汪盈盈,馮學(xué)花,馬然然

(1.安徽中醫(yī)藥科學(xué)院亳州中醫(yī)藥研究所,安徽 亳州 236800;2.亳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院,安徽 亳州 236800;3.安徽新華學(xué)院,安徽 合肥 230031)

桃紅四物湯是古代活血化瘀的經(jīng)典名方,最早在《醫(yī)宗金鑒》記載[1](P413),[2]。本方藥由桃仁、紅花、熟地、當(dāng)歸、芍藥、川芎組成,主養(yǎng)血、活血、調(diào)經(jīng)止痛,用于血虛有淤之證,臨床應(yīng)用多見于婦科?，F(xiàn)代臨床研究表明,桃紅四物湯不僅用于治療婦科疾病,此方中的有效成分沒食子酸具有抗炎、抗菌,抗病毒等作用,另外還能抗腫瘤,抑制肥大細(xì)胞瘤的轉(zhuǎn)移;羥基紅花黃素A是紅花里最高效的水溶性成分,它具有抑制血小板凝聚,抗心肌缺血,抗炎,抗腫瘤活性等藥理活性;阿魏酸對血小板凝聚、血小板解聚、抗血栓形成有一定的抑制作用[3-7]。

1 實驗材料

1.1 儀器

U3000 HPLC (賽默飛世爾科技有限公司)、RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海雅榮生物技術(shù)有限公司)、HH-S2數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州普天儀器制造有限公司)、ZXFD-B5040恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海智城儀器制造有限公司)、SHZ-D (III)循環(huán)水多用真空泵(鞏義市英峪高科儀器廠)、SQP(1/10萬)分析天平(賽多利斯科技(北京)有限公司)、電子秤(上海友聲衡器有限公司)、KQ-500E型超聲波清洗器(昆山市超聲波儀器有限公司)、800 Y多功能粉碎機(jī)(永康市鉑歐五金制品有限公司)。

1.2 藥材

實驗所用中藥材均從安徽新興中藥材飲片有限公司購入,經(jīng)亳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院陳娜副教授鑒定地黃為玄參科植物地黃的干燥塊根(批號:21082202)。當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸的根及根莖(批號:21101501)。川芎為傘形科植物川芎的干燥根(批號:21071502)。芍藥為毛茛科植物白芍的干燥根(批號:21102702)。桃仁為薔薇科植物桃或山桃的干燥成熟種仁(批號:21092501)。紅花為菊科紅花屬植物紅花的干燥管狀花(批號:21112002)[8]。

1.3 試劑

無水乙醇(分析純,天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司)、甲醇(色譜純,天津市大茂化學(xué)試劑廠)、乙腈(色譜純,天津一方科技有限公司)、磷酸、超純水。

1.4 對照品

沒食子酸(批號:110831-201906,含量:91.5%)、羥基紅花黃色素A(批號:111637-201207,含量:92.5%)、阿魏酸(批號:110773-201915,含量:99.4%)。均來源于中國藥品生物制品檢定所。

2 方法

2.1 桃紅四物湯中有效成分的含量測定

2.1.1 色譜條件

色譜柱(4.6×250毫米,5微米);流動相使用乙腈(A通道)和0.05%磷酸水溶液(B通道);采用梯度洗脫,梯度洗脫系統(tǒng)如表1;流速設(shè)置為1.0 mL/min;檢測波長:保留時間0～11分鐘時為290 nm,11～27分鐘為320 nm,27～45分鐘為230 nm,45～80分鐘為290 nm;柱溫設(shè)置為40 ℃;進(jìn)樣量:混合對照品20 μl,供試品20 μl[9]。

表1 梯度洗脫系統(tǒng)

2.1.2 供試品溶液的制備

精密稱取川芎6克、紅花6克、桃仁9克、當(dāng)歸9克,置圓底燒瓶中,加6倍量50%乙醇,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀加熱回流提取(1次)2小時后,過濾,得提取藥液。精密量取5 mL提取液放入已恒重蒸發(fā)皿中,水浴蒸干得流浸膏,置烘箱中得干膏,取適量,用50%甲醇溶解,轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中,50%甲醇定容,搖勻,超聲,過濾后為樣品溶液。

