張?zhí)熨n,賀小平,劉 珊,孫寧寧,李佳明,林一璨,董賢慧

(河北中醫(yī)藥大學(xué), 河北省心腦血管病中醫(yī)藥防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北 石家莊 050091)

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease, AD)是以學(xué)習(xí)記憶能力下降及自主探索行為減少為主要臨床表現(xiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[1],隨著老齡化進(jìn)程的加快,逐漸增多的AD患者給家庭與社會(huì)帶來(lái)了沉重負(fù)擔(dān)。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)運(yùn)體(cystine/glutamate antiporter, systemXc)從維持細(xì)胞外谷氨酸濃度、降低神經(jīng)元對(duì)Aβ的敏感毒性、抑制鐵死亡等角度減輕AD損傷[2],是AD的潛在治療靶點(diǎn)。SystemXc是位于細(xì)胞膜表面的異二聚體蛋白,由溶質(zhì)載體家族7成員11(solute carrier family 7 member 11, SLC7A11)與溶質(zhì)載體家族3成員2(solute carrier family 3 member 2, SLC3A2)共同組成[3],可以按照1 ∶1的比例交換細(xì)胞內(nèi)外的胱氨酸和谷氨酸,SLC7A11也是最新發(fā)現(xiàn)的識(shí)別AD的生物標(biāo)志物之一。因此,檢測(cè)海馬SLC7A11與SLC3A2的表達(dá)水平對(duì)于探討藥物對(duì)AD療效有一定的實(shí)際意義。

現(xiàn)階段AD治療藥物匱乏,臨床療效并不理想,而中藥多靶點(diǎn)、多角度的治療AD的特點(diǎn)逐漸受到重視。淫羊藿苷、黃芪甲苷、葛根素是中藥淫羊藿、黃芪、葛根的有效組分。前期研究基礎(chǔ)提示,淫羊藿苷、黃芪甲苷、葛根素組成的淫黃葛合劑可以減少APPswe/PS1dE9小鼠大腦皮質(zhì)老年斑的沉積,降低神經(jīng)元的損傷,但是其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步探討。因此,本實(shí)驗(yàn)以APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠為AD動(dòng)物模型,通過(guò)檢測(cè)海馬SLC7A11、SLC3A2蛋白與mRNA的表達(dá),初步探討淫黃葛合劑改善APPswe/PS1dE9小鼠行為學(xué)表現(xiàn)的機(jī)制,為AD的治療與用藥提供新方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑與儀器

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 APPswe/PS1dE9小鼠動(dòng)物購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司,許可證編號(hào)為:SCXK(京)2019-0008。所有實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)河北中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)與河北中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心批準(zhǔn),許可證號(hào)為SYXK(冀)2017-0005,保持12 h明暗周期,25 ℃室溫,50%濕度,所有動(dòng)物單籠喂養(yǎng)及飲水。

1.1.2主要試劑與儀器 黃芪甲苷、淫羊藿苷、葛根素、地拉羅司(deferasirox, DFX)購(gòu)自大連美侖(MB1955-1、MB2189、MB6183-1、MB1208-2),含量均≥97%;Prestained Protain MarkerⅡ(10-200KDA)、Anti-beta Actin Rabbit pAb(武漢賽維爾,G2058、GB11001);PageRulerTM預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(10-180 ku)(Thermo Fisher Scientific,26616);Blue Plus?V Protein Marker (10-190 ku)(北京全式金,DM141-01);辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG (H+L)(江蘇碧云天,A0208);SLC7A11/XCT Polyclonal Antibody19 Publications(武漢三鷹,26864-1-AP);4F2hc/CD98 Rabbit Polyclonal Antibody(江蘇碧云天,AF6444);Alexa Fluor?594標(biāo)記山羊抗兔IgG (H+L)(中杉金橋,ZF-0516);總RNA提取試劑盒(北京天根,DP419);PrimeScriptTMRT rengeat KIT with gDNA Eraser、TB GreenTMPremix EX TapTMⅡ(TaKaRa,RR407A、RR820A)。QuantStudio5熒光定量PCR儀(美國(guó)Thermo Fisher公司)、RM2255全自動(dòng)輪轉(zhuǎn)切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)、DM5000B型熒光顯微鏡(德國(guó)Leica公司)。

