STAT3兔抗人抗體、caspase-3兔抗人抗體(英國(guó)Abcam公司,貨號(hào):ab76315、ab32351);細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司,貨號(hào):A20533、A10642);Trizol試劑(美國(guó)invitrogen公司,批號(hào):390202);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(東洋紡公司,批號(hào):117000);2×SYBRGreen(ABclonal公司,批號(hào):9620031031C)。

1.3 儀器CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司,型號(hào):170R);超凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)安泰公司,型號(hào):37997);倒置顯微鏡(德國(guó)Leica公司,型號(hào):DFC450C);酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek公司,型號(hào):ELx-800);離心機(jī)(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司,型號(hào):LABOFUGE 400);垂直電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司,型號(hào):PowerPac Basic);垂直濕轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)Bio-Rad公司,型號(hào):Criterion Blotter);低溫高速離心機(jī)(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司,型號(hào):X1R);凝膠成像掃描儀(美國(guó)Bio-Rad公司,型號(hào):ChemiDoc XRS+);流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司,型號(hào):FACSVantageSE);冷凍型高通量組織研磨器(寧波新芝生物科技股份有限公司,型號(hào):Scientz-48L);電子天平(上海精科天美科學(xué)儀器有限公司,型號(hào):XB120A);實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司,型號(hào):QuantStudio 6)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)食管癌Ec109細(xì)胞置于5%CO2,37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中用含10%血清的1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng),每2～3天傳代一次,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.2 藥物配置采用電子天平稱取適量stattic、丹參酮ⅡA粉末,用DMSO分別配置成20 mmol·L-1、10 g·L-1工作液,-20 ℃避光保存1個(gè)月,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 MTT法檢測(cè)丹參酮ⅡA、stattic及聯(lián)合用藥對(duì)Ec109細(xì)胞增殖的影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Ec109細(xì)胞,用含EDTA的胰酶消化重懸計(jì)數(shù),每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板,每孔200 μL,置于5%CO2,37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,分別設(shè)置空白組、丹參酮ⅡA組、stattic組。丹參酮ⅡA的濃度分別為0 mg·L-1、0.5 mg·L-1、1 mg·L-1、2 mg·L-1、4 mg·L-1、8 mg·L-1,stattic的濃度分別為0 μmol·L-1、3 μmol·L-1、6 μmol·L-1、12 μmol·L-1、15 μmol·L-1、24 μmol·L-1,聯(lián)合用藥分析時(shí)又分為空白組、丹參酮ⅡA 2 mg·L-1組、丹參酮ⅡA 8 mg·L-1組、stattic 7 μmol·L-1組、丹參酮ⅡA 2 mg·L-1+static 7 μmol·L-1組、丹參酮ⅡA 8 mg·L-1+static 7 μmol·L-1組,每組均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,將5 g·L-1MTT與1640培養(yǎng)基以19比例進(jìn)行配置后,每孔加入100 μL,4 h后,每孔加入150 μL DMSO,采用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm波長(zhǎng)下各孔吸光值(optical density,OD),計(jì)算各組藥物抑制率。

藥物抑制率=(空白組OD值-用藥組OD值)/空白組OD值×100%

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期及凋亡取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Ec109細(xì)胞,以3×106個(gè)/孔接種于6孔板,分為空白組、丹參酮ⅡA低濃度組、丹參酮ⅡA高濃度組、stattic組、stattic+丹參酮ⅡA低濃度組、stattic+丹參酮ⅡA高濃度組,加藥48 h后,使用不含EDTA的胰酶消化,收集各孔細(xì)胞,1 500 r·min-1離心5 min,1 mL PBS洗滌一次,按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。細(xì)胞周期檢測(cè)時(shí),每組加入1 mL Staining solution與10 μL Permeabilization solution,混勻,避光孵育 30 min,上機(jī)檢測(cè)。細(xì)胞凋亡檢測(cè)時(shí),每組加入 500 μL 使用無(wú)菌去離子水稀釋的1×Binding Buffer、5 μL AnnexinV-FITC與10 μL PI,混勻,避光孵育5 min,上機(jī)檢測(cè)。

