汪輝,馬丙祥,黨偉利,張晰,周榮易

1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,河南 鄭州 450000; 2.河南中醫(yī)藥大學(xué)兒科醫(yī)學(xué)院,河南 鄭州 450046

腦性癱瘓(cerebral palsy,CP)是以運(yùn)動(dòng)功能障礙為主的證候群,具有終身性、致殘性的特點(diǎn),是我國(guó)兒童肢體殘疾的主要因素之一,可伴多種并發(fā)損害[1]。CP在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率約為2‰,我國(guó)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示,CP兒童的發(fā)病率為2.46‰,男童患病率高于女童[2]。目前,我國(guó)尚有部分CP患兒不能得到早期發(fā)現(xiàn)和診治,從而延誤最佳干預(yù)治療時(shí)機(jī),給兒童及其家庭帶來(lái)極大的痛苦和沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),也使社會(huì)承受沉重的負(fù)擔(dān)[3]。因此,防治CP的發(fā)生已經(jīng)成為小兒神經(jīng)康復(fù)治療的一項(xiàng)艱巨任務(wù)。

CP的病因有多樣性及復(fù)雜性的特點(diǎn),我國(guó)兒童CP主要致病因素為胚胎期間及新生兒期腦損傷[4]。宮內(nèi)感染/炎癥易引起新生兒早產(chǎn)出現(xiàn)腦損傷,甚至出現(xiàn)新生兒死亡,是新生兒重癥之一。即使存活的患兒,多數(shù)伴有持續(xù)性神經(jīng)功能損害,如CP、智力低下、癲癇等致殘率很高的后遺癥[5]。谷氨酸(glutamate,Glu)存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)大約1/3的突觸中,是神經(jīng)突觸中重要的神經(jīng)遞質(zhì)[6],其介導(dǎo)的神經(jīng)通路與宮內(nèi)感染/炎癥所致腦損傷相關(guān)性很高,Glu過(guò)量產(chǎn)生時(shí),可造成神經(jīng)系統(tǒng)損傷,即興奮性毒性(excito-toxicity)。CP復(fù)雜的病理發(fā)展過(guò)程中,存在多種機(jī)制引起的一系列損傷級(jí)聯(lián)反應(yīng),都以興奮性毒性起始[7]。N-甲基-D-天門(mén)冬氨酸受體-2B(N-methyl-D-aspartate receptor-2B,NMDAR-2B)是Glu受體之一,激活后參與突觸的可塑性。突觸后致密物95(postsynaptie density-95,PSD-95)是位于突觸后膜上的致密體蛋白,NMDAR是PSD復(fù)合蛋白的重要組成部分,二者共同作用于突觸,對(duì)突觸可塑性意義重大。

馬丙祥教授創(chuàng)制了蒲金口服液(石菖蒲、郁金、丹參、紅花),在兒童腦損傷等疾病的臨床實(shí)踐應(yīng)用中效果顯著。前期研究發(fā)現(xiàn),蒲金口服液能減少缺氧缺血腦損傷新生大鼠腦組織中抗氧化自由基和一氧化氮合酶的水平,下調(diào)炎性細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的水平和髓鞘相關(guān)抑制因子(Nogo、OMgp)及其受體(NgR、P75NTR)的表達(dá),促進(jìn)神經(jīng)的再生及功能修復(fù),改善神經(jīng)損傷的相關(guān)癥狀[8-11]。鑒于蒲金口服液在宮內(nèi)感染/炎癥致早產(chǎn)腦損傷中的保護(hù)作用,本研究觀(guān)察蒲金口服液對(duì)腦損傷組織中PSD-95、NMDAR-2B表達(dá)的影響,以期闡明蒲金口服液作用于宮內(nèi)感染/炎癥致早產(chǎn)腦損傷的干預(yù)機(jī)制,為早期應(yīng)用活血化瘀、化痰開(kāi)竅中藥治療早產(chǎn)兒腦損傷提供理論支持。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)SD大鼠54只,雄雌比例為12,由武漢云克隆動(dòng)物有限公司提供,動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(鄂)2018-0021,實(shí)驗(yàn)在鄭州科興生物科技有限公司動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。整個(gè)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)期間大鼠體質(zhì)量控制在200～300 g,本實(shí)驗(yàn)經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批通過(guò)(倫理編號(hào):YFYDW2018014)。

