陳漢鑫　林藝輝　馬馨怡　林秀芳　黃婉莉

關(guān)鍵詞：珍珠蘆薈；白化苗；轉(zhuǎn)錄組；光合作用；基因表達(dá)

中圖分類號：Q943.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

植物葉色白化是植物葉色突變的常見類型，在植物界普遍存在，目前已在擬南芥（Arabidopsisthaliana）、玉米（ Zea mays） 、荔枝（ Litchichinensis）、大麥（Hordeum vulgare）、水稻（Oryzasativa）、蘭花（Cymbidium ssp.）等眾多植物中發(fā)現(xiàn)葉片白化現(xiàn)象[1-7]。葉色白化產(chǎn)生的內(nèi)在原因主要與葉綠素含量降低，光合過程受阻，葉綠體發(fā)育異常有關(guān)[8-12]。就植株本身而言，導(dǎo)致葉片白化的機(jī)制極其復(fù)雜，主要涉及激素失調(diào)、葉綠體形成基因突變、葉綠素合成基因突變等多種過程[1， 4]。植物葉片白化通常會(huì)導(dǎo)致植株光合作用受阻而影響植物的生長和發(fā)育，已被廣泛應(yīng)用到理論基礎(chǔ)研究和生產(chǎn)實(shí)踐中。如葉色突變植物是研究植物光合過程中葉綠體發(fā)育分化、葉綠素合成與降解、質(zhì)核基因互作等調(diào)控機(jī)制的理想材料。在生產(chǎn)中，某些植物的葉片白化會(huì)帶來更大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和觀賞價(jià)值。安吉白茶因其葉片白化導(dǎo)致其氨基酸含量比普通綠茶高3～4 倍，多酚含量低于普通綠茶，提高了其營養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。在園林及觀賞花卉植物中，特殊的葉色既豐富了園林景觀的色彩，也大大提高了其觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。例如，禾本科植物竹子的自然突變體菲白竹、銀絲竹，十二卷屬植物黑肌玉露（Haworthia cooperivar. pilifera M. B. Bayer）的白化突變體“拉絲錦”（又名“霓虹燈”）等植物[13-14]。

蘆薈是百合科蘆薈屬多年生常綠肉質(zhì)草本植物，品種繁多，有超過500 個(gè)品種，具有藥用和觀賞價(jià)值[15-18]。珍珠蘆薈（Aristaloe aristata）也稱為木銼蘆薈，屬于蘆薈的小型種，葉多而短，株型緊湊，主要供觀賞用。珍珠蘆薈葉片中含有蘆薈大黃素、蘆薈寧，葉肉含粘膠質(zhì)豐富的多聚糖，是保健和美容護(hù)膚的佳品[19]。

珍珠蘆薈白化苗，因人工繁殖的難度比較高，且葉片顏色各異，極具觀賞性，在市場上比較稀有，價(jià)格比普通品種更高。鑒于珍珠蘆薈白化苗存在重要的觀賞價(jià)值及經(jīng)濟(jì)價(jià)值，為探明珍珠蘆薈苗白化突變分子機(jī)制，本研究以組織培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的珍珠蘆薈白化苗突變株和正常葉色苗的葉片為研究對象，在驗(yàn)證其葉綠素及類胡蘿卜素含量差異基礎(chǔ)上，利用轉(zhuǎn)錄組高通量測序技術(shù)篩選分析珍珠蘆薈白化苗的差異表達(dá)基因，挖掘相關(guān)功能基因，為進(jìn)一步選育珍珠蘆薈新品種提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 珍珠蘆薈正常株（WT）及白化苗突變株（qj 和ls）由漳州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所組培所得。分別取生長期約為45 d 的植株葉片用于葉綠素和類胡蘿卜素含量測定以及RNA 提取，每種材料3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.1.2 主要試劑與儀器 RNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和純化試劑盒購自天根生化科技有限公司，Nanodrop 2000 微量分光光度計(jì)購自ThermoFisher Scientific 公司，LightCycler480 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀購自瑞士Roche 公司，P8 型分光光度購自上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 光合色素含量測定 采用分光光度計(jì)測定珍珠蘆薈及其2 種突變株葉片中葉綠素和類胡蘿卜素的含量[20]。稱取鮮葉2.0 g 研磨，過濾，取提取液，分別在波長665、649、470 nm 下測定吸光度。根據(jù)公式分別計(jì)算出葉綠素a（Chla）、葉綠素b（Chlb）和類胡蘿卜素（Caro）含量：Chla=13.95×A?6.88×A；Chlb=24.96×A?7.32×A；Caro=（1000×A?2.05×Chla?114.8×Chlb）/245。

