楊雅琪,靳 偉,羅 瓊,徐 強

(南京大學生命科學學院,醫(yī)藥生物技術國家重點實驗室,江蘇 南京 210023)

干燥綜合征(Sjogren’s syndrome, SS)是一種慢性自身免疫性疾病,其特征是由淚腺和唾液腺功能障礙引起的眼和口干燥,常表現(xiàn)出廣泛的臨床表現(xiàn)和分散的并發(fā)癥,導致患者出現(xiàn)抑郁、疲勞、疼痛等癥狀,嚴重影響日常生活質(zhì)量。此外,大約5%的SS患者會發(fā)展為低級別B細胞非霍奇金淋巴瘤,尤其是黏膜相關淋巴組織(mucosa-assaciated lymphoid tissue, MALT)淋巴瘤。迄今為止,人們普遍認為一些遺傳多態(tài)性[1-2]、病毒侵染和免疫系統(tǒng)失調(diào)是誘發(fā)SS的重要原因。其機制包括干擾素(IFN-β)途徑的激活[3],B淋巴細胞的持續(xù)活化[4]以及Th1和Th17細胞的增殖[5]等。目前,全球范圍內(nèi)尚無根治SS的方法,也沒有獲得該疾病適應癥的藥物。英國風濕病學會和歐洲抗風濕病聯(lián)盟發(fā)布的SS患者管理指南都旨在通過局部治療緩解外分泌腺體癥狀,未提供具體的治療目標[6-7]。因此,尋找低毒、高效的治療SS的藥物是當前領域的熱點之一。

甲氨蝶呤(methotrexate, MTX)是一種抑制二氫葉酸還原酶的抗代謝類有機化合物,主要用于類風濕關節(jié)炎、銀屑病等自身免疫性疾病和抗腫瘤的治療,具有強大的療效和耐受性[8]。體外研究表明,MTX可以通過多種途徑如增加胞外腺苷的積累與抗炎腺苷的結合[9];產(chǎn)生活性氧誘導轉(zhuǎn)化T細胞凋亡[10];抑制NF-κB[11]、JAK-STAT[12]炎癥信號通路和細胞因子的產(chǎn)生等調(diào)節(jié)機體免疫炎癥反應。然而,其對同樣是自身免疫性疾病的SS是否有效還未知。本研究旨在探討MTX對實驗性干燥綜合征(experimental Sjogren’s syndrome, ESS)的治療效果并初步探討其機理,從而在短時間內(nèi)尋找到治療SS全身性炎癥反應的候選藥物。

1 材料

1.1 實驗動物健康C57BL/6J雌性小鼠,體質(zhì)量(18～20) g,6～8周齡,SPF級,購于北京維通利華實驗動物技術有限公司,生產(chǎn)許可證號:SCXK(蘇)2016-0003,飼養(yǎng)于南京大學生命科學學院動物實驗室,在(21 ± 2)℃、自由取食、自由飲水和12 h晝夜交替的SPF級條件下飼養(yǎng)。所有動物實驗均在南京大學實驗動物委員會的批準下進行,且實驗方法符合動物實驗的相關指南。

1.2 試劑MTX(S1210)、匹羅卡品(GC17256)購自Sellekchem;硫酸羥氯喹(HCQ,L2004157)購自Aladdin;羧甲基纖維素鈉(C8621)購自Solarbio;BCA 蛋白定量試劑盒(23227)購自Thermo;完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑(F5506)購自Sigma;戊巴比妥鈉購自Sigma;肝素鈉(Sigma);M3R 抗原肽段(C955JEK060-1,VLVNTFCDSCIPKTYWNLGY)、SSA 抗原肽段(C955JEK060-5,AVALREYRKKMDIPA)購自金斯瑞;Polyclonal Goat Anti-Mouse IgG購自Cell Way-Lab;吐溫 20、乙醇(國內(nèi)分析純);生物素偶聯(lián) anti-mouse IgG(405303)、HRP親和素(405210)、TMB 底物顯色液(77247)、終止液 3M (77316)、流式抗體 PE-anti-CD45購自Biolegend。

