胡競捷 綜述，李新宇 審校

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院，武漢 430030)

1 外泌體的生物學(xué)特性

1.1 外泌體的結(jié)構(gòu)與功能

細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)是所有包被脂質(zhì)雙層的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)的總稱，根據(jù)其形成方式、顆粒大小和功能特性，通常可分為三種亞型：外泌體(直徑30～150 nm)、微泡(直徑100～1 000 nm)和凋亡小體(直徑100～5 000 nm)[4]。外泌體是EVs的最小亞型，其電子顯微鏡下為雙層磷脂分子結(jié)構(gòu)，大多為扁球形或杯狀，在體液中多以球形的形式存在[5]。由于上述三者之間的物理和化學(xué)性質(zhì)之間存在重疊，無論是結(jié)構(gòu)還是功能上都無法做到完全分離，越來越多的研究將它們歸為一類[6-7]。外泌體的外膜主要由脂質(zhì)(膽固醇、磷脂和磷脂酰絲氨酸)組成，同時包含多種膜蛋白[8]。外泌體的膜蛋白在其生物學(xué)功能中發(fā)揮著重要作用，例如四次跨膜蛋白(CD9、CD63、CD81、CD82)、筏蛋白(flotillin)、膜聯(lián)蛋白(annexins)、整合素蛋白(integrin)。除了各種膜蛋白外，還有許多發(fā)揮重要功能的可溶蛋白還存在于外泌體腔中，例如熱休克蛋白HSP70、HSP90和Rab GTP酶等[9]。近年來，外泌體包含的遺傳物質(zhì)在細(xì)胞間通信和細(xì)胞間遺傳物質(zhì)交換中的作用受到了廣泛的關(guān)注。其中，非編碼RNA如微小RNA(microRNA,miRNA)、長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)和環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)，在許多疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用[10]。

1.2 外泌體的形成過程

外泌體起源于細(xì)胞膜內(nèi)陷形成的早期內(nèi)吞體。成熟的晚期內(nèi)吞體的膜向內(nèi)萌發(fā)，形成腔內(nèi)小體(intraluminal vesicles,ILV)，并轉(zhuǎn)化為MVB。在MVB與細(xì)胞膜融合后，ILV被釋放到細(xì)胞外形成外泌體。外泌體主要通過內(nèi)體蛋白分選轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合物途徑產(chǎn)生。內(nèi)體蛋白分選轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合物由至少20種蛋白質(zhì)組成，它們由從酵母到哺乳動物高度保守的幾種相關(guān)蛋白(VPS4、VTA1和ALIX等)組裝成四個復(fù)合體(ESCRT-0、ESCRT-Ⅰ、ESCRT-Ⅱ和ESCRT-Ⅲ)[11-12]。人體內(nèi)的絕大多數(shù)細(xì)胞都可以產(chǎn)生外泌體，包括免疫細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)等[13]。因此外泌體分布十分廣泛，目前已從人體多種體液中成功分離得到外泌體。

2 外泌體在眼科疾病中的相關(guān)研究

2.1 眼表疾病相關(guān)研究

近年來，MSCs來源的外泌體(MSCs-exo)在眼表疾病治療中的潛力受到研究者的關(guān)注。MSCs是起源于中胚層的多能干細(xì)胞，可從多種易獲得的組織中分離，例如骨髓、脂肪、臍帶等。起初MSCs被認(rèn)為通過自身分化為相應(yīng)的細(xì)胞類型發(fā)揮其損傷修復(fù)的作用[14]。然而，越來越多的證據(jù)表明MSCs的旁分泌功能在損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用，MSCs-exo是其旁分泌的主要物質(zhì)，具有與MSCs相似的抗炎、抗凋亡、組織修復(fù)、神經(jīng)保護(hù)及免疫調(diào)節(jié)的特性[15]。

