陳瑞娟,鄭永先,湯 旺,關(guān)小容

(1. 中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬海口醫(yī)院,海南 ?？?570208;2. 中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科,湖南 長(zhǎng)沙 410000)

腦出血(intracerebral hemorrhage, ICH)是一種常見(jiàn)的嚴(yán)重腦血管疾病,約占所有中風(fēng)的15%～20%,ICH是一種死亡率和發(fā)病率很高的疾病[1]。當(dāng)ICH患者腦血管突然破裂后,血腫的形成和鄰近組織的機(jī)械損傷會(huì)導(dǎo)致顱內(nèi)壓急劇升高,該損傷被認(rèn)為是腦原發(fā)性損傷[2]。臨床上針對(duì)ICH后原發(fā)性腦損傷進(jìn)行手術(shù)切除血腫很少會(huì)影響患者神經(jīng)功能恢復(fù)[3],但紅細(xì)胞碎片和血液成分會(huì)引發(fā)ICH后繼發(fā)性腦損傷,導(dǎo)致炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、神經(jīng)元凋亡、線粒體功能障礙和血腦屏障(blood brain barrier,BBB)破壞,進(jìn)而嚴(yán)重影響患者神經(jīng)功能[4]。近幾十年來(lái),大多數(shù)實(shí)驗(yàn)研究都集中在ICH繼發(fā)性損傷的機(jī)制上,以尋找新的ICH治療靶點(diǎn)[5]。在許多研究中都觀察到了ICH發(fā)生過(guò)程中伴隨著神經(jīng)細(xì)胞凋亡[6],同時(shí)研究也證實(shí)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡是ICH的細(xì)胞基礎(chǔ),也可能是ICH治療或控制的新靶點(diǎn)。近年來(lái)研究認(rèn)為氧化應(yīng)激產(chǎn)生的大量活性氧(reactive oxygen species,ROS)和炎癥反應(yīng)產(chǎn)生的炎癥因子與ICH密切相關(guān),可誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡[7]。

AMP激活蛋白激酶(AMPK)信號(hào)是線粒體分裂的調(diào)節(jié)因子之一。在能量缺乏的狀態(tài)下,AMPK的激活導(dǎo)致動(dòng)力蛋白相關(guān)蛋白1(Drp1)在線粒體的定位增加,并進(jìn)一步誘導(dǎo)線粒體分裂[8],由于AMPK在調(diào)節(jié)生長(zhǎng)和代謝重編程中起著關(guān)鍵作用,它是能量穩(wěn)態(tài)的中樞調(diào)節(jié)器[9]。已有研究表明,AMPK與線粒體功能有著密切的聯(lián)系,并影響著細(xì)胞凋亡[10]。更重要的是,AMPK介導(dǎo)的信號(hào)通路在各種心血管疾病中都有參與,并且作為介導(dǎo)神經(jīng)元凋亡的重要角色被人們廣泛關(guān)注[11]。

紅景天苷(salidroside,Sal)治療的神經(jīng)系統(tǒng)疾病有很多,如神經(jīng)系統(tǒng)障礙、短暫性大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)模型和全腦缺血/再灌注(I/R)損傷,Sal已被證實(shí)具有抑制細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用[12-13]。然而Sal是否能改善ICH后的神經(jīng)損傷,甚至保護(hù)ICH中某些病理因素引起的損傷,目前尚不清楚。醒腦靜具有醒腦開竅通絡(luò)的作用,其主要成分包括梔子、冰片、郁金、麝香,已有研究證實(shí)醒腦靜對(duì)急性ICH神經(jīng)損傷有一定的治療作用,因此我們選其作為陽(yáng)性治療藥物。本研究擬通過(guò)構(gòu)建大鼠急性ICH神經(jīng)損傷模型,觀察Sal對(duì)急性ICH大鼠的神經(jīng)功能影響及可能的作用機(jī)制,以期為Sal在急性ICH神經(jīng)損傷治療中提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1動(dòng)物 成年雄性SD大鼠共60只購(gòu)自湘雅醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(動(dòng)物許可證號(hào):44007200065141)。飼養(yǎng)環(huán)境:室溫25 ℃左右,相對(duì)濕度50%～60%,飼料由海南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物可自由飲水?dāng)z食。本項(xiàng)目動(dòng)物相關(guān)實(shí)驗(yàn)均遵循動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理要求。

1.1.2藥物與試劑 Sal購(gòu)自南京道斯夫(批號(hào):110818,規(guī)格:20 mg,HPLC≥99%);AICAR購(gòu)自美國(guó)MCE公司(規(guī)格:0.5 mg·g-1)醒腦靜注射液購(gòu)自無(wú)錫濟(jì)民可信山河藥業(yè)公司(批號(hào)151107,10 mL/支);IL-6、TNF-α、IL-1β ELISA試劑盒均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司;BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)自大連美侖生物科技有限公司;MitoSOX Red試劑盒購(gòu)自南京建成生物技術(shù)有限公司;GAPDH一抗(CRISPRPL01)、HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(M5774)、山羊抗兔IgG(HPA008791)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;Bcl-2(15071S)、Bax(41162S)、cleaved caspase-3(9661S)、AMPK(9158S)、Drp1(8570S)抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。