1.3 實驗儀器Elx800酶標檢測發(fā)光儀(美國Bio-Tek公司);qPCR(美國Bio-Rad公司);2720熱循環(huán)儀、聲波聚焦流式細胞儀Attune NxT(美國Thermo Fisher scientific公司);熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

2 方法

2.1 動物分組及頜下腺蛋白誘導的小鼠ESS模型建立取8周C57BL/6雌性小鼠,隨機分成4組(每組12只):I組為正常對照組;Ⅱ組為溶劑對照組,給予羧甲基纖維素鈉;III組為MTX治療組(5 mg·kg-1);Ⅳ組為HCQ治療組(50 mg·kg-1)。自免疫當天起,每天灌胃給予200 μL化合物。

免疫當天,在無菌環(huán)境下,取2只野生型C57BL/6雌鼠雙側頜下腺,用預冷的無菌PBS沖洗兩遍后于組織研磨機中攪碎為組織-PBS勻漿液,12 000g離心10 min,取上清進行BCA定量,PBS將抗原稀釋為8 g·L-1。然后將同等體積的頜下腺蛋白上清液與完全弗氏佐劑(含1 g·L-1熱滅活的結核分歧桿菌)分別置于乳化用的注射器中,推壓直至注射器管內(nèi)混合液呈乳白色且遇水不易散開,此時可以將混合的抗原乳化液轉(zhuǎn)移至1 mL注射器中,置于冰上備用。除Normal組外,每只待造模小鼠背部皮下三點注射400 μg頜下腺蛋白與完全弗氏佐劑乳化后的混合液進行抗原免疫;初次免疫第14 d,在背部注射同等量頜下腺蛋白與不完全弗氏佐劑的乳化液加強免疫。

2.2 測定唾液流速用0.1%戊巴比妥鈉麻醉小鼠后,腹腔注射100 μL 匹羅卡品(5 mg·kg-1)。將小鼠頭部墊高以防嗆鼻、窒息后,開始計時 15 min,用 20 μL移液管尖端收集唾液。

2.3 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)將毛細玻璃管置于30 g·L-1肝素鈉中4 ℃浸泡過夜,第2天即可用于小鼠眼眶靜脈叢取血。每只小鼠取血100～150 μL即可,放于37.5 ℃水浴鍋中水浴10 min后2 500g離心5 min,取上清備用。96孔MaxiSorp板分別用M3R和SSA抗原肽(5 mg·L-1)4 ℃包被過夜,第2天用PBST洗板3次后每孔加100 μL Blocking Buffer封閉1 h;洗板3次,拍干,除空白對照孔外,血清樣品稀釋1 600倍后每孔100 μL室溫孵育2 h;洗板3次,拍干,除空白對照孔外,每孔加100 μL生物素偶聯(lián) anti-IgG (0.5 mg·L-1),室溫孵育1 h;洗板3次,拍干,除空白對照孔外,每孔加100 μg HRP親和素(0.5 mg·L-1),室溫孵育30 min;洗板至少4次,完全拍干后每孔加50 μL TMB顯色液,約10 min后可見孔內(nèi)液體變藍,每孔加20 μL Stop Solution終止顯色,最后孔內(nèi)溶液呈黃色,置于酶標檢測發(fā)光儀內(nèi),450 nm波長處檢測A值。

2.4 病理切片蘇木精-伊紅(HE)染色C57BL/6小鼠處死后,取出雙側頜下腺,放入裝有4 %多聚甲醛的管子里固定、脫水、石蠟包埋。切片經(jīng)HE染色,由光學顯微鏡觀察、拍照。

2.5 流式細胞術小鼠斷頸處死后,取雙側頜下腺用冰PBS沖洗凈后,在6孔板中剪碎成泥; 加2 mL 0.5 g·L-1膠原酶 IV,置于37 ℃搖床中消化30 min;加2 mL含質(zhì)量濃度為1 g·L-1FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基搖晃均勻終止消化;將組織細胞混懸液濾至新的15 mL離心管中,300g離心5 min;棄上清,用2 mL Tris-NH4Cl重懸,去紅5 min后,離心,PBS洗兩遍,轉(zhuǎn)至1.5 mL離心管中,3 000 r·min-1離心5 min,棄上清。在PBS中以1 ∶1 000稀釋流式抗體CD45(避光),每管加入200 μL,室溫孵育30 min。染色結束后 3 000 r·min-1離心5 min,棄上清,PBS清洗兩遍后,用1 mL PBS輕柔重懸后即可上機檢測。