2.1.1 角膜損傷

角膜外傷是最常見的角膜損傷，角膜外傷可導(dǎo)致角膜缺損，損傷嚴(yán)重者還會導(dǎo)致潰瘍、穿孔，進(jìn)而演化為角膜瘢痕最終影響視力。對于嚴(yán)重的角膜瘢痕來說，唯一能恢復(fù)視力的方法是進(jìn)行角膜移植，但角膜來源的稀缺以及移植后可能引發(fā)的免疫排斥仍然是角膜損傷治療面臨的主要困難。研究表明，脂肪來源的MSCs的外泌體(adipose-derived stem cells-derived exosome,ADSC-exo)顯著促進(jìn)角膜基質(zhì)細(xì)胞的增殖并下調(diào)角膜中基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)和膠原蛋白以重塑細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)。ADSC-exo分泌的miR-19a抑制同源域相互作用蛋白激酶2(homeodomain interacting protein kinase 2,HIPK2)表達(dá)，從而抑制其下游的轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factorβ,TGF-β)/Smad3和p53通路，導(dǎo)致纖維化相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)降低，從而抑制角膜基質(zhì)細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化[16-17]。角膜緣基質(zhì)的角膜基質(zhì)干細(xì)胞(corneal stromal stem cell,CSSC)可以表現(xiàn)出與MSCs相似的特性。CSSC來源的外泌體可以將miRNA轉(zhuǎn)移到角膜上皮細(xì)胞和角膜基質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，減少纖維化基因Col3a1和Acta2的表達(dá)，阻斷中性粒細(xì)胞浸潤，從而減輕小鼠角膜損傷后瘢痕形成[18]。以上研究提示了外泌體在治療角膜纖維化方面的潛在用途。最近，Tang等[19]開發(fā)了一種基于誘導(dǎo)多能干細(xì)胞間充質(zhì)干細(xì)胞(induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells,iPSCMSCs)衍生的外泌體與熱敏水凝膠結(jié)合的新方法，以減少角膜瘢痕形成并加速愈合過程。熱敏水凝膠用于外泌體的緩釋，MSCs-exo可有效促進(jìn)受損角膜上皮和基質(zhì)層的修復(fù)，下調(diào)角膜基質(zhì)中的膠原蛋白的mRNA表達(dá)，減少細(xì)胞外基質(zhì)ECM的沉積，減少角膜瘢痕形成。該技術(shù)可用于各種角膜疾病的治療，具有廣闊的應(yīng)用前景。

2.1.2 角膜移植排斥反應(yīng)

角膜雖有免疫赦免特性，但移植術(shù)后排斥反應(yīng)仍可能導(dǎo)致手術(shù)失敗。CD4+T淋巴細(xì)胞、細(xì)胞因子、CD8+T細(xì)胞和效應(yīng)B細(xì)胞均參與角膜移植排斥反應(yīng)。Jia等[20]在角膜移植排斥模型大鼠結(jié)膜下注射骨髓(bone marrow)來源的MSCs的外泌體(BM-MSCs-exo)，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，如上調(diào)白介素(interleukin,IL)-10/干擾素(interferon,IFN)-γ水平，下調(diào)IL-17水平，調(diào)控Th細(xì)胞分化，抑制CD4+T淋巴細(xì)胞的表達(dá)以及上調(diào)Treg，延長角膜移植片存活時間。除MSCs外，Treg可通過釋放的高濃度EVs抑制CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞以誘導(dǎo)肝移植免疫耐受[21]。來自未成熟樹突狀細(xì)胞(immature dendritic cell,imDC)的外泌體分泌的miR-682下調(diào)CD4+T淋巴細(xì)胞中的含Rho關(guān)聯(lián)卷曲螺旋蛋白激酶2(Rho Associated Coiled Coil Containing Protein Kinase 2,ROCK2)基因促進(jìn)Treg分化，誘導(dǎo)模型小鼠移植腎的免疫耐受[22]。由此推測，Treg或imDC分泌的外泌體亦可能誘導(dǎo)角膜移植片的免疫耐受，但尚未見報(bào)道。

