孔德鑫,張明亮,陳毓龍,李偉霞,,王曉艷,,吳婭麗,楊柳青,張 輝,陳小菲,李寒冰,吳宿慧,唐進法,

(河南中醫(yī)藥大學 1.藥學院、2.第一附屬醫(yī)院/河南省中藥臨床應用、評價與轉化工程研究中心/河南省中藥臨床藥學中醫(yī)藥重點實驗室,河南 鄭州 450000)

藥物重定位,也稱為“藥物再利用或藥物再循環(huán)”,是通過發(fā)現(xiàn)已批準上市藥物或潛在候選藥物中尋找新的適應癥的策略。與傳統(tǒng)的藥物開發(fā)模式相比,已上市的藥物建立了完善的工藝流程、成熟的藥代動力學,明確的不良反應、各期臨床數(shù)據(jù),從而大大減少了藥物的研發(fā)成本,并降低了藥物研發(fā)失敗的風險,故對已上市藥物進行重定位作為藥物開發(fā)的一種研發(fā)思路而備受關注[1]。如反應停(Thalidomide)曾用于妊娠反應,后發(fā)現(xiàn)對孕婦具有嚴重的致畸性而被禁用,經藥物重定位后,發(fā)現(xiàn)其對紅斑結節(jié)性麻風等多種疾病具有良好的治療效果。隨著高通量測序技術成本的降低和藥物研發(fā)相關數(shù)據(jù)的不斷積累,通過生物信息學技術尋找藥物的新適應證或新用途,進而揭示潛在的治療作用機制,成為藥物重定位新的研究熱點。目前已經有學者成功應用生物信息學技術對二甲雙胍進行重定位,發(fā)現(xiàn)其還可以通過抑制角質形成細胞中的活性氧(reactive oxygen species,ROS)產生,抑制MAPK信號通路,減輕炎癥反應來發(fā)揮治療紅斑痤瘡的作用[2]。提示我們可以把這種方法應用在更多正在臨床廣泛應用或因嚴重不良反應已經撤市的藥物重定位研究當中。

氧化苦參堿(oxymatrine,OMAT)具有四環(huán)喹嗪啶類結構的生物堿,是豆科植物苦參(SohoraflavescensAit.)和苦豆子(SophoraalopecuroidesL.)中的主要化學成分,已被臨床醫(yī)生成功應用慢性乙肝和癌癥的治療,具有良好的療效[3],但其他方面的應用較少,難以全面評價OMAT的藥理作用。本研究利用GEO數(shù)據(jù)庫篩選OMAT可調控人或動物的差異表達基因,通過Coexpedia數(shù)據(jù)庫和CMap數(shù)據(jù)庫對OMAT進行重定位,尋找OMAT潛在的臨床適應癥,采用動物實驗對重定位結果進行驗證,并進行作用機制探索,以期為今后OMAT的實驗研究及臨床應用提供新的實驗依據(jù)和方法借鑒。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器氧化苦參堿(A800927,Macklin公司);4%多聚甲醛(71040900,Biosharp生物科技公司);MOG35-55(MEVGWYRSPFRVVHLYRNGK,L2880,GenScript公司);百日咳毒素(#180,List Biological公司);弗氏不完全佐劑(#F5506,Sigma公司);結核分枝桿菌H37Ra(#231141,Difco公司);RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、2×SYBR Green qPCR Mix試劑均購自上海奕杉生物科技有限公司;引物(北京天一輝遠生物科技有限公司);生理鹽水(2112293201,石家莊四藥有限公司);QuantStudio 6 Flex熒光定量PCR儀(applied-biosystems公司)。

1.2 實驗動物SPF級C57BL/6雌性小鼠12只,8～10周齡,體質量18～20 g,購自北京斯貝福實驗動物技術有限公司,合格證號:SCXK(京)20190010,所有動物的飼養(yǎng)及實驗操作均符合實驗動物福利及倫理要求。

1.3 生物信息學研究

1.3.1差異表達基因(differentially expressed genes,DEGs)的篩選 基于GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/),以“oxymatrine”為關鍵詞檢索其調控的相關基因表達數(shù)據(jù)信息,應用GEO在線分析工具GEO2R進行分析,以P<0.05,∣Log2FC∣≥1.5[FC表示差異倍數(shù)(fold change)]為篩選條件,所篩選出的基因被視為OMAT可調控的DEGs。