1.2 方法

1.2.1動(dòng)物分組及干預(yù) 6只8月齡雄性C57BL/6J小鼠為正常組,18只8月齡雄性APPswe/PS1dE9小鼠每組6只,隨機(jī)分為模型組、合劑組、DFX組。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給藥至10月齡,每日灌胃1次。正常組和模型組小鼠給予等量蒸餾水灌胃。合劑組根據(jù)徐叔云主編《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》以臨床3倍藥量給藥,以淫羊藿苷、黃芪甲苷、葛根素配制為淫黃葛合劑(淫羊藿苷、黃芪甲苷、葛根素給藥量為120 mg·kg-1、80 mg·kg-1、80 mg·kg-1)灌胃,DFX組以DFX灌胃,劑量為100 mg·kg-1。

1.2.2行為學(xué)測(cè)試 用藥結(jié)束后,采用八臂迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組小鼠空間、學(xué)習(xí)記憶能力。八臂迷宮是由一中央圓形平臺(tái)放射出的等分八臂式旱迷宮。八臂迷宮實(shí)驗(yàn)前對(duì)所有小鼠稱量體質(zhì)量并記錄,禁食24 h,此后在每天的八臂迷宮訓(xùn)練結(jié)束后限制性的給予正常飼料,使小鼠體質(zhì)量維持在正常進(jìn)食小鼠的75%～80%。實(shí)驗(yàn)為期7 d。d 1～3在迷宮各臂盡頭及中央?yún)^(qū)分撒適量正常飼料顆粒,同時(shí)將4只動(dòng)物置于迷宮中央?yún)^(qū),而后打開(kāi)各臂門(mén),讓所有小鼠自由攝食、探索10 min以適應(yīng)迷宮環(huán)境。d 4～5,取出中央?yún)^(qū)食物,在各臂盡頭分撒適量正常飼料顆粒,所有動(dòng)物進(jìn)行單獨(dú)訓(xùn)練,每天2次。d 6后,將八臂迷宮所有臂進(jìn)行編號(hào),隨機(jī)選取4個(gè)臂,在臂盡頭分撒適量正常飼料顆粒,關(guān)閉各臂門(mén)。每次將一只實(shí)驗(yàn)小鼠放置在迷宮中央?yún)^(qū),30 s后打開(kāi)所有臂門(mén),讓小鼠在迷宮中自由活動(dòng)并攝食,直至動(dòng)物吃完所有4個(gè)臂的食物。如果在10 min測(cè)試時(shí)間內(nèi)食物仍未吃凈,則實(shí)驗(yàn)終止,每只小鼠結(jié)束測(cè)試后,清除迷宮底部糞便與尿液,并用75%酒精擦拭整個(gè)迷宮及隔板,避免氣味干擾。待酒精全部揮發(fā)后進(jìn)行下一組小鼠實(shí)驗(yàn)。進(jìn)入放有食物臂視為正確,應(yīng)用SMART 3.0軟件記錄并分析所有動(dòng)物迷宮內(nèi)行動(dòng)軌跡、總正確次數(shù)、工作記憶錯(cuò)誤次數(shù)、參考記憶錯(cuò)誤次數(shù)。

1.2.3免疫熒光觀察海馬CA3區(qū)SLC7A11、SLC3A2的表達(dá) 行為學(xué)測(cè)試結(jié)束后,正常組、模型組各3只小鼠麻醉后4%多聚甲醛經(jīng)心臟灌注固定,石蠟包埋,切片。滴加1 ∶50稀釋后的相應(yīng)一抗,4 ℃濕盒內(nèi)過(guò)夜。將處理好的切片放入pH 7.4的PBS中充分漂洗,加入1 ∶300稀釋后的Alexa Fluor?594標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L),室溫下50 min后封片。每張切片選取3個(gè)視野進(jìn)行顯微圖像(100倍)采集,采用ImageJ觀察并分析海馬CA3區(qū)SLC7A11、SLC3A2表達(dá)與平均熒光強(qiáng)度。

1.2.4Western blot檢測(cè)海馬組織SLC7A11、SLC3A2的蛋白表達(dá)水平 各組3只小鼠麻醉后斷頭取腦,冰上迅速剝離海馬,-80 ℃冰箱凍存。提取蛋白,應(yīng)用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。每組蛋白上樣量為60 μg,以60 V,40 min,110 V,90 min電泳條件進(jìn)行電泳。轉(zhuǎn)移到0.45 μm的PVDF膜上后用5%脫脂奶粉進(jìn)行2 h封閉。Anti-beta Actin Rabbit pAb(1 ∶1 000)、SLC7A11/XCT Polyclonal Antibody19 Publications(1 ∶1 000);4F2hc/CD98 Rabbit Polyclonal Antibody(1 ∶1 000)4 ℃孵育過(guò)夜,TBST洗膜3次,室溫孵育二抗1.5 h,TBST洗膜3次發(fā)光。采用ImageJ軟件進(jìn)行光密度值測(cè)量分析。