2.6 qPCR檢測mRNA表達總體上樣量為 10 μL,配方為 5 μL 2×iQTMSYBR?Green Supermix 熒光染料、 3.5 μL水、1 μL cDNA、0.25 μL引物(Former)、0.25 μL引物(Reverse);根據(jù)所需 cDNA 和引物的量分別配置水、cDNA 的混合液和熒光染料、引物的混合液;配制好后渦旋,離心;上樣,封膜,離心。設置參數(shù),擴增程序為 95 ℃,10 min;95 ℃,30 s;60 ℃,10 s,40個循環(huán)。根據(jù)擴增曲線,計算每組樣品相對的mRNA表達量。結果以GAPDH作為參照基因進行標準化。

3 結果

Tab 1 Primers involved in Real-Time PCR

3.1 SG蛋白成功建立小鼠ESS模型臨床上,SS患者通常表現(xiàn)出口干,腺體腫大,淋巴細胞免疫紊亂,疾病相關特異性抗體大量分泌等癥狀。為了探討SG蛋白建立的小鼠ESS模型是否具有臨床相似性,自免疫當天起,對其進行評估。與正常組相比,造模小鼠的體質(zhì)量穩(wěn)定增長,基本在20～21 g(Fig 1A),唾液流速從第8天開始顯著下降(Fig 1B),第42天頜下腺和頸部淋巴結明顯腫大(Fig 1C),SS特異性抗SSA抗體和抗M3R抗體均有所升高(Fig 1D),頜下腺組織中出現(xiàn)大量淋巴細胞浸潤(Fig 1E,F),說明利用SG蛋白建立的小鼠ESS模型可以表現(xiàn)出SS患者的核心癥狀,為進一步探究MTX對ESS小鼠的影響提供實驗模型。

Fig 1 ESS induced in C57BL/6J mice by subcutaneous injection of SG protein

3.2 MTX對ESS小鼠體質(zhì)量和唾液流速的影響為了探討MTX對小鼠ESS的治療效果,自免疫當天起,給予5 mg·kg-1MTX持續(xù)治療56 d。與模型組相比,MTX治療組小鼠體質(zhì)量同步穩(wěn)定增長(Fig 2A),并且小鼠未出現(xiàn)精神萎靡,食欲不振等不良反應,說明5 mg·kg-1MTX對小鼠沒有明顯的毒副作用。MTX治療第42天后,ESS小鼠唾液流速明顯回升,與陽性藥HCQ治療組效果相當(Fig 2B),說明5 mg·kg-1MTX可以明顯改善ESS小鼠唾液流速的減少。

Fig 2 Effects of 5 mg·kg-1 MTX on body weight (A) and salivary flow rates (B) in mice

3.3 MTX對ESS小鼠血清中自身抗體水平的影響SS患者通常會表現(xiàn)出較高的抗SSA抗體和抗M3R抗體陽性率。為了探究MTX對ESS小鼠血清中這些特異性抗體的影響,ELISA檢測了各組小鼠血清中抗SSA抗體和抗M3R抗體水平。與模型組相比,免疫第28、42、56天后,MTX均沒有明顯抑制ESS小鼠血清中抗SSA抗體(Fig 3A)和抗M3R抗體(Fig 3B)的水平,說明5 mg·kg-1MTX不能阻止ESS小鼠血清中自身抗體的產(chǎn)生。而陽性藥HCQ治療組則可以在治療第42天后顯著減少抗SSA抗體和抗M3R抗體的分泌。

Fig 3 Effects of 5 mg·kg-1 MTX on anti-SSA and anti-M3R autoantibody levels in mice

3.4 MTX對ESS小鼠頜下腺組織中灶性淋巴細胞浸潤的影響小鼠頜下腺組織切片HE染色結果顯示,與模型組相比,MTX治療后腺體中的管狀、泡狀結構明顯清晰,灶性淋巴細胞浸潤面積顯著減小(Fig 4A);同時,流式細胞術分析顯示頜下腺中淋巴細胞的占比明顯下調(diào)(Fig 4B),與陽性藥HCQ治療組抑制效果相當,說明5 mg·kg-1MTX能夠明顯改善ESS小鼠頜下腺組織中由淋巴細胞浸潤引起的慢性炎癥反應。