2.1.3 移植物抗宿主病

她也曾想活得很恣意。確實(shí)，很多如她這樣沒有牽掛的女孩子，都過得很隨性，周身帶著愛咋咋地的氣息。但她沒有，她依然是帶著淳樸的傻氣，待人處世都有點(diǎn)小心翼翼。所以，在接到他的電話后，她想都沒想就說了好。按說他算是她的領(lǐng)導(dǎo)，但是不是直屬，而是大她很多層。

移植物抗宿主病(graft versus-host disease,GVHD)是異基因造血干細(xì)胞移植后發(fā)生的一種疾病，眼部GVHD主要累及眼表。Carrasco等[23]在小鼠GVHD模型結(jié)膜下注射人BM-MSCs-exo，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BM-MSCs-exo可以減少CD3+T淋巴細(xì)胞、Pax6的表達(dá)，有效減輕眼部GVHD的角膜炎癥和鱗狀化生。另外有研究者發(fā)現(xiàn)BM-MSCs-exo可以抑制Th17細(xì)胞并誘導(dǎo)Treg，保存外周幼稚T細(xì)胞，從而提高GVHD小鼠的存活率并減輕其眼表病理損傷[24]。

2.1.4 眼干燥癥

眼干燥癥是由淚膜穩(wěn)態(tài)失衡引發(fā)的眼表損害，眼表炎癥與損傷是其病理機(jī)制之一。研究者發(fā)現(xiàn)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體(hUC-MSCs-exo)升高抗炎因子TGF-β、IL-10等的表達(dá)，抑制炎性因子如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、IL-1β的表達(dá)，促進(jìn)外周血單核巨噬細(xì)胞向抗炎性M2表型極化，減輕眼干燥癥角膜上皮的損傷，對眼干燥癥有治療作用[25-26]。另外Wang等[27]利用苯扎氯銨誘導(dǎo)小鼠眼干燥癥模型并發(fā)現(xiàn)，ADSC-exo可以抑制細(xì)胞凋亡，降低IL-1β、IL-6、IL-1α、IFN-γ和TNF-α的水平，增加抗炎細(xì)胞因子IL-10的水平。同時，ADSCExo可逆轉(zhuǎn)NLRP3炎性小體激活及caspase-1、IL-1β和IL-18的上調(diào)，從而減輕眼表炎癥。

2.2 眼底疾病相關(guān)研究

2.2.1 年齡相關(guān)性黃斑變性

早期年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration,AMD)主要是由于視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(retinal pigment epithelium,RPE)層下的蛋白與脂肪累積，進(jìn)而形成的RPE沉積物即玻璃膜疣導(dǎo)致的，是目前老年患者中心視力下降的主要原因。有研究者發(fā)現(xiàn)，玻璃膜疣中的細(xì)胞蛋白質(zhì)組的特征與外泌體蛋白質(zhì)組的特征具有相似性，因此RPE細(xì)胞可能依靠外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞內(nèi)蛋白，參與玻璃膜疣的形成過程[28]。此外，氧化應(yīng)激環(huán)境也是AMD的關(guān)鍵致病因素之一。Aroca等[29]的研究發(fā)現(xiàn)，RPE細(xì)胞會在氧化應(yīng)激環(huán)境誘導(dǎo)下釋放更多的外泌體。該研究檢測了RPE細(xì)胞所釋放出的外泌體蛋白，發(fā)現(xiàn)其中富含高表達(dá)的血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)受體。另外，研究者將分離出的外泌體與血管內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的成管能力得到明顯提升。而脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)的形成可能導(dǎo)致滲出性AMD，所以研究結(jié)果表明該機(jī)制可能與滲出性AMD病理過程相關(guān)。He等[30]在體外實(shí)驗(yàn)觀察到hUC-MSCs-exo可以下調(diào)受到藍(lán)光損傷的RPE細(xì)胞VEGF的表達(dá)，同時減少激光損傷后大鼠CNV的形成，從而減少視網(wǎng)膜的損傷。因此，MSCs-exo可能是治療滲出性AMD的有效工具。