1.3.2DEGs的共表達分析和MESH注釋 Coexpedia數(shù)據(jù)庫(https://www.coexpedia.org/)是一個基因共表達的數(shù)據(jù)庫,用于揭示基因共表達和醫(yī)學主題詞(Medical Subject Headings,MESH)之間的聯(lián)系。將OMAT調控的DEGs上傳至Coexpedia數(shù)據(jù)庫,篩選相關的醫(yī)學主題詞。

1.3.3獲取與OMAT基因表達譜相似的化合物 CMap數(shù)據(jù)庫是一個由Broad Institute(布羅德研究所)開發(fā),匯總不同的小分子化合物擾動不同類型細胞基因表達變化,從而聯(lián)立小分子藥物、基因表達相關的數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)庫(https://clue.io/)。將OMAT干預后的DEGs上傳到CMap數(shù)據(jù)庫,匹配與OMAT基因表達譜相似的化合物,匹配的化合物通過得分(+100,-100)反映匹配化合物與OMAT干預后基因表達譜的相似性,得分越高,說明該化合物的基因表達譜與OMAT干預后基因表達譜越相似。選取得分前十的化合物視為OMAT類似化合物,結合Drugbank數(shù)據(jù)庫(https://www.drugbank.ca/)和文獻檢索OMAT類似化合物的藥理作用,進行后續(xù)分析。

1.3.4OMAT重定位及代表性適應癥靶點的收集 結合MESH注釋結果與CMap 匹配化合物的藥理作用,對OMAT進行藥物重定位,選取其中最具代表性的適應癥進行后續(xù)研究,并基于GeneCards (https://www.genecards.org/)、DisGeNET (https://www.disgenet.org/)、OMIM(https://www.omim.org/)數(shù)據(jù)庫,檢索代表性適應癥的靶點。進而取其與OMAT調控DEGs的交集靶點,獲得OMAT調控代表性適應癥的潛在靶點。

1.3.5蛋白質相互作用(protein-protem interaction,PPI)網(wǎng)絡構建及核心靶點篩選 將整合后的交集靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫(https://cn.string-db.org/)分析,物種設定為“Homo Sapiens”并將結果通過 Cytoscape 3.9.0進行PPI網(wǎng)絡圖的構建,分析其網(wǎng)絡拓撲參數(shù),篩選出核心靶點。

1.3.6GO和KEGG富集分析 為進一步探究OMAT調控所選取的代表性適應癥的潛在作用機制等,將“1.3.4”篩選的OMAT調控代表性適應癥的潛在靶點上傳至DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)進行基因功能分類(gene ontology,GO)和信號通路富集(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)分析。GO分析包括細胞組成(cellular component,CC)、生物學過程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)。

1.4 動物實驗驗證

1.4.1造模和給藥 實驗自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)的發(fā)病機制、臨床表現(xiàn)與多發(fā)性硬化癥(multiple sclerosis,MS)相似,是國際通用的MS模型,故選用EAE動物模型進行驗證[4]。將12只小鼠分為2組:模型組(EAE組)、OMAT治療組(EAE+OMAT組),每組6只。取無菌MOG35-55用0.1 mol·L-1的PBS稀釋成2 g·L-1的溶液,與內含2 g·L-1滅活結核分枝桿菌的完全弗氏佐劑溶液按1 ∶1等體積混合,制成油包水乳液。50 mg·kg-1戊巴比妥溶液麻醉小鼠后,在其脊柱兩側分四點皮下注射0.2 mL抗原乳劑,并于免疫后d 0、d 2給每只小鼠腹腔注射200 ng百日咳毒素。EAE+OMAT組小鼠于免疫后d 10開始,每天1次灌胃20 mg·kg-1OMAT生理鹽水溶液;EAE組小鼠則同時給予等量生理鹽水溶液,均給藥至免疫后d 19。

1.4.2神經功能學評分 自免疫當日起,每日觀察并記錄小鼠的神經功能學評分[5]0分,無明顯癥狀;1分,尾部無力;2分,后肢無力;3分,后肢癱瘓;4分,前、后肢均癱瘓;5分,瀕死或死亡。若小鼠的神經功能表現(xiàn)介于兩個評分之間,以±0.5分計,評分≥1即視為發(fā)病,納入后續(xù)研究。