1.2.2 RNA 提取 珍珠蘆薈正常株（WT）及白化苗突變體（qj 和ls）植株葉片總RNA 提取按照RNA 提取試劑盒中的方法步驟進(jìn)行，使用微量分光光度計(jì)（Nanodrop 2000）檢測其純度和濃度，將符合要求的RNA 置于?80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 文庫的構(gòu)建及轉(zhuǎn)錄組測序 為了使測序結(jié)果更穩(wěn)定，本研究將3 個(gè)合格樣品混合為1 個(gè)樣品，并在此基礎(chǔ)上做3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。使用oligo（dT）磁珠從總RNA 中富集帶poly（A）的mRNA，隨后采用超聲處理成隨機(jī)片段。以mRNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成第一鏈cDNA 和第二鏈cDNA，接著用純化試劑盒純化cND，最后進(jìn)行末端修復(fù)、加尾和加接頭，構(gòu)建成cDNA 文庫，基于IlluminaHiSeq TM 4000 高通量平臺(tái)，以Pair-end 150 bp雙端測序模式對cDNA 文庫進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。

1.2.4 Unigene 序列的獲得和生物信息學(xué)分析首先獲得原始讀長（raw reads），進(jìn)一步過濾和質(zhì)控獲得clean reads，隨后借助Trinity 軟件根據(jù)序列之間的重疊信息（kmer 長度為31 bp，kmer深度為6）組裝拼接得到Unigene。將獲得的Unigene 序列與Nr、SwissProt、GO、KEGG 和COG 等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST 比對分析，得到蘆薈基因的蛋白功能注釋和分類。

1.2.5 差異表達(dá)基因鑒定與功能富集分析 采用DESeq2[21]進(jìn)行基因差異表達(dá)分析。以FDR<0.05且|log2FC|>1 為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行差異表達(dá)基因的鑒定。其中FDR<0.05 且logFC>1 的基因?yàn)樯险{(diào)表達(dá)基因，F(xiàn)DR<0.05 且logFC<-1 的基因?yàn)橄抡{(diào)表達(dá)基因。通過FPKM值計(jì)算定量Unigenes 的表達(dá)豐度，公式：FPKM=10×C/（N×L/1000）。通過BLASTx程序以e-value<1e-5 為閾值在Nr 數(shù)據(jù)庫、Swiss-prot 蛋白數(shù)據(jù)庫、KEGG 數(shù)據(jù)庫和KOG 數(shù)據(jù)庫對Unigenes 注釋。基于Nr 注釋，借助Blast2GO 軟件進(jìn)行GO 注釋分析[22]。通過WEGO軟件對Unigenes 分類[23]。GO 與KEGG 富集分析是利用超幾何檢驗(yàn)進(jìn)行P 值計(jì)算并進(jìn)行Bonferroni 校正，以q-value<0.05 為標(biāo)準(zhǔn)篩選出差異表達(dá)基因顯著富集的GO 條目或pathway。

1.2.6 DEGs 的qRT-PCR 驗(yàn)證 采用TaKaRa 公司的PrimeScriptTM 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用TaKaRa 公司的SYBR Premix ExTaqTM 進(jìn)行Real-time PCR，反應(yīng)條件為：98 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火15 s，68 ℃延伸30 s，35 個(gè)循環(huán)。內(nèi)參選用珍珠蘆薈actin，利用Primer 5.0 對驗(yàn)證基因的CDS 區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物，引物詳細(xì)信息見表1。采用2–ΔΔCT 法計(jì)算珍珠蘆薈不同材料間差異基因的相對表達(dá)量。比較轉(zhuǎn)錄組水平的FPKM 值和熒光定量PCR 的相對表達(dá)量，驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選DEGs 的可靠性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2016 和Origin 8.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和制圖，采用Duncan’s 新復(fù)極差法檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 珍珠蘆薈白化苗突變株及其光合色素含量分析

與正常苗對比，白化苗突變株ls 外部色澤呈現(xiàn)白綠相間，白化苗突變株qj 外部色澤呈現(xiàn)淡淡的綠白色，而正常葉色苗呈現(xiàn)均勻綠色（圖1）。對珍珠蘆薈3 種材料葉片的光合色素葉綠素a、葉綠素b 和類胡蘿卜素含量測定結(jié)果表明，正常植株葉片中葉綠素a、葉綠素b 和類胡蘿卜素含量極顯著高于白化突變體（ls 和qj）。與正常苗葉片相比，突變體ls 葉片的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量分別降低63.8%、61.8%和61.1%，突變體材料qj 葉片的葉綠素a、葉綠素b 和類胡蘿卜素含量分別降低73.4%、76.0%和53.1%（圖2）。