2.5 動(dòng)物分組、造模與干預(yù)從70只4周齡SPF級(jí)BALB/c雌鼠中隨機(jī)抽取10只作為空白組,其余每只小鼠均與右脅部皮下注射2×106個(gè)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Ec109細(xì)胞,1周后觀察皮下移植瘤體積,當(dāng)移植瘤直徑約5 mm時(shí)造模成功。將造模成功的小鼠隨機(jī)分為模型組、丹參酮ⅡA低濃度組(20 mg·kg-1)、丹參酮ⅡA高濃度組(40 mg·kg-1)、stattic組(25 mg·kg-1)、stattic(25 mg·kg-1)+丹參酮ⅡA高濃度(40 mg·kg-1)組、順鉑組(1 mg·kg-1),腹腔注射給藥,每2天進(jìn)行1次,連續(xù)35 d,末次給藥24 h后麻醉處死,稱量瘤體大小與質(zhì)量。

2.6 繪制體質(zhì)量增長(zhǎng)、瘤體生長(zhǎng)圖給藥期間每 7 d 測(cè)量一次瘤體大小與小鼠體質(zhì)量,考察藥物對(duì)小鼠腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用,瘤體大小按照V=a×b2×0.52計(jì)算,其中a為瘤體長(zhǎng),b為瘤體寬。

2.7 ELISA法檢測(cè)移植瘤裸鼠血清白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的水平末次給藥24 h后,摘眼球采血,離心后取血清,按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作要求檢測(cè)各組小鼠血清中IL-6的水平。

2.8 免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞周期、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平細(xì)胞分組同2.4,加藥培養(yǎng)48 h后,以RIPA裂解液:蛋白磷酸酶抑制劑:PMSF=10011的比例配制細(xì)胞裂解液混合物,每孔加入130 μL進(jìn)行細(xì)胞裂解;動(dòng)物分組同2.5,按照1 mg組織加入 4 μL 裂解液比例,采用低溫高速組織破碎儀進(jìn)行組織破碎。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定各組蛋白濃度,98 ℃變性8 min,取20 μg蛋白上樣,用10%SDS-PAGE凝膠電泳,200 mA轉(zhuǎn)膜60 min,5%脫脂牛奶室溫封閉4 h,加一抗(STAT3、c-Myc、CyclinB1、Caspase-9、α-tublin的稀釋比例為11 000,p-STAT3的稀釋比例為110 000,Caspase-3的稀釋比例為15 000)4 ℃孵育過(guò)夜,TBST漂洗3次,加二抗(稀釋比例為11 000)室溫孵育1 h,漂洗3次,配制ECL發(fā)光顯影液,顯影拍照。以α-微管蛋白(α-tubulin)為內(nèi)參,使用ImageLab分析每組條帶的光密度值,以目的條帶光密度值/內(nèi)參條帶光密度值計(jì)算各組蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2.9 PCR法檢測(cè)細(xì)胞周期、凋亡相關(guān)基因mRNA的表達(dá)細(xì)胞分組同2.4,動(dòng)物分組同2.5,TRIZOL法提取各組總RNA,按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,采用SYBR Green染料法以10 μL體系(cDNA+無(wú)菌無(wú)酶水7 μL,5×RT Buffer 2 μL,Enzyme mix 0.5 μL,Primer mix 0.5 μL)對(duì)cDNA進(jìn)行擴(kuò)增,β-actin為內(nèi)參,用2-△△Ct計(jì)算各個(gè)樣品中目的mRNA相對(duì)表達(dá)量。引物序列由GENEWIZ公司設(shè)計(jì)合成。見(jiàn)表1。

表1 引物序列

3 結(jié)果

3.1 丹參酮ⅡA、stattic及聯(lián)合用藥對(duì)Ec109細(xì)胞增殖的影響與空白組比較,不同濃度丹參酮ⅡA對(duì)Ec109細(xì)胞的增殖均有明顯的抑制作用(P<0.01),且抑制率隨丹參酮ⅡA濃度的升高而升高,選取2 mg·L-1、8 mg·L-1分別為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中丹參酮的低、高濃度劑量。與空白組比較,當(dāng)stattic濃度≥6 μmol·L-1時(shí),對(duì)Ec109細(xì)胞增殖均有明顯抑制作用(P<0.01),且抑制率隨stattic濃度的升高而升高,選取7 μmol·L-1為后續(xù)實(shí)驗(yàn)聯(lián)合用藥中的stattic濃度。與空白組比較,丹參酮ⅡA低濃度組、丹參酮ⅡA高濃度組、stattic組、stattic+丹參酮ⅡA低濃度組、stattic+丹參酮ⅡA高濃度組對(duì)Ec109細(xì)胞的增殖均有明顯抑制作用(P<0.01),但與單獨(dú)用藥組比較,聯(lián)合用藥組對(duì)Ec109細(xì)胞增殖的抑制作用無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 丹參酮ⅡA、stattic及聯(lián)合用藥對(duì)Ec109細(xì)胞增殖的影響