1.1.3實(shí)驗(yàn)儀器 多功能酶標(biāo)儀(德國(guó)Leica公司);凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司);電泳設(shè)備(美國(guó)Beckma公司);電子分析天平(上海勤翔科技有限公司);麻醉機(jī)(上海勤翔科技有限公司);SC-2546 低溫高速離心機(jī)(美國(guó)Thermo Fisher公司);倒置熒光顯微鏡(日本奧林巴斯Olympus有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1急性ICH神經(jīng)損傷大鼠模型構(gòu)建和實(shí)驗(yàn)分組 參考改良 Rosenberg 法構(gòu)建大鼠急性ICH模型[14]。大鼠麻醉前禁食12 h,腹腔注射3%戊巴比妥鈉(30 mg·kg-1)進(jìn)行麻醉,眼球取血40 μL以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將大鼠的頭部進(jìn)行固定,使用手術(shù)刀沿大鼠頭部中線縱向切開皮膚,取前囟點(diǎn)右側(cè)中線旁開3 mm、后1 mm處,而后使用鉆頭開一個(gè)0.5 mm小孔,使用微量注射儀將自體血注入大鼠尾狀核部位,注射完畢后進(jìn)行縫合。選取造模成功大鼠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將大鼠按照隨機(jī)原則分為假手術(shù)組(Sham)、模型組(Model)、Sal低、中、高(50、100、200 mg·kg-1)、AMPK激動(dòng)劑組(AICAR),陽(yáng)性藥組(醒腦靜注射液),每組各10只。于造模結(jié)束1 h后腹腔注射各劑量Sal,連續(xù)1周,AMPK激動(dòng)劑組腹腔注射AICAR(200 mg·kg-1),陽(yáng)性藥組尾靜脈注射醒腦靜注射液(10 mg·kg-1)。

1.2.2大鼠神經(jīng)功能評(píng)分 Garcia試驗(yàn)用于評(píng)價(jià)造模和各組大鼠神經(jīng)功能缺損。Garcia評(píng)分法分?jǐn)?shù)區(qū)間為3-18分,動(dòng)物的神經(jīng)行為學(xué)狀況和分?jǐn)?shù)呈正相關(guān)。由兩位研究者參與實(shí)驗(yàn),采用雙盲法對(duì)各組小鼠進(jìn)行評(píng)分和記錄,評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)Tab 1。

1.2.3大鼠腦含水量檢測(cè) 造模結(jié)束后處死大鼠,迅速切除大腦,然后分離左右腦半球和小腦半球。將大腦的不同部分快速稱量(濕重),然后放入烤箱中,在100 ℃下烘烤24 h,再稱量(干重)。含水量的計(jì)算公式為:(濕重-干重)/濕重×100%。

Tab 1 Neurological function score scale

1.2.4MitoSOX Red檢測(cè)ROS水平 使用MitoSOX Red Kit (Invitrogen, USA)測(cè)量線粒體超氧化物的產(chǎn)生。按照試劑盒的步驟,首先將腦組織的線粒體分離出來(lái),20 μg線粒體在50 μL呼吸緩沖液中裝入96孔板。100 μL冰冷呼吸緩沖液中加入2 μL MitoSOX、5 μL antiycin A和4 μL ADP。在裝入Microplate Reader之前,在指定的孔中加入50 μmol·L-1salermide或1 μmol·L-1FeTCCP。在355 nm和590 nm處測(cè)量熒光強(qiáng)度的基礎(chǔ)水平,每隔5 min測(cè)量熒光強(qiáng)度。

1.2.5腦組織中ATP含量檢測(cè) 使用ATP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)腦組織中ATP含量的變化,首先向組織中加入約100～200 μL的裂解液,然后使用玻璃勻漿漏斗進(jìn)行勻漿。裂解結(jié)束后使用低溫離心機(jī) 4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min,離心結(jié)束后棄沉淀取上清液,按ATP含量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明配制ATP檢測(cè)工作液,加100 μL的ATP檢測(cè)工作液到待測(cè)孔板中,再加上20 μL不同組的上清液,最后使用化學(xué)發(fā)光儀(Luminometer)測(cè)定RLU值。