2.1.3 混合對照品溶液的制備

精密稱取適量的阿魏酸、羥基紅花黃色素 A、沒食子酸對照品粉末分別置10 mL容量瓶中,50%甲醇溶解定容至刻度,制備成對照品溶液。將上述幾種對照品溶液分別精密量取,按比例混合、濾過,即得混合對照品溶液。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

A圖:混合對照品溶液HPLC圖譜 B圖:混合樣品溶液HPLC圖譜圖1 HPLC色譜圖

精密量取混合對照品溶液0.5 mL,1.0 mL,2.0 mL,3.0 mL,4.0 mL,5.0 mL,分別置10 mL容量瓶中,50%的甲醇定容,搖勻,過濾,按2.1.1項下色譜條件進(jìn)樣,以溶液的濃度為X軸,有效成分的峰面積為Y軸,建立回歸方程,沒食子酸的回歸方程為:Y=0.1439X+0.9003(r=0.9997),羥基紅花黃色素A的回歸方程為:Y=0.122478X+0.0255(r=0.9998),阿魏酸的回歸方程為:Y=0.2149X+0.0589(r=0.9999)。沒食子酸在0.0245～0.245 mg/ mL、羥基紅花黃色素A在0.022～0.22 mg/ mL、阿魏酸在0.0245～0.245 mg/ mL范圍內(nèi),線性關(guān)系良好[10-11]。

(3)經(jīng)過一系列加固整治措施后，湖區(qū)內(nèi)圩堤的防洪能力有了較大提高,但仍然存在城市防洪標(biāo)準(zhǔn)低、新出險工險段、堤容堤貌差、部分項目未按設(shè)計完成、工程管理和監(jiān)測設(shè)施不完善、防汛交通條件差、圩區(qū)排澇能力不足等問題。

2.1.5 精密度試驗

精密量取混合對照品溶液,依照2.1.1色譜條件連續(xù)平行進(jìn)樣。測得沒食子酸、羥基紅花黃色素A、阿魏酸的峰面積,三種成分的RSD(相對標(biāo)準(zhǔn)偏差)值分別為0.83%、0.94%、0.67%,結(jié)果表明三個成分峰面積的RSD值均小于2.0%,說明該儀器的精密度較好。結(jié)果見表2。

表2 精密度試驗

2.1.6 穩(wěn)定性試驗

精密量取混合供試品溶液,按2.1.1色譜條件,室溫條件下在0、2、4、8、12、24小時的分別進(jìn)樣,測定沒食子酸,羥基紅花黃色素A,阿魏酸的峰面積,RSD值分別為0.65%,0.93%,0.53%,對結(jié)果進(jìn)行分析,三者RSD值相差不大且在2%以下,表明該樣品在24小時內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性。結(jié)果見表3。

2.1.7 重復(fù)性試驗

精密量取混合供試品溶液,按2.1.1色譜條件進(jìn)行樣品測定。得到?jīng)]食子酸、羥基紅花黃色素A、阿魏酸的峰面積,其RSD值分別為1.06%,1.10%,0.66%,結(jié)果表明本方法有較好的準(zhǔn)確性。結(jié)果見表4。

表4 重復(fù)性試驗

2.1.8 加樣回收率考察

取適量沒食子酸、羥基紅花黃色素A、阿魏酸對照品分別加入已知含量的6份樣品溶液中,再按照2.1.1色譜條件進(jìn)樣,計算平均回收率及其RSD,結(jié)果表明:沒食子酸平均回收率為98.69%,RSD=1.19%;羥基紅花黃色素A平均回收率為99.15%,RSD=1.32%;阿魏酸平均回收率為98.01%,RSD=1.53%,說明本品的加樣回收率符合要求。注:樣品的加樣回收率=(加對照品后測得含量-已知樣品的含量)/加入對照品的量×100%。結(jié)果見表5。