3.2 丹參酮ⅡA、stattic及聯(lián)合用藥對(duì)Ec109細(xì)胞周期的影響與空白組比較,丹參酮ⅡA高濃度組G0/G1期細(xì)胞比例顯著降低(P<0.01),G2/M期細(xì)胞比例顯著升高(P<0.01);stattic組G0/G1期細(xì)胞比例顯著降低(P<0.01),S期細(xì)胞比例顯著升高(P<0.01);stattic+丹參酮ⅡA低濃度組、stattic+丹參酮ⅡA高濃度組G0/G1期細(xì)胞比例顯著降低(P<0.01),S期細(xì)胞比例顯著升高(P<0.05),G2/M期細(xì)胞比例顯著升高(P<0.05)。與stattic組比較,stattic+丹參酮ⅡA高濃度組G2/M期細(xì)胞比例顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表3、圖1。

注:A:空白組;B:丹參酮ⅡA低濃度組;C:丹參酮ⅡA高濃度組;D:stattic組;E:stattic+丹參酮ⅡA低濃度組;F:stattic+丹參酮ⅡA高濃度組。圖1 丹參酮ⅡA、stattic及聯(lián)合用藥對(duì)Ec109細(xì)胞周期的影響

表3 丹參酮ⅡA、stattic及聯(lián)合用藥對(duì)Ec109細(xì)胞周期的影響

3.3 丹參酮ⅡA、stattic及聯(lián)合用藥對(duì)Ec109細(xì)胞凋亡的影響與空白組比較,丹參酮ⅡA高濃度組早期凋亡、晚期凋亡細(xì)胞比例及總凋亡率均顯著升高(P<0.01);stattic組、stattic+丹參酮ⅡA低濃度組、stattic+丹參酮ⅡA高濃度組早期凋亡細(xì)胞比例及總凋亡率顯著升高(P<0.01)。見(jiàn)表4、圖2。

注:A:空白組;B:丹參酮ⅡA低濃度組;C:丹參酮ⅡA高濃度組;D:stattic組;E:stattic+丹參酮ⅡA低濃度組;F:stattic+丹參酮ⅡA高濃度組。圖2 丹參酮ⅡA、stattic及聯(lián)合用藥對(duì)Ec109細(xì)胞凋亡的影響

表4 丹參酮ⅡA、stattic及聯(lián)合用藥對(duì)Ec109細(xì)胞凋亡的影響

3.4 丹參酮ⅡA、stattic及聯(lián)合用藥對(duì)Ec109細(xì)胞凋亡、周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響與空白組比較,各給藥組p-STAT3、STAT3、CyclinB1蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著降低(P<0.05);stattic組、stattic+丹參酮ⅡA低濃度組、stattic+丹參酮ⅡA高濃度組c-Myc蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表5、圖3。

注:A:空白組;B:丹參酮ⅡA低濃度組;C:丹參酮ⅡA高濃度組;D:stattic組;E:stattic+丹參酮ⅡA低濃度組;F:stattic+丹參酮ⅡA高濃度組。圖3 丹參酮ⅡA、stattic及聯(lián)合用藥對(duì)Ec109細(xì)胞凋亡、周期相關(guān)蛋白的影響

表5 丹參酮ⅡA、stattic及聯(lián)合用藥對(duì)Ec109細(xì)胞凋亡、周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3.5 丹參酮ⅡA、stattic及聯(lián)合用藥對(duì)Ec109細(xì)胞凋亡、周期相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響與空白組比較,各給藥組c-MycmRNA、CyclinB1mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯降低(P<0.05);丹參酮ⅡA低濃度組Caspase-9mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯升高(P<0.01);丹參酮ⅡA高濃度組STAT3mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯降低(P<0.01),Caspase-3mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯升高(P<0.05);stattic組STAT3mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯降低(P<0.01),Caspase-9mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯升高(P<0.01);stattic+丹參酮 ⅡA 低濃度組和stattic+丹參酮ⅡA高濃度組STAT3mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯降低(P<0.05),Caspase-3mRNA、Caspase-9mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯升高(P<0.01)。與stattic組比較,stattic+丹參酮ⅡA高濃度組c-MycmRNA相對(duì)表達(dá)量明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表6。