1.2.6腦組織中IL-6、TNF-α、IL-1β檢測(cè) 造模結(jié)束后,將大鼠斷頭處死,無(wú)菌操作取出大鼠的腦組織,使用預(yù)冷的PBS沖洗除去殘余血液,在冰上使用濾紙拭去殘留的PBS,然后將腦組織放置于液氮罐中保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)時(shí)取組織塊準(zhǔn)確稱其質(zhì)量,使用眼科手術(shù)剪快速剪碎組織塊,按比例加入預(yù)冷的PBS,隨后將剪碎的組織放置于組織勻漿器充分勻漿,12 000 r·min-1離心10 min,離心結(jié)束后取上清,按試劑盒說(shuō)明步驟進(jìn)行相關(guān)炎癥因子水平檢測(cè)。

1.2.7TUNEL染色檢測(cè)腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡 從液氮罐中取出大鼠腦組織,使用多聚甲醛固定液進(jìn)行固定,冰凍切片,將切片依次浸泡于二甲苯、無(wú)水乙醇、不同濃度梯度的乙醇中各5 min,PBS洗滌3次。加入蛋白酶K 溶液50 μL,置于37 ℃孵育30 min,PBS沖洗3次;滴加檸檬酸三鈉50 μL,室溫孵育4 min,PBS沖洗3 次;按照TUNEL試劑盒染色步驟進(jìn)行染色,滴加TUNEL反應(yīng)液37 ℃避光孵育60 min,PBS沖洗3次;加入POD轉(zhuǎn)換液,置于37 ℃孵育30 min,PBS沖洗3次,DAB顯色試劑盒顯色,PBS沖洗3次;放入蘇木精溶液中復(fù)染60 s,流水沖洗掉多余染液;放入1%鹽酸酒精溶液中進(jìn)行分化,分化結(jié)束后再次流水沖洗;封片。結(jié)束后使用倒置熒光顯微鏡觀察拍照。

1.2.8Western blot檢測(cè)Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、AMPK、Drp1蛋白表達(dá)水平 BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒檢測(cè)總蛋白濃度。通過(guò)15%SDS-PAGE分離蛋白質(zhì),并在200 mA和1 h條件下,將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜。將膜在含有5%脫脂奶粉的TBST溶液中于室溫封閉1 h左右。將膜與Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、AMPK、Drp1抗體在4 ℃孵育過(guò)夜。用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次,每次10 min,在室溫下與山羊抗兔IgG一起孵育1 h。β-actin用作內(nèi)參。最后,用ChemiQ4600min化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)成像,ImageJ測(cè)定蛋白條帶的灰度值。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與Sham組相比,Model組大鼠的神經(jīng)系統(tǒng)評(píng)分明顯降低,出現(xiàn)明顯腦水腫,神經(jīng)功能下降;與Model組相比,Sal各劑量組、陽(yáng)性藥組和AICAR組大鼠的神經(jīng)系統(tǒng)評(píng)分明顯升高,腦水腫情況減輕,神經(jīng)功能得到保護(hù)(Tab 2)。

2.2 各組大鼠腦組織ROS水平檢測(cè)情況與Sham組相比,Model組大鼠的腦組織ROS水平明顯升高(P<0.05);與Model組相比,Sal各劑量組、陽(yáng)性藥組和AICAR組大鼠的腦組織ROS水平明顯降低(P<0.05)(Fig 1)。

Tab 2 Neurological function scores of rats

Fig 1 Brain water content of rats in each

2.3 各組大鼠腦組織中ATP含量檢測(cè)情況與Sham組相比,Model組大鼠的腦組織ATP含量明顯降低(P<0.05);與Model組相比,Sal各劑量組、陽(yáng)性藥組和AICAR組大鼠的腦組織ATP含量明顯升高(P<0.05)(Fig 2)。

Fig 2 Comparison of ROS levels in brain tissue of rats

2.4 ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)IL-6、TNF-α、IL-1β水平與Sham組相比,Model組大鼠的腦組織IL-6、TNF-α、IL-1β水平明顯升高;與Model組相比,Sal各劑量組、陽(yáng)性藥組和AICAR組大鼠的腦組織IL-6、TNF-α、IL-1β水平明顯降低(Fig 3)。

Fig 3 Comparison of ATP levels in brain tissue of rats

2.5 TUNEL染色檢測(cè)各組神經(jīng)細(xì)胞凋亡結(jié)果與Sham組相比,Model組大鼠的腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡明顯增多(P<0.01);與Model組相比,Sal各劑量組和AICAR組大鼠的腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡明顯減少(Fig 4)。

Fig 4 Comparison of IL-6, TNF-α and IL-1β levels

2.6 各組大鼠腦組織內(nèi)相關(guān)蛋白表達(dá)變化與Sham組相比,Model組Bcl-2、p-AMPK/AMPK表達(dá)明顯下調(diào),Bax、cleaved caspase-3、p-Drp1/Drp1蛋白表達(dá)明顯上調(diào);與Model組相比,Sal各劑量治療組、陽(yáng)性藥組和AICAR組Bcl-2、p-AMPK/AMPK蛋白表達(dá)明顯上調(diào),Bax、cleaved caspase-3、p-Drp1/Drp1蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(Fig 5)。