2.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

本研究共獲得原始數(shù)據(jù)（raw reads）68.23 Gb，經(jīng)過數(shù)據(jù)過濾和質(zhì)控得到有效數(shù)據(jù)（clean reads）67.72 Gb，GC 含量介于47.63%～48.25%之間，Q20平均值超過98%，Q30 平均值超過94%（表2）。經(jīng)過組裝，一共得到122 665 條Unigenes，其中，最長長度為24 511 bp，最短長度為201 bp，平均長度為822 bp，Unigene N50 數(shù)量為19 100，N50長度為1443 bp。不同長度Unigenes 分布比例顯示，長度在200～500 bp 的Unigene 占55.9%，長度超過2000 bp 的占9.36%。上述結(jié)果表明，測序結(jié)果良好，各項(xiàng)質(zhì)控指標(biāo)達(dá)到要求，可用于后續(xù)分析。

2.3 Unigene 功能注釋 將組裝得到的122 665條Unigenes 序列與相關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，其中，51 798 條Unigenes 在Nr 數(shù)據(jù)庫（non-redundantprotein database）中獲得注釋，占42.2%；35 338條Unigenes 注釋到SwissProt 數(shù)據(jù)庫，占28.8%；30 666 條Unigenes 在COG 數(shù)據(jù)庫中獲得注釋，占25.0%；29 046 條Unigenes 在GO 數(shù)據(jù)庫中獲得注釋，占23.7%；45 496 條Unigene 在KEGG數(shù)據(jù)庫中獲得注釋，占37.1%（圖3）。

將比對到Nr 數(shù)據(jù)庫的序列進(jìn)一步分析，結(jié)果表明，珍珠蘆薈與蘆筍（Asparagus officinalis）匹配比例最高，為8822 條，占到可匹配序列的7.19% ， 接下來依次為蒺藜苜蓿（ Medicagotruncatula，5.89%）、棕櫚（Elaeis guineensis，1.93%）、葡萄（Vitis vinifera，1.68%）、海棗（Phoenixdactylifera，1.57%）、金杜鵑（Rhodamnia argentea，1.29%）、石斛（Dendrobium catenatum，1.22%）、黃花蒿（Artemisia annua，1.14 %）（圖4）。

2.3 差異表達(dá)基因的GO富集分析

以FDR<0.05 且|log2FC|>1 為條件進(jìn)行差異表達(dá)基因的篩選。結(jié)果表明（圖5），與正常植株WT 的葉片相比，白化苗突變株ls 葉片中有914個(gè)差異表達(dá)基因，其中453 個(gè)上調(diào)，461 個(gè)下調(diào)（WT-vs-ls）；白化苗突變株qj 葉片中有1851 個(gè)差異表達(dá)基因，其中868 個(gè)上調(diào)，983 個(gè)下調(diào)（WT-vs-qj）。

為了研究珍珠蘆薈白化苗突變株的DEGs 涉及的生物學(xué)功能，將白化植株ls 和qj 中的DEGs分別進(jìn)行了GO 功能富集分析。由圖6A 和圖6B可知，ls 和qj 的DEGs 均被富集到生物過程（biological process， BP）、細(xì)胞組分（cellularcomponent， CC）和分子功能（molecular function，MF）3 個(gè)功能類別。在生物過程中，ls 的DEGs顯著富集在色素積累（pigment accumulation）、組織中的色素積累（pigment accumulation in tissues）、細(xì)胞壁組成或生物發(fā)生（cell wall organizationor biogenesis ） 、發(fā)育性生長（ developmentalgrowth）等；qj 的DEGs 則顯著富集在細(xì)胞壁組成或生物合成（cell wall organization or biogenesis）、內(nèi)源性刺激反應(yīng)（response to endogenousstimulus）和色素聚集（pigment accumulation）等生物過程。在細(xì)胞組分中，ls 的DEGs 顯著富集在細(xì)胞壁（cell wall）、細(xì)胞外周（cell periphery）、細(xì)胞外區(qū)域（extracellular region）等；qj 的DEGs則顯著富集在細(xì)胞外周（cell periphery）、細(xì)胞壁（cell wall）和外部封裝結(jié)構(gòu)（external encapsulatingstructure）。在分子功能中，ls 顯著富集在水解O-糖基化合物水解酶活性（hydrolase activity，hydrolyzing O-glycosyl compounds）、作用于糖基鍵的水解酶活性（hydrolase activity， acting onglycosyl bonds）和酶抑制劑活性（enzyme inhibitoractivity）；qj 的DEGs 則顯著富集在在水解O-糖基化合物水解酶活性（hydrolase activity， hydrolyzingO-glycosyl compounds）、作用于糖基鍵的水解酶活性（hydrolase activity， acting on glycosylbonds）和氧化還原酶活性（oxidoreductaseactivity）。