2.2.2 糖尿病視網(wǎng)膜病變

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)是成年人致盲的主要原因之一，該病變是由神經(jīng)元和視網(wǎng)膜血管的進(jìn)行性退化所引起的。研究證明糖尿病患者視網(wǎng)膜中的補(bǔ)體蛋白沉積可能導(dǎo)致DR。Huang等[31]檢測了DR患者的血液樣本，發(fā)現(xiàn)DR患者血漿中所含有的外泌體攜帶的補(bǔ)體數(shù)量增多，經(jīng)血液循環(huán)到達(dá)視網(wǎng)膜微血管中，進(jìn)而引發(fā)視網(wǎng)膜微血管的滲漏。當(dāng)糖尿病患者體內(nèi)發(fā)生炎癥，單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞在炎癥環(huán)境下關(guān)系密切，當(dāng)單核細(xì)胞被激活后，其外泌體中血管細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)表達(dá)增多，內(nèi)皮細(xì)胞被進(jìn)一步激活，表達(dá)新的抗原，釋放細(xì)胞因子和多種炎癥介質(zhì)，從而加劇血管炎癥。研究表明，在鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)誘導(dǎo)的DR模型中，結(jié)膜下注射或玻璃體腔注射ADSC-exo都可以有效減輕視網(wǎng)膜變性[3]。Zhang等[32]在高糖條件下將培養(yǎng)液中高表達(dá)miR-126的hUC-MSCs-exo與人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞(human retinal endothelial cells,HREC)進(jìn)行體外共培養(yǎng)。結(jié)果表明外泌體可以下調(diào)caspase-1、IL-1b和IL-18的水平，明顯減少高糖暴露下HREC的炎性反應(yīng)。

2.2.3 視網(wǎng)膜脫離

視網(wǎng)膜脫離(retinal detachment,RD) 是常見的眼底疾病，指視網(wǎng)膜的神經(jīng)上皮層與色素上皮層的分離。Ma等[33]選用雄性SD大鼠，視網(wǎng)膜下注射1%透明質(zhì)酸建立RD模型，在視網(wǎng)膜分離時將BM-MSCsexo注射到視網(wǎng)膜下，研究其治療效果。結(jié)果表明BM-MSCs-exo下調(diào)了TNF-α和IL-1β水平及凋亡相關(guān)蛋白酶caspase-8的水平，抑制光感受器細(xì)胞的凋亡。同時，研究者對MSCs-exo中攜帶的蛋白質(zhì)進(jìn)行組學(xué)分析，結(jié)果顯示193個蛋白中共有9個蛋白具有抗炎性，能夠起到神經(jīng)保護(hù)和緩解細(xì)胞凋亡的作用。因此，MSCs-exo的應(yīng)用對RD誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜損傷有治療作用，是RD的一種潛在輔助治療手段。

2.2.4 早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變

早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(retinopathy of prematurity,ROP)是指早產(chǎn)兒未血管化的視網(wǎng)膜中發(fā)生纖維血管瘤增生、收縮后，引發(fā)的牽拉性視網(wǎng)膜脫離，嚴(yán)重者將導(dǎo)致失明。研究發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞來源的外泌體在ROP中具有保護(hù)作用。Xu等[34]將出生后7 d的小鼠置于高氧艙中5 d建立氧源性ROP模型(oxygen-induced retinopathy,OIR)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞來源的外泌體下調(diào)了視網(wǎng)膜中VEGF mRNA，明顯抑制VEGF表達(dá)。微RNA分析表明，小膠質(zhì)細(xì)胞外泌體中含有水平極高的miR-24-3p，外泌體通過高含量的miR-24-3p抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)核信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白1a途徑，從而減緩氧誘導(dǎo)的光感受器細(xì)胞的凋亡速度，為治療ROP提供思路。綜上，小膠質(zhì)細(xì)胞外泌體能夠減輕OIR動物模型中的血管病變程度，進(jìn)而抑制視力損傷，該研究為當(dāng)前社會中的ROP提供了一種潛在有效的治療方法。