Fig 5 Comparison of neural cell apoptosis in brain tissue

3 討論

繼發(fā)性腦損傷主要是由于炎癥引起,可加重血腫附近的腦水腫。ICH后的腦水腫可導(dǎo)致不良后果,如嚴(yán)重的神經(jīng)功能缺損、疝出,甚至死亡[15]。機(jī)體在清除血腫過(guò)程中會(huì)激活小膠質(zhì)細(xì)胞,然而過(guò)度激活也會(huì)釋放炎癥因子、趨化因子、蛋白酶、ROS、血紅素加氧酶等多種毒性因子,對(duì)腦組織產(chǎn)生神經(jīng)毒性[16]。已有研究表明,在ICH發(fā)生過(guò)程中有過(guò)量的ROS產(chǎn)生[17],過(guò)量的ROS會(huì)破壞細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡進(jìn)而造成神經(jīng)細(xì)胞損傷,同時(shí)ROS的過(guò)量產(chǎn)生會(huì)導(dǎo)致NLRP3炎癥小體大量激活,特別是mtROS的產(chǎn)生,反過(guò)來(lái)大量的NLRP3激活又會(huì)增加mtROS水平,進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

Fig 6 Comparison of related protein expression in brain

Drp1通過(guò)調(diào)控多種下游蛋白改變線粒體膜極化從而調(diào)節(jié)mtROS水平,進(jìn)而對(duì)線粒體內(nèi)穩(wěn)態(tài)和NLRP3炎癥小體激活產(chǎn)生顯著影響[17]。同時(shí)也有研究證實(shí),AMPK活化有抑制Drp1的作用。在ICH期間,皮質(zhì)神經(jīng)元中p-AMPK的表達(dá)以時(shí)間依賴性的方式減少,結(jié)合AMPK與Drp1的相互作用,表明Drp1可能是ICH后的關(guān)鍵抗氧化因子。作為調(diào)控細(xì)胞凋亡的經(jīng)典信號(hào)通路,Bcl-2/Bax/cleaved caspase-3凋亡信號(hào)通路也與包括神經(jīng)系統(tǒng)疾病在內(nèi)的許多疾病有關(guān),同時(shí)研究表明Bcl-2/Bax蛋白在線粒體功能障礙介導(dǎo)的凋亡通路中均起到了重要作用。

在本次研究中,我們選用了Sal作為治療藥物,Sal提取于紅景天,紅景天是景天科植物,具有廣泛的藥理作用。首先我們通過(guò)神經(jīng)系統(tǒng)評(píng)分和腦水腫檢測(cè)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了Sal具有明顯改善神經(jīng)功能的作用,ICH發(fā)生后我們使用Sal進(jìn)行治療,實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)大鼠腦水腫和神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況明顯減輕,隨后我們對(duì)Sal的作用機(jī)制進(jìn)行了進(jìn)一步探究。我們通過(guò)MitoSOX Red和ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了大鼠腦組織內(nèi)的ROS水平和相關(guān)炎癥因子指標(biāo),實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)ICH發(fā)生后腦組織內(nèi)ROS和IL-6、TNF-α、IL-1β水平顯著增高,但我們使用Sal治療后,能夠明顯逆轉(zhuǎn)ICH造成的氧化損傷和炎癥損傷以及ATP含量減少,TUNEL染色結(jié)果也顯示Sal能夠有效的抑制ICH導(dǎo)致的大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡。隨后我們發(fā)現(xiàn)ICH發(fā)生后大鼠神經(jīng)細(xì)胞中的Bax、cleaved caspase-3、p-Drp1/Drp1高表達(dá)和Bcl-2、p-AMPK的低表達(dá),Sal治療后可以逆轉(zhuǎn)。AMPK是調(diào)控能量穩(wěn)態(tài)的重要激酶,在抗氧化應(yīng)激中發(fā)揮了抗凋亡的作用。在抑制Drp1活化后,可以減少或ROS水平的變化,并減少線粒體不正常分裂,防止線粒體損傷。在本研究中,ICH后24 h左右,p-Drp1蛋白表達(dá)明顯下調(diào),而Sal處理顯著降低了p-Drp1/Drp1蛋白表達(dá)水平,并對(duì)氧化損傷和炎癥因子釋放具有抑制作用。

綜上所述,Sal能夠有效保護(hù)急性ICH大鼠導(dǎo)致的神經(jīng)功能損傷,其作用機(jī)制可能與調(diào)控AMPK/Drp1信號(hào)通路有關(guān),本研究為急性ICH神經(jīng)功能損傷早期臨床治療提供了理論依據(jù)。