表6 丹參酮ⅡA、stattic及聯(lián)合用藥對(duì)Ec109細(xì)胞凋亡、周期相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

3.6 丹參酮ⅡA、stattic及聯(lián)合用藥對(duì)小鼠體質(zhì)量及瘤體大小的影響隨著用藥時(shí)間的延長(zhǎng),模型組與各藥組小鼠的體質(zhì)量均會(huì)降低。末次體質(zhì)量比較發(fā)現(xiàn),與空白組比較,模型組、stattic組、stattic+丹參酮ⅡA高濃度組小鼠體質(zhì)量顯著下降(P<0.01);與模型組比較,stattic組、stattic+丹參酮ⅡA高濃度組小鼠體質(zhì)量顯著下降(P<0.01);與stattic組比較,stattic+丹參酮ⅡA高濃度組小鼠體質(zhì)量明顯升高(P<0.01)。見(jiàn)圖4。與模型組比較,各給藥組均可顯著抑制移植瘤的生長(zhǎng)(P<0.01)。見(jiàn)圖5、圖6。

注:KB:空白組;M:模型組;L:丹參酮ⅡA低濃度組;H:丹參酮ⅡA高濃度組;S:stattic組;S+H:stattic+丹參酮ⅡA高濃度組;SHUN:順鉑組。圖4 各實(shí)驗(yàn)組小鼠體質(zhì)量變化

注:M:模型組;L:丹參酮ⅡA低濃度組;H:丹參酮ⅡA高濃度組;S:stattic組;S+H:stattic+丹參酮ⅡA高濃度組;SHUN:順鉑組;與模型組比較,##P<0.01,###P<0.001,####P<0.000 1。圖5 各組小鼠移植瘤瘤體大小比較

注:M:模型組;L:丹參酮ⅡA低濃度組;H:丹參酮ⅡA高濃度組;S:stattic組;S+H:stattic+丹參酮ⅡA高濃度組;SHUN:順鉑組。圖6 各實(shí)驗(yàn)組末次測(cè)量瘤體大小示意圖

3.7 丹參酮ⅡA、stattic及聯(lián)合用藥對(duì)小鼠血清中IL-6水平的影響與空白組比較,模型組IL-6表達(dá)水平明顯升高(P<0.01);與模型組比較,除丹參酮ⅡA低濃度外,其余各用藥組IL-6表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表7。

表7 丹參酮ⅡA、stattic及聯(lián)合用藥對(duì)小鼠血清中IL-6水平的影響

3.8 丹參酮ⅡA、stattic及聯(lián)合用藥對(duì)移植瘤細(xì)胞周期、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響與模型組比較,各給藥組STAT3、c-Myc蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05);丹參酮ⅡA低濃度組Caspase-9蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.01);丹參酮ⅡA高濃度組、stattic組p-STAT3蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05);stattic+丹參酮ⅡA高濃度組p-STAT3蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)。與stattic組比較,stattic+丹參酮ⅡA高濃度組Caspase-9蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)。見(jiàn)表8、圖7。

注:A:模型組 B:丹參酮ⅡA低濃度組 C:丹參酮ⅡA高濃度組 D:stattic組;E:stattic+丹參酮ⅡA高濃度組。圖7 丹參酮ⅡA、stattic及聯(lián)合用藥對(duì)移植瘤細(xì)胞周期、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表8 丹參酮ⅡA、stattic及聯(lián)合用藥對(duì)移植瘤周期、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3.9 丹參酮ⅡA、stattic及聯(lián)合用藥對(duì)移植瘤細(xì)胞周期、凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響與模型組比較,各給藥組STAT3mRNA、c-MycmRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),Caspase-3mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.05);除stattic組,其余各組CyclinB1mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.05);除丹參酮ⅡA低濃度組外,其余各給藥組Caspase-9mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。與stattic組比較,聯(lián)合用藥組Caspase-3mRNA、Caspase-9mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),其余均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見(jiàn)表9。

表9 丹參酮ⅡA、stattic及聯(lián)合用藥對(duì)移植瘤周期、凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