1.2 主要藥物及試劑蒲金口服液由石菖蒲、郁金、丹參、紅花組成,由河南中醫(yī)藥大學(xué)一附院制劑研究室提供,生產(chǎn)批號(hào):20190622,其中低劑量組生藥濃度為1.2 g·mL-1,高劑量組生藥濃度為2.4 g·mL-1。銀杏葉提取物(德國(guó)威瑪舒培博士藥廠(chǎng),批號(hào):7140315,配比濃度為3 g·L-1);脂多糖(美國(guó)Sigma公司,貨號(hào):SMB00704-5MG);Lipofectamine TM 2000(美國(guó)Invitrogen公司,貨號(hào):11668019);ECL化學(xué)發(fā)光試劑、蛋白質(zhì)marker(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司,貨號(hào):34076、26616);Acrylamide、Bis-acrylamide、Tris-base、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)、N,N,N′,N′-四甲基乙二胺(N,N,N′,N′-tetramethylethylenediamine,TEMED)(美國(guó)Sigma公司,貨號(hào):A9099、A2792、TRIS-R0、11667289001、1.10732);吐溫-20(Tween-20)、1 mol·L-1Tris-HCl(pH=6.8)、1.5 mol·L-1Tris-HCI (pH=8.8)(北京索萊寶科技有限公司,貨號(hào):T8220、T1020、T1010);PSD-95單克隆抗體、NMDAR-2B單克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司,貨號(hào):sc-32290、sc-365597);HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG二抗(美國(guó)CST,貨號(hào):96714)。

1.3 儀器SXP-1B型手術(shù)顯微鏡(上海醫(yī)用光學(xué)儀器公司);PLM-1350型偏光學(xué)顯微鏡(上海光學(xué)儀器五廠(chǎng)有限公司);BZF-50型電熱恒溫干燥箱(上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司);BCD-238E/X1型醫(yī)用冰箱(中國(guó)容聲公司);H1850R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司);DK-8D型水浴鍋(上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司);SK-L180-S型搖床(北京大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器股份公司);DYCZ-24DN型電泳系統(tǒng)、DYCZ-40D型電轉(zhuǎn)系統(tǒng)(北京六一生物科技有限公司);PT-3502C型多功能酶標(biāo)儀(北京普天新橋技術(shù)有限公司);9700型Gene Amp PCR儀(美國(guó)Applied Biosystems公司);7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Applied Biosystems公司)。

2 方法

2.1 模型制備及分組將18只SPF級(jí)雄性大鼠與36只雌性大鼠以12比例于下午1700分組合籠共同飼養(yǎng),每籠3只大鼠,次日上午0800將雌鼠與雄鼠分開(kāi)飼養(yǎng),棉棒用生理鹽水濕潤(rùn)后取雌鼠陰道脫落細(xì)胞進(jìn)行涂片觀(guān)察,以觀(guān)察到大量絲狀精子細(xì)胞為標(biāo)準(zhǔn)并記為孕第0天,受孕后孕鼠另外飼養(yǎng)。隨機(jī)將36只懷孕母鼠分為L(zhǎng)PS組(n=30)和對(duì)照組(n=6)。參考李曉捷等[12]制作宮內(nèi)感染動(dòng)物模型方法,在母鼠孕期第16天及第17天,LPS組孕鼠腹腔注射350 μg·kg-1的LPS,對(duì)照組則注射相同劑量的生理鹽水,然后記錄孕鼠的分娩時(shí)間及新生仔鼠體質(zhì)量,胎齡<22 d記為早產(chǎn)仔鼠。隨機(jī)選LPS組早產(chǎn)仔鼠和對(duì)照組仔鼠各10只,進(jìn)行HE染色以觀(guān)察仔鼠腦組織病理學(xué)變化。將80只LPS組早產(chǎn)仔鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為4組,每組20只,分別為高劑量蒲金口服液組、低劑量蒲金口服液組、銀杏葉提取物組、模型組。隨機(jī)選對(duì)照組正常分娩仔鼠20只,設(shè)為空白組。每組大鼠各隨機(jī)選取10只,于仔鼠出生第0—7天進(jìn)行早期藥物干預(yù),其余10只于仔鼠出生第7—14天進(jìn)行晚期藥物干預(yù)。