3.5 MTX對ESS小鼠頜下腺組織中炎癥細胞因子的影響炎性細胞因子的產(chǎn)生可以誘導免疫反應細胞向小鼠頜下腺組織中的趨化。Tnfsf-13b、Ccl19、Ccl21、Cxcr4、Cxcl12、Cxcr5、Cxcl13等炎性因子對 T 細胞、B 細胞的浸潤活化和疾病的加重都至關重要。為了探究MTX對ESS小鼠頜下腺組織中炎癥細胞因子的影響,qPCR檢測了免疫第56天后各組小鼠頜下腺組織中炎性細胞因子的相對表達量。與模型組相比,MTX治療后炎性細胞因子Ccl21、Cxcr5、Cxcl13的表達明顯下調(diào),但Tnfsf-13b、Ccl19、Cxcr4、Cxcl12的表達水平變化并不顯著(Fig 5),說明5 mg·kg-1MTX可能通過調(diào)節(jié)Cxcr5-Cxcl13軸以及Ccl21的分泌抑制淋巴細胞向頜下腺組織的趨化。陽性藥HCQ治療組則抑制Ccl21和Cxcl12基因的表達,這可能與MTX和HCQ的分子作用機制不同有關。

Fig 4 Effect of 5 mg·kg-1 MTX on proportion of leukocyte infiltration in salivary glands of

Fig 5 Effect of 5 mg·kg-1 MTX on levels of inflammatory cytokines in salivary glands of

4 討論

SS患者占我國總人口的0.22%～0.77%,并且有30%～40%的患者會表現(xiàn)出全身性的癥狀。而無循證治療僅根據(jù)臨床經(jīng)驗使用人工淚液、唾液等各種人工替代品減輕口眼干燥等局部癥狀,無法解決全身性的炎癥反應。目前為了獲得治療SS的藥物,老藥新用和靶向治療兩種策略都在快速發(fā)展。盡管SS的發(fā)病機制不斷被發(fā)現(xiàn),但是尚無針對SS的靶向治療方案,在研的抗IFN-β、抗BAFF等靶向藥物可能是未來精準治療SS的主要趨勢。而已有的治療類風濕性疾病的藥物在SS臨床前試驗中并沒有表現(xiàn)出良好的藥物效果。

MTX具有抗炎和免疫抑制作用,已有臨床考察發(fā)現(xiàn)MTX聯(lián)合帕夫林膠囊、白芍總苷或者雷公藤多苷對SS的治療療效顯著。所以,本實驗通過構建ESS雌鼠模型[13],探究單獨使用MTX治療SS的效果。研究表明,在5 mg·kg-1MTX作用后,ESS小鼠唾液流速明顯加快,這與隨后被證實的小鼠頜下腺組織中淋巴細胞浸潤量減少相關。值得注意的是,Cxcr5只在B淋巴細胞和濾泡輔助T細胞中表達,這可能提示炎癥相關趨化因子Cxcr5/Cxcl13的變化會影響B(tài)淋巴細胞向頜下腺組織的趨化。

MTX治療具有一定局限性,研究表明,5 mg·kg-1MTX能夠明顯改善淋巴細胞的局部浸潤與趨化,但不能改善漿細胞分泌的抗SSA抗體和抗M3R抗體水平,所以還是需要考慮通過與其他生物制劑聯(lián)用來增強藥效。已有報道稱,MTX會導致機體免疫監(jiān)視功能的下降,而在病毒持續(xù)存在的情況下,病毒誘發(fā)的SS可能會產(chǎn)生病毒再激活的潛在風險。同時,對于治療炎癥性自身免疫疾病來說,給予MTX的劑量把握尤為重要,本文沒有討論多個不同劑量MTX對小鼠ESS的影響,不恰當MTX的使用可能會導致小鼠體質(zhì)量下降,肝、腎毒性,甚至是死亡。

綜上所述,MTX在一定程度上通過抑制淋巴細胞浸潤改善小鼠ESS,但藥物使用劑量以及作用機制還有待進一步研究。