2.4 差異表達(dá)基因的KEGG富集分析

為研究白化苗突變株ls 和qj 的代謝通路情況，本研究對ls 和qj 的DEGs 分別進(jìn)行KEGG 富集分析。結(jié)果表明，ls 的差異表達(dá)基因顯著富集在植物－病原互作（plant-pathogen interaction）、代謝通路（metabolic pathways）、MAPK 信號通路－植物（MAPK signaling pathway-plant）、二萜生物合成（diterpenoid biosynthesis）及次生代謝物生物合成（biosynthesis of secondary metabolite）等通路（圖7A）；而qj 的DEGs 則顯著富集在核糖體（ribosome）、脂肪酶延伸（fatty acid elongation）、次生代謝物生物合成（biosynthesis ofsecondary metabolite ） 、苯丙烷生物合成（phenylpropanoid biosynthesis）和類黃酮生物化成（flavonoid biosynthesis）等通路（圖7B），2個(gè)突變體ls 和qj 均在次生謝物生物合成中差異表達(dá)基因存在顯著富集現(xiàn)象。

2.5 參與光合作用相關(guān)基因的篩選及表達(dá)分析

基因porA 和Cab13 與葉綠素的合成緊密相關(guān)，其在2 個(gè)突變體中均呈現(xiàn)出顯著的下調(diào)表達(dá)。在與光合作用相關(guān)基因（如光合途徑、天線蛋白、葉綠素合成）中，以FDR<0.05 且|log2FC|>1 為閾值，從突變體ls 中選取了7 個(gè)基因，在突變體qj中選取了22 個(gè)基因進(jìn)行分析。結(jié)果表明，與正常植株WT 相比，在突變體ls 中，呈現(xiàn)顯著下調(diào)的基因有原葉綠素酸酯氧化還原酶A（porA）和葉綠素a/b 結(jié)合蛋白（cab13）（圖8）；在突變體qj 中，呈現(xiàn)顯著下調(diào)的基因有moda 和porA（圖8）。與葉綠素合成緊密相關(guān)的基因porA 和Cab13在2 個(gè)突變體中均呈現(xiàn)出顯著的下調(diào)表達(dá)。

為驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可靠性，采用qRT-PCR對與葉綠素合成的相關(guān)基因porA、cab13 和moda 表達(dá)情況進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明（圖9），與正常植株WT 相比，白化苗突變株ls 和qj 的porA、cab13 和moda 的表達(dá)均顯著下調(diào)，該數(shù)據(jù)與轉(zhuǎn)錄組中FPKM 值的變化數(shù)據(jù)一致，說明該轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可靠。

3 討論

白化突變雖一般為致死性突變，許多植株在幼苗期就會(huì)死亡，因此在實(shí)際應(yīng)用中受到了限制，但園藝植物的白化突變體卻有極高的觀賞價(jià)值，且白化現(xiàn)象也具有一定的理論價(jià)值。白化突變體可以用來標(biāo)記性狀，也可以作為特殊的種質(zhì)資源來研究與葉綠體發(fā)育和葉綠素合成的相關(guān)基因的調(diào)控機(jī)制。高等植物葉片中葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素等三大類光合色素含量和分布決定了其顏色[24-27]。本研究通過測定珍珠蘆薈正常植株（WT）和白化苗突變株（ls 和qj）的光合色素表明，白化苗突變株的葉綠素a、葉綠素b 和類胡蘿卜素的含量均遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于正常植株。