2.2 藥物干預(yù)及標(biāo)本采集仔鼠的灌胃劑量根據(jù)蒲金口服液臨床用量進(jìn)行折算,折算后低劑量蒲金口服液組仔鼠的給藥劑量為12.5 g·kg-1,高劑量蒲金口服液組仔鼠的灌胃劑量為25 g·kg-1[13]。銀杏葉提取物組仔鼠的灌胃劑量為3 mg·kg-1。模型組和空白組均給予同等劑量的生理鹽水。早期藥物干預(yù)組和晚期干預(yù)組均連續(xù)灌胃給藥7天,灌胃體積10 mL·kg-1,給藥后同等條件飼養(yǎng)至21日齡。仔鼠麻醉后斷頭取腦,剝離粗大血管,冷生理鹽水多次沖洗,耳間線(xiàn)前2 mm水平處取一側(cè)腦組織,于4 ℃體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛中固定72 h,切片備用,另一側(cè)置于凍存管中,放入液氮罐內(nèi)快速凍存,然后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 病理學(xué)觀(guān)察隨機(jī)選對(duì)照組和LPS組產(chǎn)后大鼠各4只,麻醉,切取子宮、胎盤(pán),多聚甲醛固定,HE染色,光鏡下觀(guān)察以了解孕鼠宮內(nèi)感染情況。同時(shí)隨機(jī)選LPS組和對(duì)照組仔鼠各10只,斷頭取腦后組織固定,HE染色,觀(guān)察新生仔鼠腦損傷狀況。

2.4 RT-PCR檢測(cè)PSD-95mRNA、NMDAR-2BmRNA表達(dá)水平取20～40 mg組織加液氮研磨成粉末,加400 μL Buffer R-I,用注射器反復(fù)抽吸8～10次,轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中,加200 μL Buffer R-II,渦旋振蕩15～30 s,12 000×g離心5 min,取上清液至1.5 mL離心管中,每管加入250 μL異丙醇,混合均勻,并轉(zhuǎn)移到制備管中,將制備管置于 2 mL 離心管中,6 000×g離心1 min,棄去濾液,加入500 μL Buffer W1A,在低溫離心機(jī)中12 000×g離心1 min,加入700 μL Buffer W2,12 000×g離心1 min,離心兩次后,將制備管放入干凈的1.5 mL離心管中,在制備管膜中央加入30 μL Buffer TE,靜置1 min后,12 000×g離心1 min,洗脫得RNA。將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)體系如下:2×SYBR qPCR Master Mix 10 μL,正、反引物各1 μL,待測(cè)DNA樣本2 μL,加滅菌H2O補(bǔ)足至20 μL。qPCR反應(yīng)條件:預(yù)變性:95 ℃反應(yīng)30 s;循環(huán)反應(yīng):95 ℃反應(yīng)20 s,60 ℃反應(yīng)20 s,72 ℃反應(yīng)30 s,共40個(gè)循環(huán);溶解曲線(xiàn):95 ℃反應(yīng)20 s,60 ℃反應(yīng) 50 s,95 ℃反應(yīng)20 s。以GAPDH為內(nèi)參,檢測(cè)大鼠PSD-95、NMDAR-2B的mRNA水平。以2-ΔΔCt表示實(shí)驗(yàn)組和空白組靶基因表達(dá)之間的多重比率關(guān)系,并進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