1.4.3組織病理檢查 實驗小鼠于免疫后第19天,用生理鹽水進行心臟灌流,取腦和脊髓,取出的脊髓組織液氮速凍后轉移至-80 ℃冰箱凍存,腦組織固定于4%多聚甲醛24 h后,經石蠟包埋、切片、脫水,進行蘇木精-伊紅(HE)染色和勒克司堅牢藍(LFB)染色以分別觀察腦組織炎癥浸潤與髓鞘脫失程度,并進行相關評分[6]。炎性浸潤評分標準:0分,無炎癥細胞;1分,少量分散的炎癥細胞;2分,血管周圍炎癥細胞浸潤,呈袖套樣;3分,大量血管袖套樣病變。髓鞘脫失評分標準:0分,無髓鞘脫失;1分,罕見髓鞘脫失;2分,少量部位脫髓鞘;3分,大面積脫髓鞘。

1.4.4RT-PCR檢測驗證OMAT調控MS的核心靶點 將脊髓組織按照總RNA提取試劑盒說明提取總RNA,合成cDNA。以cDNA做模板,按2×SYBR Green qPCR Mix試劑說明,加入引物進行擴增(引物序列見Tab 1)。采用△△CT法分析CT值,以2-ΔΔCT表示各組基因的相對表達量。

Tab 1 Primers of PCR products of genes

2 結果

2.1 OMAT干預后的DEGs分析結果基于GEO數(shù)據(jù)庫篩選得編號為GSE85871的OMAT調控MCF7 細胞的基因表達數(shù)據(jù)集,采用GEO中的在線分析工具GEO2R進行分析,篩選得到DEGs共619個,其中明顯下調的DEGs有274個;明顯上調的DEGs有345個,據(jù)所篩選出的DEGs作火山圖,見Fig 1。

Fig 1 Volcano plot of DEGs

2.2 OMAT干預后DEGs的共表達結果通過Coexpedia查詢OMAT干預后的DEGs的共表達網(wǎng)絡和MESH注釋結果。MESH注釋得到243個條目,Score代表各基因之間共表達關系大小。篩選Score前10的疾病主題詞,見Tab 2,因OMAT臨床已經用于多種癌癥和肝炎,故腫瘤和肝炎相關主題詞不納入后續(xù)研究。主要包括呼吸系統(tǒng)疾病(希佩爾-林道綜合癥、哮喘)、炎癥相關疾病(關節(jié)炎、腸炎)和自身免疫性疾病(系統(tǒng)性紅斑狼瘡、MS)。

Tab 2 Analysis of annotations in co-expression networks

2.3 CMap匹配結果和藥物重定位以GSE85871相同的細胞MCF7為對象,匹配得到2 398個與OMAT具有一定相似性的小分子化合物。選取得分前十的化合物視為OMAT類似化合物,見Tab 3,并結合Drugbank數(shù)據(jù)庫(https://www.drugbank.ca/)和文獻檢索OMAT類似化合物的藥理作用,發(fā)現(xiàn)OMAT類似化合物的藥理作用主要涉及心血管、神經、免疫等多個系統(tǒng),包括MS、肝炎、關節(jié)炎、心血管疾病、腫瘤等多種疾病。

綜合分析DEGs注釋得到的疾病主題詞和OMAT類似化合物所對應的適應癥,發(fā)現(xiàn)均聚焦到MS、哮喘、關節(jié)炎等疾病,推測OMAT可能具有這些疾病的潛在治療作用。而在OMAT類似化合物中,具有治療MS藥理作用的化合物出現(xiàn)頻次最高。因此,以MS為例進行后續(xù)研究。

Tab 3 Top 10 molecule compounds with high similarity to OMAT gene expression profiles

Fig 2 Analysis of interaction between OMAT and MS

2.4 OMAT治療MS交集靶點篩選以“Multiple Sclerosis”,“Relapsing-remitting Multiple Sclerosis”,“Progressive Multiple Sclerosis”為關鍵詞在GeneCards、OMIM、DisgeNet數(shù)據(jù)庫中收集MS相關靶點,Genecards數(shù)據(jù)庫共收集到144 423個相關靶點,選“Relevance score”前1 000的靶點進行研究,而DisgeNet數(shù)據(jù)庫中“Gda score”越高與疾病相關性越強,選擇Gda score>0.1的靶點進行研究。共得到MS相關靶點1 267個,與OMAT調控的DEGs取交集,得到54個潛在的OMAT調控MS的基因靶點,見Fig 2A。