4 討論

食管癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的、多步驟的過(guò)程[14],其潛在機(jī)制尚不清楚。然而,已知食管癌的發(fā)展與過(guò)度增殖、細(xì)胞凋亡減少和運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)有關(guān)。STATs主要由轉(zhuǎn)錄激活因子和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子組成,在調(diào)控細(xì)胞增殖和分化、調(diào)控細(xì)胞凋亡和血管生成等多種細(xì)胞功能中起著重要作用[15]。STAT3作為這個(gè)家族的一員,與惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤發(fā)生密切相關(guān),盡管STAT3在甲狀腺腫瘤發(fā)生中起著抑制作用,但在許多人類癌癥如乳腺癌、胃癌和結(jié)腸癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)異?；钴S[16-19],尤其是食管癌[20-21],STAT3可以上調(diào)抗凋亡蛋白的表達(dá)、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá),促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生存和增殖[22-23]。Myc為STAT3的下游靶標(biāo),研究證實(shí)STAT3可通過(guò)調(diào)控c-Myc來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞增殖,促進(jìn)其凋亡[24]。有研究表明,下調(diào)STAT3基因表達(dá)能夠抑制Bcl-2抗凋亡蛋白、原癌蛋白 c-Myc 的表達(dá),促進(jìn)食管癌TE-1細(xì)胞凋亡,抑制細(xì)胞周期蛋白CyclinB1表達(dá)使TE-1細(xì)胞產(chǎn)生G2/M期阻滯[25]。同時(shí)JAK/STAT3 抑制劑可以通過(guò)誘導(dǎo) PARP、Caspase-3、Caspase-9等的裂解導(dǎo)致結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡[26]。

中藥丹參具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消癰等功效。丹參酮ⅡA是從傳統(tǒng)中藥丹參中提取的菲醌類衍生物,可以通過(guò)多種機(jī)制有效抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖,調(diào)控其周期,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[27]。有研究表明,丹參酮ⅡA可通過(guò)上調(diào)腫瘤細(xì)胞內(nèi)活性氧的表達(dá)促進(jìn)凋亡蛋白Caspase-3的表達(dá)和自噬發(fā)生[28],并且可通過(guò)p53、細(xì)胞周期蛋白 B1/ 細(xì)胞分裂周期基因2和Caspase-3介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路抑制人鼻咽癌細(xì)胞的增殖,誘導(dǎo)其凋亡[29]。此外,丹參酮ⅡA也可以通過(guò)抑制β-arrestin1 表達(dá),從而抑制c-Myc和Cyclin D1的表達(dá),進(jìn)而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[30]。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),丹參酮ⅡA對(duì)食管癌Ec109細(xì)胞的生長(zhǎng)有顯著的抑制作用,并隨著濃度的升高而升高,且對(duì)于Ec109細(xì)胞中p-STAT3、STAT3有顯著抑制作用,并呈劑量-時(shí)間相關(guān)性?；诖?本課題組提出假設(shè),丹參酮ⅡA通過(guò)抑制STAT3而發(fā)揮其抗腫瘤作用。實(shí)驗(yàn)選取IC30(2 mg·L-1)、IC50(8 mg·L-1)作為丹參酮ⅡA的低、高濃度,并聯(lián)合STAT3抑制劑stattic探討丹參酮ⅡA與stattic聯(lián)合使用后能否繼續(xù)發(fā)揮其抑癌作用。MTT結(jié)果表明,與stattic比較,stattic聯(lián)合丹參酮ⅡA低、高濃度對(duì)細(xì)胞的抑制率無(wú)明顯差別。細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示,隨著丹參酮ⅡA濃度的升高,凋亡率也隨之增加,與stattic比較,當(dāng)stattic與丹參酮ⅡA低、高濃度組聯(lián)用時(shí),凋亡率無(wú)明顯差異,表明當(dāng)抑制STAT3時(shí),丹參酮ⅡA沒(méi)有發(fā)揮其促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。根據(jù)細(xì)胞周期結(jié)果發(fā)現(xiàn),丹參酮ⅡA將Ec109細(xì)胞周期明顯阻滯在G2期,提示丹參酮ⅡA可能是通過(guò)誘導(dǎo)Ec109細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯引起細(xì)胞凋亡,而stattic則可能是通過(guò)誘導(dǎo)G2/M、S期阻滯引起細(xì)胞凋亡;與stattic比較,stattic與丹參酮ⅡA聯(lián)用后,細(xì)胞凋亡無(wú)顯著差異。通過(guò)Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)給藥后Ec109細(xì)胞周期、凋亡相關(guān)蛋白水平的變化,結(jié)果顯示,與模型組比較,丹參酮ⅡA低、高濃度組及stattic組均可以抑制p-STAT3、STAT3、c-Myc及Cyclin B1的蛋白表達(dá),促進(jìn)凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9的表達(dá),stattic與丹參酮ⅡA聯(lián)用后,與stattic比較,相關(guān)蛋白表達(dá)水平均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。PCR結(jié)果顯示,丹參酮ⅡA、stattic均能顯著抑制STAT3mRNA、c-MycmRNA、CyclinB1mRNA的表達(dá)。丹參酮ⅡA低濃度對(duì)Caspase-3mRNA的表達(dá)有輕微抑制作用,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;而高濃度則顯著上調(diào)Caspase-3mRNA的表達(dá),這與前面細(xì)胞凋亡結(jié)果相符合;丹參酮ⅡA低濃度雖然對(duì)于STAT3、c-Myc及Cyclin B1的表達(dá)有抑制作用,但差異較小,甚至STAT3mRNA表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,因此,丹參酮ⅡA低濃度對(duì)于凋亡基因Caspase-3作用不明顯。而研究發(fā)現(xiàn),Caspase-9mRNA表達(dá)水平雖然升高,但并沒(méi)有隨著藥物濃度的增加而增加,推測(cè)其可能無(wú)劑量依賴性。