2.5 Western Blot檢測(cè)PSD-95、NMDAR-2B蛋白表達(dá)水平取腦組織按100 g·L-1的比例加入RIPA裂解液裂解30 min,離心取上清液即為蛋白樣品。采用BCA蛋白定量試劑盒對(duì)蛋白進(jìn)行定量后,加入6×loading buffer,100 ℃變性10 min,配 SDS-PAGE膠,按照30 μg的量計(jì)算每個(gè)樣品的上樣體積進(jìn)行上樣,電壓調(diào)至50 V進(jìn)行電泳,待蛋白樣品進(jìn)入分離層后,調(diào)整電壓為100 V繼續(xù)電泳直至蛋白樣品完全分離。根據(jù)待測(cè)蛋白分子量以及預(yù)染蛋白marker的指示,切下對(duì)應(yīng)膠塊,裁取合適大小的濾紙及NC膜,取電轉(zhuǎn)夾按照“陽(yáng)極-泡沫-濾紙-NC膜-膠塊-濾紙-泡沫-陰極”的順序鋪好加緊后放入電轉(zhuǎn)槽中,設(shè)定電流為300 mA,電轉(zhuǎn)2 h。將濕轉(zhuǎn)后的NC膜放在5%脫脂牛奶中,室溫?fù)u床封閉2 h。加入一抗(稀釋比例11 000),4 ℃搖床孵育過(guò)夜。PBST清洗4次,每次5 min,加入二抗(稀釋比例110 000),室溫?fù)u床孵育2 h。將NC膜從二抗中取出,室溫?fù)u床PBST洗滌4次,每次5 min。加ECL發(fā)光液,于暗室曝光5 min后,顯影,定影,膠片保存掃描。使用Image Pro Plus 6.0軟件掃描蛋白質(zhì)條帶并分析蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠一般情況比較30只LPS組雌鼠中1只意外受孕,2只死亡,1只足月分娩(剔除),8只雌鼠流產(chǎn),其余18只雌鼠均提前分娩,共產(chǎn)仔鼠176只,其中112只存活,64只死亡。對(duì)照組6只雌鼠均足月產(chǎn)仔,共產(chǎn)仔鼠57只,全部存活。與對(duì)照組比較,LPS組孕鼠的活產(chǎn)仔鼠數(shù)量顯著降低(P<0.05),仔鼠出生時(shí)體質(zhì)量顯著降低(P<0.05)。LPS組仔鼠出生時(shí)皮膚暗紅,部分出現(xiàn)暗紫色瘀斑或瘀點(diǎn),主動(dòng)活動(dòng)少,對(duì)外界刺激反應(yīng)弱,體質(zhì)量較輕。見(jiàn)表2。

表2 各組孕鼠活產(chǎn)仔鼠情況比較

3.2 LPS對(duì)孕鼠子宮、胎盤(pán)和仔鼠腦組織的影響HE染色顯示:LPS組孕鼠子宮壁充血,胎盤(pán)呈老化狀態(tài),絨毛間質(zhì)纖維組織增生,毛細(xì)血管管腔變小,子宮和胎盤(pán)內(nèi)可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。而對(duì)照組孕鼠子宮、胎盤(pán)則未出現(xiàn)上述病理學(xué)改變。對(duì)照組仔鼠神經(jīng)細(xì)胞排列整齊均勻,呈現(xiàn)圓形或橢圓形細(xì)胞核,核仁清晰,染色質(zhì)較均勻;LPS組仔鼠腦室旁白質(zhì)結(jié)構(gòu)稀疏,神經(jīng)元排列紊亂,出現(xiàn)明顯的結(jié)構(gòu)缺陷,少量細(xì)胞出現(xiàn)核固縮、溶解的現(xiàn)象。見(jiàn)圖1。

注:A:LPS組孕鼠子宮;B:對(duì)照組孕鼠子宮:C:LPS組孕鼠胎盤(pán);D:對(duì)照組孕鼠胎盤(pán);E:LPS組仔鼠腦組織;F:對(duì)照組仔鼠腦組織;A-D,HE染色(×200);E-F,HE染色(×400)。圖1 LPS對(duì)孕鼠子宮、胎盤(pán)和新生仔鼠腦組織的影響