2.5 OMAT治療MS交集靶點的PPI網(wǎng)絡在STRING數(shù)據(jù)庫對交集的靶點進行蛋白互作分析,利用Cytoscape 3.9.0構建PPI網(wǎng)絡圖,見Fig 2 B。對網(wǎng)絡進行分析,選取Degree值≥13(中位值)的靶點作為核心靶點,依次為FGF2、IL4、ICAM1、CD86、CCL4、LEP、IL2RA。這些靶點涉及炎癥反應和中樞神經系統(tǒng)等方面,提示,OMAT可能通過作用這些靶點來發(fā)揮治療MS的作用機制。

2.6 OMAT治療MS交集靶點富集分析結果GO分析結果表明,BP主要涉及ERK1和ERK2的調節(jié)、免疫應答、細胞凋亡等;CC主要涉及質膜、細胞質等;MF主要涉及蛋白質結合、細胞因子活性等,結果見Fig 3。KEGG信號通路富集結果表明,交集靶點主要富集到JAK-STAT、鈣離子、Ras等多條信號傳導通路,結果見Fig 4。推測OMAT治療MS的作用可能與以上功能過程和信號傳導通路相關。

Fig 3 Results of gene function GO enrichment analysis

Fig 4 Results of gene function KEGG enrichment analysis

2.7 動物實驗驗證

2.7.1OMAT對EAE小鼠神經功能評分的影響 EAE組小鼠于d 9相繼開始發(fā)病,d 11起出現(xiàn)明顯的發(fā)病癥狀,在d 19達到峰值。OMAT+EAE組小鼠于d 10相繼開始發(fā)病,d 14起出現(xiàn)明顯的發(fā)病癥狀。相比EAE組小鼠,EAE+OMAT組小鼠平均神經功能學評分明顯降低(P<0.01),見Fig 5。

2.7.2OMAT對EAE小鼠病理組織的影響 與EAE組小鼠比較,EAE+OMAT組小鼠腦組織炎癥浸潤程度明顯減輕(P<0.01);髓鞘脫失評分結果表明,EAE+OMAT組小鼠比EAE組小鼠腦中髓鞘脫失程度明顯減輕(P<0.01),見Fig 6。

2.7.3OMAT對EAE小鼠脊髓中mRNA表達的影響 與EAE組小鼠相比,EAE+OMAT組小鼠脊髓的Fgfr2、Rras2、Raf1、Camk2a、Calm1的mRNA表達水平明顯降低(所有P<0.05),Fgf2的mRNA表達水平明顯升高(P<0.05),見Fig 7。

Fig 6 HE (A) and LFB staining (B) in mouse brain

3 討論

與傳統(tǒng)的藥物研發(fā)策略相比,基于已上市藥物的重定位不僅可以減少研發(fā)成本、節(jié)省研究周期,并能夠擴大藥物的應用范圍,因此通過重定位擴大藥物的應用范圍備受關注[1]。OMAT作為臨床上廣泛應用于肝炎和癌癥的天然生物堿,具有價格適宜、不良反應少的優(yōu)點[3]。本研究利用藥物重定位策略,發(fā)現(xiàn) OMAT 具有潛在治療MS、關節(jié)炎等疾病的藥理作用,并以MS為例進行后續(xù)研究。