許多研究表明，植物葉綠素的生物合成是一個(gè)高度有序的生理生化過程，20 多個(gè)基因編碼的16 種酶參與該過程，當(dāng)此過程發(fā)生障礙，則前體物質(zhì)會(huì)積累，進(jìn)而導(dǎo)致其含量增加，其后的物質(zhì)含量會(huì)迅速下降，從而產(chǎn)生顏色變異的葉片；類胡蘿卜素廣泛存在于植物的綠色組織中，它可以保護(hù)葉綠素免受光氧化。在合成胡蘿卜素和葉黃素的過程中，相關(guān)基因發(fā)生突變，也能引起植物白化現(xiàn)象的產(chǎn)生，因此，葉色白化突變體形成的內(nèi)在原因主要是葉綠素合成代謝受阻導(dǎo)致的[2， 4， 5]。葉綠素的合成與代謝是一個(gè)復(fù)雜調(diào)控過程，涉及許多酶促反應(yīng)，其中每一步酶促反應(yīng)的變化都將影響葉綠素的最終合成而使葉色發(fā)生變化甚至導(dǎo)致植株死亡。已有研究結(jié)果表明，與葉綠素合成和降解緊密相關(guān)基因的異常表達(dá)是促使葉片白化現(xiàn)象的主要原因[28]。

在本研究中，對葉色正常和白化的珍珠蘆薈進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序，結(jié)果表明在白化苗突變株ls葉片中共篩選到914 個(gè)差異表達(dá)基因（DEGs），其中453 個(gè)上調(diào)，461 個(gè)下調(diào)；在白化苗突變株qj 葉片中篩選到1851 個(gè)差異表達(dá)基因，其中868個(gè)上調(diào)，983 個(gè)下調(diào)。GO 功能富集分析顯示，ls和qj 的差異表達(dá)基因均顯著富集在色素積累（pigment accumulation）的生物過程中；在分子功能則均顯著富集在水解O-糖基化合物水解酶活性（hydrolase activity， hydrolyzing O-glycosylcompounds ） 和作用于糖基鍵的水解酶活性（hydrolase activity， acting on glycosyl bonds）中。在對差異基因的KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)，ls 和qj均顯著富集在次生代謝物合成等通路中，而與光合作用相關(guān)途徑的差異基因未獲得顯著富集。在對光合色素合成相關(guān)基因的表達(dá)情況分析發(fā)現(xiàn)，這些基因在2 個(gè)白化突變株中呈現(xiàn)出顯著差異表達(dá)，其中與葉綠素合成的關(guān)鍵基因除porA、cab13和moda 在白化突變株呈現(xiàn)顯著下調(diào)外，sgr 等其他搜尋獲得的基因呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)；與類胡蘿卜素降解相關(guān)的基因9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶（nced）表達(dá)呈現(xiàn)顯著上調(diào)表達(dá)，這與光合色素含量的測定結(jié)果相一致。研究表明，呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)的基因porA、cab13 和moda 為葉綠素合成相關(guān)酶編碼基因，這些基因的突變或下調(diào)表達(dá)會(huì)影響植物葉素綠的合成。

porA 為原葉綠素酸酯氧化還原酶，它催化底物原葉綠素的還原，最終形成葉綠素。porA 為2個(gè)突變株共同下調(diào)表達(dá)的基因，porA 基因下調(diào)會(huì)導(dǎo)致原葉綠素酸酯合成葉綠素酸酯的酶促反應(yīng)受到影響，進(jìn)而影響2 個(gè)突變株的葉綠素合成，因此推測該基因下調(diào)對珍珠蘆薈白化苗形成起著重要的作用，這與左朋[29]研究中利用過表達(dá)porA、porB 基因促進(jìn)葉綠素的合成的研究結(jié)果相符合。研究顯示porA-1 突變體以及porA RNAi 植株會(huì)呈現(xiàn)出嚴(yán)重的光合自養(yǎng)生長缺陷[30]。在暗形態(tài)發(fā)生中，缺失porA 會(huì)導(dǎo)致初級質(zhì)體基粒體積和數(shù)量減少，以及光活性的植物原葉綠素酸酯轉(zhuǎn)化的減少[30]。此外，porA 基因?qū)|(zhì)體發(fā)育中膜的超微結(jié)構(gòu)以及正常生化反應(yīng)是至關(guān)重要的[30]；而在呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)的基因中，sgr 編碼一個(gè)Mg2+去螯合酶，參與到葉綠素的降解過程，sgr 在水稻中過量表達(dá)能促進(jìn)葉綠素分解，減少正常生長葉片中的基粒類囊體片層數(shù)量和葉綠素含量[31]。番茄、水稻、鱷梨、葡萄及草莓等植物中nced 基因主要通過參與到脫落酸生物合成過程，導(dǎo)致植物體內(nèi)脫落酸含量變化，使植物器官呈現(xiàn)不同顏色[32]。

本研究以珍珠蘆薈及其白化突變株為研究對象，通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析挖掘出與葉片白化形成相關(guān)的關(guān)鍵功能基因，研究結(jié)果為揭示珍珠蘆薈組培苗白化突變體形成可能包含的分子機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。