3.3 各組大鼠PSD-95、NMDAR-2B蛋白表達(dá)水平比較不論在早期干預(yù)或晚期干預(yù),與空白組比較,模型組PSD-95及NMDAR-2B蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05);與模型組比較,低、高劑量蒲金口服液組PSD-95、NMDAR-2B 蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05);與銀杏葉提取物組比較,高劑量蒲金口服液組PSD-95、NMDAR-2B 蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。與同時(shí)期低劑量蒲金口服液組比較,高劑量蒲金口服液組PSD-95、NMDAR-2B 蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05);與晚期干預(yù)組比較,早期干預(yù)的低、高劑量蒲金口服液組和銀杏葉提取物組PSD-95、NMDAR-2B 蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。以上結(jié)果表明,早期高劑量的蒲金口服液干預(yù)上調(diào)PSD-95及NMDAR-2B蛋白表達(dá)效果更顯著。見(jiàn)表3、圖2—圖3。

注:A1:早期干預(yù)高劑量蒲金口服液組;B1:早期干預(yù)低劑量蒲金口服液組;C1:早期干預(yù)銀杏葉提取物組;D1:早期干預(yù)模型組;E1:早期干預(yù)空白組。圖2 早期干預(yù)組仔鼠腦組織PSD-95、NMDAR-2B蛋白表達(dá)條帶圖

注:A2:晚期干預(yù)高劑量蒲金口服液組;B2:晚期干預(yù)低劑量蒲金口服液組;C2:晚期干預(yù)銀杏葉提取物組;D2:晚期干預(yù)模型組;E2:晚期干預(yù)空白組。圖3 晚期干預(yù)組仔鼠腦組織PSD-95、NMDAR-2B蛋白表達(dá)條帶圖

表3 蒲金口服液對(duì)大鼠腦組織PSD95、NMDAR-2B蛋白表達(dá)水平的影響

3.4 各組仔鼠腦組織PSD-95mRNA、NMDAR-2BmRNA表達(dá)水平比較不論在早期干預(yù)或晚期干預(yù),與空白組比較,模型組PSD-95mRNA、NMDAR-2BmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05);與模型組比較,低、高劑量蒲金口服液組PSD-95mRNA、NMDAR-2BmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05);與銀杏葉提取物組比較,高劑量蒲金口服液組PSD-95mRNA、NMDAR-2BmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。與同時(shí)期低劑量蒲金口服液組比較,高劑量蒲金口服液組PSD-95mRNA、NMDAR-2BmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05);與晚期干預(yù)組比較,早期干預(yù)的低、高劑量蒲金口服液組和銀杏葉提取物組PSD-95mRNA、NMDAR-2BmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。以上結(jié)果表明,早期高劑量的蒲金口服液干預(yù)上調(diào)PSD-95mRNA、NMDAR-2BmRNA表達(dá)效果更顯著。見(jiàn)表4。

表4 蒲金口服液對(duì)大鼠腦組織PSD95 mRNA、NMDAR-2B mRNA表達(dá)的影響

4 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,早產(chǎn)兒腦損傷的病位在腦,累及神志及四肢,且病況變化多樣,臨床治療應(yīng)以醒腦開(kāi)竅、調(diào)理氣血、疏通經(jīng)絡(luò)為治療原則。早產(chǎn)兒腦損傷在中醫(yī)學(xué)中無(wú)專(zhuān)有病名,目前普遍認(rèn)同依據(jù)臨床相關(guān)癥狀將其歸于傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)“五遲”“五軟”“五硬”等范圍,從病因?qū)W理解為孕婦“難產(chǎn)”和小兒“不啼”等。在中醫(yī)古代相關(guān)文獻(xiàn)中,“胎弱”“胎怯”等病癥與腦損傷臨床表現(xiàn)相符合。