Fig 7 The mRNA levels of target genes in spinal cord tissues of mice in each

在分析CMap數(shù)據(jù)庫中篩選得到的與OMAT基因表達譜相似的小分子化合物中,糖皮質激素類化合物(hydrocortisone)可以通過抗炎和免疫抑制的作用治療MS等自身免疫性炎癥性疾病;作用于中樞作用的化合物(LY-341495、acetylcholine、U-74389F、JWH-015)可以通過調控中樞神經的信號傳遞,從而改善MS引起的中樞神經損傷[7-9]。抗炎類化合物(mefenamic-acid、quercetagetin)通過調節(jié)免疫,抑制關節(jié)炎的炎癥反應,并對EAE小鼠具有神經保護作用[10]。抗血栓形成類化合物(rivaroxaban)通過抑制XA因子,抑制血栓形成,對于心血管疾病具有預防作用[11]。根據(jù)上述這些與OMAT基因表達譜相似的小分子的藥理作用及適應癥,推測OMAT除了用于肝炎和癌癥的治療外,還有望對MS和關節(jié)炎起到一定治療的作用。本研究發(fā)現(xiàn)相似性得分前10的小分子化合物中有8種小分子均具有調控MS的作用。因此,選擇MS代表性的適應癥進行后續(xù)研究。MS是一種以免疫細胞浸潤、髓鞘脫失為主要病理特征的中樞神經系統(tǒng)自身免疫性疾病,具有易復發(fā)和致殘率高的特點[12]。本研究采用國際公認的MS動物模型 (EAE)來驗證OMAT是否對MS具有治療作用,結果發(fā)現(xiàn)OMAT明顯減輕了EAE小鼠發(fā)病程度,且中樞神經系統(tǒng)炎癥細胞浸潤、髓鞘脫失程度明顯減輕,證實了基于藥物重定位策略尋找OMAT的新適應癥具有一定的可行性。

研究表明,ICAM1可以參與T淋巴細胞與血腦屏障的血管內皮細胞結合,介導T淋巴細胞轉入中樞神經,從而加重MS的免疫浸潤[13]。IL4可以調節(jié)中樞神經中免疫細胞的分化,促進免疫調節(jié)因子的分泌,參與免疫調節(jié)的過程,從而改善MS患者的發(fā)病情況[14]。而Fgf2是成纖維細胞生長因子家族的重要一員,在脫髓鞘和再髓鞘化過程中具有重要作用。一方面,Fgf2可以促進少突膠質前體細胞的增殖和分化,促進髓鞘的形成過程,且敲除Fgf2的EAE小鼠脊髓的神經纖維變性和軸突丟失程度明顯增加,再髓鞘化軸突的數(shù)量明顯減少。但另一方面,Fgf2可以通過與受體Fgfr2相互作用,激活Wnt信號通路來干擾髓鞘形成,但阻斷Wnt信號通路后則完全消除了Fgf2對髓鞘形成的抑制作用[15]。提示我們Fgf2可能對髓鞘再生過程中具有雙向調節(jié)作用。而在PPI分析中也同樣篩選出了Fgf2、IL4、ICAM1等核心靶點。且動物實驗也證實了OMAT 確可明顯下調Fgfr2的表達,并明顯上調Fgf2表達。對于OMAT 對ICAM1與IL4的調節(jié)作用,焦霞等[16]研究發(fā)現(xiàn),OMAT可通過下調ICAM1的表達,上調IL4的表達,從而減輕哮喘小鼠的發(fā)病程度總結以上研究可知,OMAT可能通過調控Fgf2、IL4、ICAM1、Fgfr2等靶點發(fā)揮治療MS的作用。

KEGG通路富集結果顯示,OMAT治療MS的核心通路主要涉及Ras信號通路和鈣離子信號通路等。Ras信號通路參與細胞的增殖、分化、炎癥反應及凋亡等生理過程,是自身免疫病中炎癥反應的重要通路,Ras蛋白在Ras通路起信號開關作用,當Ras蛋白激活后,將Raf1蛋白募集到細胞上使其磷酸化,進而調控下游ERK通路,刺激免疫細胞釋放多種炎性因子,從而參與MS的自身免疫反應[17]。鈣離子信號通路在神經元細胞間神經遞質的傳遞、細胞凋亡等過程起到重要作用,當神經膠質細胞在受到刺激后,釋放過量的興奮性氨基酸,造成興奮性氨基酸在髓鞘中過度堆積,從而激活鈣離子信號通路中的CALM1和CAMK2a靶點,促使Ca2+大量內流,細胞內Ca2+濃度超載,導致細胞損傷,最終導致中樞神經的損傷[18]。本研究證實,OMAT確可明顯下調Ras信號通路的關鍵靶點Rras2、Raf1和鈣離子信號通路的關鍵靶點Camk2a、Calm1的表達,提示OMAT可能通過調控Ras和鈣離子信號通路的關鍵靶點發(fā)揮治療MS的作用。

綜上所述,本研究通過生物信息學探討了一種對OMAT的藥理作用進行重定位的方法,結合動物實驗分析OMAT可能為治療MS的潛在藥物,并分析OMAT可能的作用靶點及通路,該研究將有助于充實OMAT治療MS的相關研究,為OMAT的臨床應用提供更多實驗依據(jù)。