1.2.5Real time q-PCR檢測(cè)海馬組織SLC7A11、SLC3A2的mRNA表達(dá)水平 海馬組織放入低溫組織研磨儀中研碎,總RNA提取試劑盒進(jìn)行RNA提取,超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度。按照PrimeScriptTMRT rengeat KIT with gDNA Eraser 取1 μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成,引物序列見(jiàn)Tab 1。以10倍梯度稀釋cDNA樣本,上下游各取0.8 μL引物,按照TB GreenTMPremix EX TapTMⅡ說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,反應(yīng)總體系為20 μL,目的基因表達(dá)相對(duì)數(shù)量用2-△△CT表示。

Tab 1 Primer sequence

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)Fig 1八臂迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與正常組相比,模型組小鼠總正確次數(shù)明顯減少(P<0.01),工作記憶錯(cuò)誤次數(shù)、參考記憶錯(cuò)誤次數(shù)明顯增加(P<0.01);與模型組相比,合劑組、DFX組總正確次數(shù)增加(P<0.01),工作記憶錯(cuò)誤次數(shù)、參考記憶錯(cuò)誤次數(shù)減少(P<0.01);合劑組、DFX組總正確次數(shù)、工作記憶錯(cuò)誤次數(shù)、參考記憶錯(cuò)誤次數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 免疫熒光如Fig 2所示,圖片為SLC7A11與SLC3A2蛋白(均為紅色熒光)與DAPI(藍(lán)色熒光)復(fù)染細(xì)胞核后合成得圖。與正常組相比,模型組小鼠海馬CA3區(qū)SLC7A11、SLC3A2表達(dá)降低,平均熒光強(qiáng)度下降(P<0.05)。

Fig 1 Eight-arm maze test results of mice in each group

Fig 2 Expression of SLC7A11 and SLC3A2 i n hippocampus of mice in normal and

2.3 Western blotFig 3結(jié)果顯示,與正常組相比,模型組小鼠海馬SLC7A11、SLC3A2表達(dá)降低(P<0.05);與模型組相比,合劑組和DFX組SLC7A11、SLC3A2表達(dá)均升高(P<0.05);合劑組與DFX組SLC7A11、SLC3A2表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4 Real time q-PCRFig 4結(jié)果顯示,與正常組相比,模型組小鼠海馬SLC7A11、SLC3A2mRNA表達(dá)降低(P<0.05);與模型組相比,合劑組和DFX組SLC7A11、SLC3A2mRNA表達(dá)升高(P<0.05);合劑組和DFX組SLC7A11、SLC3A2mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

Fig 3 Expression of SLC7A11 and SLC3A2

3 討論

AD發(fā)病受環(huán)境、遺傳以及個(gè)體因素差異影響,以空間、學(xué)習(xí)記憶能力喪失為主要臨床表現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)選用的APPswe /PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠存在早老素1( presenilin-1, PS1)基因E9缺失,是較為常用的AD轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型。APPswe /PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因模型小鼠來(lái)源于C57BL/6J小鼠,所以選取C57BL/6J小鼠為正常對(duì)照組[4]。