《小兒衛(wèi)生總微論方》針對(duì)早產(chǎn)兒出生窒息、不啼的病因進(jìn)行具體分析,并提出了相應(yīng)的處理方法和一些切實(shí)可行的、有針對(duì)性的防治方案。對(duì)于早產(chǎn)兒腦損傷的中醫(yī)病因病機(jī)研究,目前尚無(wú)統(tǒng)一論斷,臨床多以相關(guān)癥狀反推病因病機(jī),結(jié)合辨證,常見(jiàn)如先天不足,孕婦氣血虛弱,精衰氣弱,導(dǎo)致胎稟不良;胎婦嗜酒貪欲,亦或憤怒跌仆,胎形受損,導(dǎo)致胞損,筋骨不榮。父母暮年育之,或孕婦產(chǎn)多,成胎時(shí)元精澆漓,受胎則氣血難養(yǎng),導(dǎo)致生而怯弱。后天不足如幼小養(yǎng)護(hù)失當(dāng),飲食失調(diào),或疾病纏綿不斷,或受累于藥害,或跌仆外傷,臟腑功能失司,氣血損耗,百脈宗筋失于濡養(yǎng)而致病。

本研究中蒲金口服液由石菖蒲、郁金、丹參、紅花四味藥組成,具有化痰開(kāi)竅、活血化瘀的功效。有研究發(fā)現(xiàn),中藥制劑丹參注射液能改善缺氧缺血腦損傷大鼠腦神經(jīng)及突觸結(jié)構(gòu)的損害,提升突觸素(synapsin,SYN)表達(dá),改善突觸超微結(jié)構(gòu)[14-15]?，F(xiàn)代研究證實(shí),石菖蒲揮發(fā)油既能安神益智,又可開(kāi)竅醒神,其有效成分具有顯著控制腦損傷大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的效果,其水提醇沉液可使AlCl3所致癡呆大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力提升,減少通過(guò)迷宮的時(shí)間,促進(jìn)海馬CA3區(qū)突觸后膜致密物質(zhì)增厚[16-17];郁金性寒,味辛、苦,歸肝、心、肺經(jīng),其主要化學(xué)成分為揮發(fā)油和姜黃素,具有活血行氣、涼血解郁、利膽退黃等功效,其中姜黃素還具有降血脂、抗氧化、抗炎、保護(hù)腦缺血再灌注和抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用[18-20]。前期相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示,蒲金口服液能下調(diào)ROS產(chǎn)生、提升SOD活力、抗自由基,以實(shí)現(xiàn)擴(kuò)腦膜血管、控制瘀血形成,有效改善腦損傷大鼠的缺氧缺血癥狀[8-11]。銀杏葉提取物是目前臨床應(yīng)用最普遍的中藥制劑之一,功效為活血通絡(luò)化瘀,其主要成分為黃酮苷、銀杏內(nèi)酯和白果內(nèi)酯等,具有顯著的促神經(jīng)突觸生長(zhǎng)、控制神經(jīng)細(xì)胞凋亡、清除自由基、促腦血管擴(kuò)張、抑制腦缺血再灌注損傷、抗炎等效果[21]。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,銀杏葉提取物治療新生缺血缺氧性腦損傷鼠有一定的療效,所以本研究應(yīng)用銀杏葉提取物作為對(duì)照[22]。