2.3 青光眼相關(guān)研究

青光眼(glaucoma)是以病理性高眼壓、視神經(jīng)萎縮、視野缺損、視力下降為特征的一種常見眼病。Perkumas等[35]通過對小梁網(wǎng)(trabecular meshwork,TM)細(xì)胞的外泌體進(jìn)行蛋白質(zhì)譜鑒定以確定外泌體在眼壓調(diào)控中是否產(chǎn)生作用，由鑒定結(jié)果可知，除外泌體本身含有的108種外泌體特征蛋白外，還包含了如Emilin-1、Neuropilin-1、肌纖蛋白(myocilin,MYOC)等多種TM細(xì)胞的特異性蛋白，此研究結(jié)果表明外泌體有參與眼壓調(diào)控的可能性。Liu等[36]提取了原發(fā)性開角型青光眼(primary open angle glaucoma,POAG)患者的TM組織標(biāo)本，與正常對照組基因進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)其中36種外泌體基因存在差異性表達(dá)，由此可以推測異常的外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)途徑可能是POAG的潛在發(fā)病機(jī)制。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells,RGCs)的喪失或功能障礙是青光眼患者不可逆性失明的主要原因。有研究者將BM-MSCs-exo移植到兩種不同的青光眼動物模型(激光凝固小梁網(wǎng)和角膜緣血管小鼠模型、微球前房注射小鼠模型)的玻璃體中。在這兩種模型中，骨髓MSC 來源的外泌體均將相關(guān)mRNA(miR-100-5P、miR-106A-5P等)轉(zhuǎn)運(yùn)入RGC內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，明顯促進(jìn)RGCs的存活，同時防止其功能衰退，并對軸突有一定的保護(hù)作用[37]。Mead等[38]通過建立視神經(jīng)鉗夾傷的動物模型，在實(shí)驗(yàn)中對模型動物的玻璃體腔注射BM-MSCs-exo。通過對比注射PBS組和注射MSCs組的RGC的存活率，發(fā)現(xiàn)注射MSCs-exo的實(shí)驗(yàn)組動物RGC存活率更高，細(xì)胞功能恢復(fù)，狀態(tài)良好，RGC軸突丟失率明顯降低。另外，視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury,IRI)是青光眼的主要發(fā)病機(jī)制之一。Yu等[39]在IRI小鼠眼內(nèi)注射TNF-α刺激后牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體(TNF-α-stimulated gingival MSCexosome,TG-exo)，研究發(fā)現(xiàn)TG-exo通過miR-21-5p在視網(wǎng)膜IRI小鼠模型中發(fā)揮了抗炎和保護(hù)RGC的作用。以上研究均表明由外泌體介導(dǎo)的無細(xì)胞療法可能是青光眼疾病治療研究的新思路.

3 總結(jié)與展望

綜上所述，外泌體作為機(jī)體細(xì)胞通信的重要媒介，近年來其在眼科領(lǐng)域的研究受到了越來越多學(xué)者的關(guān)注。外泌體可通過傳遞自身攜帶的內(nèi)容物來參與眼表疾病、眼底疾病和青光眼等多種眼科疾病的發(fā)生與發(fā)展。外泌體在眼科疾病中的研究目前還處于初步探索階段，盡管有許多實(shí)驗(yàn)研究顯示了外泌體的抗炎、抗凋亡、組織修復(fù)、神經(jīng)保護(hù)及免疫調(diào)節(jié)等多方面的治療潛力，但轉(zhuǎn)化到臨床仍有很多工作要做，例如如何高效分離純化外泌體，不同細(xì)胞來源的外泌體在眼科疾病中的不同作用也需進(jìn)一步探討。總的來說，將外泌體應(yīng)用于眼科疾病的診斷和治療雖然方法尚未成熟，但前景廣闊，值得積極探索。

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