基于上述體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果,為了更好地證明丹參酮ⅡA是通過(guò)抑制STAT3通路誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生G2期阻滯,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡,課題組進(jìn)行了體內(nèi)驗(yàn)證。將腫瘤鼠分為空白組、模型組、丹參酮ⅡA低濃度組(20 mg·kg-1)、丹參酮ⅡA高濃度組(40 mg·kg-1)、stattic組(25 mg·kg-1)、stattic+丹參酮ⅡA高濃度組、順鉑組(1 mg·kg-1)。結(jié)果表明,用藥組裸鼠體質(zhì)量明顯輕于空白組,甚至stattic組、stattic+丹參酮ⅡA高濃度組體質(zhì)量顯著下降,單用stattic組裸鼠狀態(tài)明顯急躁、消瘦,甚至出現(xiàn)死亡,而丹參酮ⅡA組與順鉑組則無(wú)明顯差異,甚至丹參酮ⅡA可以減緩小鼠體質(zhì)量的下降。stattic與丹參酮ⅡA聯(lián)用后,裸鼠極度消瘦、急躁?duì)顟B(tài)有所緩解。對(duì)于移植瘤的治療效果,以順鉑最佳,其次是丹參酮ⅡA高濃度組,丹參酮ⅡA低濃度組、stattic與聯(lián)合用藥組次之,且三者無(wú)明顯差異。IL-6免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)因子與炎癥、造血,甚至多種腫瘤的進(jìn)展和細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[31]。小鼠血清IL-6水平測(cè)定結(jié)果顯示,模型組顯著促進(jìn)了小鼠IL-6因子的分泌,而丹參酮ⅡA低、高濃度組和stattic組都顯著降低 IL-6 的水平,聯(lián)合用藥組與stattic組比無(wú)顯著差異。由于順鉑治療效果佳,移植瘤體積較小,后期蛋白驗(yàn)證結(jié)果可能存在誤差,因此,只針對(duì)順鉑組作血清IL-6水平分析,不進(jìn)行蛋白與mRNA檢測(cè)。與模型組比較,丹參酮ⅡA低、高濃度組均可抑制STAT3、p-STAT3、c-Myc、Cyclin B1蛋白及mRNA的表達(dá),促進(jìn)Caspase-3、Caspase-9蛋白及mRNA的表達(dá)。聯(lián)合用藥組與stattic組比較,除Caspase-3、Caspase-9的mRNA及蛋白有明顯降低外,其余均無(wú)顯著差異,考慮可能兩藥物之間存在拮抗作用,刺激相關(guān)因子產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制所致。

綜上所述,丹參酮ⅡA可能通過(guò)抑制STAT3通路誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞Ec109發(fā)生G2期阻滯,抑制腫瘤細(xì)胞的增殖,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡,抑制腫瘤組織的生長(zhǎng)。但STAT3調(diào)控機(jī)制較為復(fù)雜,涉及多個(gè)信號(hào)軸,丹參酮ⅡA抑制STAT3通路以及細(xì)胞周期阻滯及凋亡的發(fā)生機(jī)制都有待進(jìn)一步深入研究。