宮內(nèi)感染/炎癥后,誘導(dǎo)tPA依賴(lài)性膠質(zhì)細(xì)胞的激活,釋放潛在的神經(jīng)毒性物質(zhì)和炎性因子,其中包括興奮性氨基酸谷氨酸,谷氨酸釋放增多,代謝減少,在突觸間大量堆積,谷氨酸受體調(diào)控異常,突觸后膜神經(jīng)元過(guò)度興奮,神經(jīng)細(xì)胞因滲透性腫脹、變性、壞死而數(shù)量減少,軸突、樹(shù)突發(fā)育不良,導(dǎo)致突觸生成受阻和功能性修飾障礙,最終導(dǎo)致腦損傷,甚至CP。CP、中風(fēng)及腦缺氧等疾病與谷氨酸受體介導(dǎo)的神經(jīng)通路密切相關(guān),谷氨酸受體介導(dǎo)的神經(jīng)通路參與眾多代謝活動(dòng),如神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的存活、發(fā)育、增殖及凋亡、突觸可塑性變化等[23-24]。谷氨酸受體是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中極為重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)受體,谷氨酸受體分為離子型和代謝型,而在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中突觸前膜釋放的谷氨酸主要與突觸后膜的兩種離子型谷氨酸受體結(jié)合從而發(fā)揮作用,即NMDAR和AMPAR[25]。NMDAR在突觸后膜上常常與多種蛋白(黏附蛋白、骨架蛋白、銜接蛋白等等)共價(jià)結(jié)合形成復(fù)合物從而發(fā)揮其特定功能,所以當(dāng)NMDAR與神經(jīng)遞質(zhì)結(jié)合后,信號(hào)蛋白受到刺激進(jìn)而激活下游信號(hào)通路,進(jìn)而完成了NMDAR對(duì)突觸可塑性的調(diào)節(jié)作用[26]。此外,突觸可塑性亦可反向調(diào)節(jié)NMDAR的活性,當(dāng)受到外界特定刺激后,神經(jīng)元內(nèi)NMDAR及相關(guān)蛋白(如PSD-95、eNOS、CaMKIIa等)表達(dá)增加,從而實(shí)現(xiàn)了二者間的雙向調(diào)控。PSD-95主要通過(guò)兩個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)與NMDAR的C末端相結(jié)合,參與NMDAR在突觸上的富集、錨定以及胞內(nèi)信號(hào)通路的激活,從而發(fā)揮其對(duì)突觸可塑性的調(diào)節(jié)作用。因此,PSD-95對(duì)谷氨酸受體的成熟、神經(jīng)元的發(fā)育以及突觸可塑性的調(diào)節(jié)至關(guān)重要[27-32]。

本研究用RT-PCR、Western Blot法檢驗(yàn)宮內(nèi)感染/炎癥造成早產(chǎn)腦損傷大鼠腦組織PSD-95、NMDAR-2B的表達(dá),探討蒲金口服液對(duì)宮內(nèi)感染/炎癥致早產(chǎn)腦損傷大鼠的作用機(jī)制,結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,早產(chǎn)腦損傷大鼠腦組織內(nèi)PSD-95、NMDAR-2B的mRNA和蛋白表達(dá)量下降,表明LPS感染引起的子代大鼠腦損傷與突觸后致密物質(zhì)密切相關(guān)。經(jīng)過(guò)蒲金口服液治療后,各組大鼠腦組織PSD-95、NMDAR-2B的mRNA、蛋白含量均提高,突觸后膜致密物增多,且可能激活相關(guān)信號(hào)通路,促進(jìn)神經(jīng)元的增殖,抑制腦損傷的細(xì)胞凋亡,保證突觸的結(jié)構(gòu)完整性,有利于腦損傷細(xì)胞的恢復(fù)。早期高劑量蒲金口服液組的效果明顯高于銀杏葉提取物組與低劑量蒲金口服液組,表明早期高劑量蒲金口服液干預(yù)在促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞恢復(fù)方面作用顯著,其機(jī)制與促進(jìn)PSD-95、NMDAR-2B的表達(dá),改善突觸后膜致密物積聚與修復(fù),調(diào)節(jié)突觸可塑性,保持突觸的結(jié)構(gòu)完整性有關(guān)。

綜上,高劑量蒲金口服液可上調(diào)宮內(nèi)感染/炎癥致早產(chǎn)腦損傷大鼠腦組織PSD-95及NMDAR-2B的表達(dá),且早期干預(yù)效果更顯著。神經(jīng)細(xì)胞的再生、修復(fù)與重組機(jī)制比較復(fù)雜,本研究選取觀(guān)察的時(shí)間點(diǎn)數(shù)量單一,無(wú)法完全明確宮內(nèi)感染/炎癥所致早產(chǎn)腦損傷仔鼠腦組織中PSD-95、NMDAR-2B表達(dá)水平的趨勢(shì)。局限于突觸后致密物PSD-95和NMDAR-2B兩種靶因子,靶點(diǎn)單一,仍需進(jìn)一步研究其他突觸后致密物質(zhì)和相關(guān)信號(hào)通道的影響及作用機(jī)制。