AD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。近年來(lái)的研究提示,SystemXc是AD的潛在治療靶點(diǎn)。SystemXc是由輕鏈亞基SLC7A11和重鏈亞基SLC3A2通過(guò)二硫鍵組成的異二聚體,在腦中高度表達(dá),生理功能為維持細(xì)胞內(nèi)外谷氨酸、胱氨酸的交換平衡。SLC7A11與SLC3A2表達(dá)降低時(shí)將導(dǎo)致谷氨酸過(guò)度積累與鐵死亡激活,加速AD發(fā)病[5]。SLC7A11與SLC3A2表達(dá)異常將導(dǎo)致的谷氨酸傳遞受阻,引起神經(jīng)元興奮障礙,最終影響學(xué)習(xí)與記憶功能。在細(xì)胞內(nèi)部,過(guò)量谷氨酸因轉(zhuǎn)出障礙逐漸累積,通過(guò)激活12-脂肪氧合酶和環(huán)鳥(niǎo)苷酸依賴的Ca2+通道、消耗胞內(nèi)的谷胱甘肽,導(dǎo)致能量代謝障礙以及促進(jìn)胞內(nèi)過(guò)氧化物積累導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[6-7];在細(xì)胞外部,由于突觸間的谷氨酸濃度降低,神經(jīng)沖動(dòng)無(wú)法正常傳導(dǎo),同時(shí)由于胱氨酸攝入抑制將放大胞外非SystemXc釋放的谷氨酸介導(dǎo)的神經(jīng)毒性,進(jìn)而引起神經(jīng)元功能障礙及退化,導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡[8],加重AD認(rèn)知損傷。另外,SLC7A11與SLC3A2也是鐵死亡的負(fù)調(diào)節(jié)基因,在AD中,SLC7A11與SLC3A2表達(dá)降低將激活鐵死亡過(guò)程,并由此抑制弗林蛋白,增強(qiáng)β-分泌酶活性,促進(jìn)淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein, APP)的淀粉樣代謝通路加速Aβ沉積,加重AD病情[9]。SLC7A11與SLC3A2表達(dá)降低也將抑制谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4(glutathione peroxidase 4, GPX4)的水平并進(jìn)一步加重神經(jīng)元損傷[10]。另外,Lane的最新研究提示,SLC7A11在AD患者血液中的表達(dá)水平不受年齡影響,且對(duì)AD有超高敏感性,是潛在的AD生物標(biāo)志物之一[5]。因此,SLC7A11與SLC3A2的表達(dá)水平一定程度上反映了AD進(jìn)程。本實(shí)驗(yàn)中八臂迷宮結(jié)果提示,與正常組小鼠相比,模型組小鼠總正確次數(shù)減少,參考記憶錯(cuò)誤次數(shù)、工作記憶錯(cuò)誤次數(shù)均增加,結(jié)合免疫熒光結(jié)果,模型組小鼠海馬CA3區(qū)SLC7A11與SLC3A2的表達(dá)降低,提示模型小鼠的認(rèn)知障礙可能與SLC7A11與SLC3A2的表達(dá)降低相關(guān)。

Fig 4 Expression of SLC7A11 SLC3A2 mRNA

AD屬中醫(yī)“癡呆”、“呆病”范疇,是以腎虛精虧,氣血不足為本;痰瘀互結(jié),濁毒內(nèi)生為標(biāo)的本虛標(biāo)實(shí)之證,治以補(bǔ)腎為主。淫羊藿、黃芪、葛根均是在中醫(yī)病機(jī)理論指導(dǎo)下臨床常用的AD治療藥物[11],實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前對(duì)淫羊藿、黃芪、葛根三藥進(jìn)行了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析與分子對(duì)接研究也發(fā)現(xiàn)三藥對(duì)AD有直接治療作用[12]。淫羊藿苷、黃芪甲苷、葛根素是中藥淫羊藿、黃芪、葛根的主要有效成分,3種單體組成合劑與傳統(tǒng)中藥合劑相比,有效成分更加清晰明確且易于質(zhì)控?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn),淫羊藿苷[13]、黃芪甲苷[14]、葛根素[15]從抑制氧化應(yīng)激、促進(jìn)神經(jīng)元再生、抑制微管相關(guān)蛋白(microtubule-associated protein tau, Tau)異常磷酸化等角度緩解AD發(fā)病。前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)也證實(shí),淫黃葛合劑可以緩解APPswe/PS1dE9小鼠皮層神經(jīng)元腫脹,減少皮質(zhì)老年斑的沉積,降低神經(jīng)元的損傷,且合劑效果要強(qiáng)于3藥有效成分單獨(dú)使用[16]。因此,為了進(jìn)一步明確淫黃葛合劑治療AD的機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)以SystemXc為切入點(diǎn),探討淫黃葛合劑對(duì)APPswe/PS1dE9小鼠的行為改善作用以及對(duì)海馬SLC7A11與SLC3A2的表達(dá)影響。DFX可以抑制Aβ沉積改善AD癥狀[17],促進(jìn)SystemXc表達(dá)[18],因此作為陽(yáng)性對(duì)照藥物。本實(shí)驗(yàn)中,與模型組相比,合劑組小鼠的行為障礙得到改善,海馬中SLC7A11與SLC3A2蛋白及mRNA表達(dá)均上升,說(shuō)明淫黃葛合劑可能通過(guò)促進(jìn)海馬SLC7A11、SLC3A2的表達(dá)改善模型小鼠的行為障礙。

綜上所述,本實(shí)驗(yàn)研究淫黃葛合劑對(duì)APPswe/PS1dE9小鼠行為及海馬SystemXc的影響,結(jié)果顯示,淫黃葛合劑可以改善APPswe/PS1dE9小鼠行為表現(xiàn),其機(jī)制與促進(jìn)海馬SLC7A11、SLC3A2的表達(dá)相關(guān)。該研究為AD的治療與用藥提供新的思路與方法。另外,對(duì)圍繞SLC7A11與SLC3A2發(fā)揮抗AD作用的上、下游分子機(jī)制的探討將是下一步的研究方向。