表5 加樣回收率考察

2.2 醇提工藝單因素試驗

在其他工藝參數(shù)不變的條件下,分別討論不同液料比(4、6、8和10倍)、提取時間(1、1.5、2和2.5h)、提取溶劑的濃度(30、50、70和90%)對桃紅四物湯綜合評分的影響,見表6單因素變化條件,為響應(yīng)面實驗因素水平的選擇提供依據(jù)。注:綜合評分=(有效成分總含量/最大總含量)×70%+(干膏得率/最大干膏得率)×30%。

表6 單因素變化條件

干膏得率的計算:記處方的藥材重量為ms,經(jīng)過恒重的蒸發(fā)皿重量為m1,干燥后的浸出物和蒸發(fā)皿重量之和為m2,精密加入的乙醇量為V1,精密量取的上清液體積為V2,按照公式醇溶性浸出物(%)=(m2-m1)/ms ×V2/V1 ×100%,計算可得。

2.2.1 液料比對綜合評分的影響

根據(jù)表6的單因素變化情況進(jìn)行實驗,以綜合評分為依據(jù),桃紅四物湯提取液的綜合評分隨著液料比的不同呈不規(guī)則曲線變化,見圖2單因素試驗結(jié)果,在液料比為6倍時,綜合評分達(dá)到最高,8倍時較高,雖然4倍和10倍時綜合評分相近,但考慮到液料比過大會給后續(xù)的提取液蒸發(fā)增加難度,故確定因素水平為4、6和8倍。

圖2 單因素試驗結(jié)果

2.2.2 提取時間對綜合評分的影響

根據(jù)表6的單因素變化情況進(jìn)行實驗,以綜合評分為依據(jù),見圖2單因素試驗結(jié)果,可知提取時間為1.5 h、2 h和2.5 h時綜合評分較高,且在2 h時達(dá)到最高,故確定因素水平為1.5 h、2 h和2.5 h。

2.2.3 提取溶劑(乙醇)的濃度對綜合評分的影響

根據(jù)表6的單因素變化情況進(jìn)行實驗,以綜合評分為依據(jù),見圖2單因素試驗結(jié)果,可知乙醇濃度為30%、50%和70%時綜合評分最高,且在50%時達(dá)到最高啊,故確定因素水平為30%、50%和70%。

2.3 Box-Behnken設(shè)計優(yōu)化醇提工藝

2.3.1 Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果

通過單因素試驗,得到了各因素的水平值,并將液料比(A)、提取時間(B)、提取溶劑濃度(C)作為自變量,1次作為總提取次數(shù),以三種有效成分的含量和干膏得率的綜合評分(R)為響應(yīng)值,采用 Design Expert軟件12.0版本進(jìn)行3因素3水平17個試驗點的Box-Behnken設(shè)計,得到響應(yīng)面分析模型,對其醇提工藝進(jìn)行優(yōu)化,確定最佳的工藝條件。因素與水平見表7,醇提工藝響應(yīng)面實驗設(shè)計與結(jié)果見表8。

表7 實驗因素和水平

表8 提取工藝響應(yīng)面實驗設(shè)計與結(jié)果

2.3.2 數(shù)據(jù)擬合及方差分析

通過 Design Expert12.0軟件對表8的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析,以三因素綜合評分進(jìn)行響應(yīng)面分析,對各個數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合分析,得出多元二次回歸方程:Y=97.56-2.49A+1.01B-1.78C+0.0925AB+0.5875AC+4.00BC-6.32A2-4.61B2-5.01C2。方差分析結(jié)果見表9。

表9 方差分析結(jié)果

根據(jù)表9可以看出,該回歸模型P<0.0001,顯示了該模型的極顯著性(P<0.01極其顯著,P<0.05顯著),失擬項P=0.2477>0.05,無顯著性,說明該模型的擬合度和可信度都很高,且試驗誤差也比較小。R2=0.9799,說明實驗結(jié)果與預(yù)測值較吻合,該模型可以應(yīng)用于乙醇提取工藝的綜合評分預(yù)測,為優(yōu)化乙醇提取工藝提工依據(jù)。從表9的顯著性檢驗發(fā)現(xiàn):單因素A、C均顯著性(P<0.05),交互因素BC極其顯著(P=0.0004<0.05),且二次項的A2、B2、C2均有顯著性(P<0.01)。三個因素對桃紅四物湯醇提工藝的影響依次為:液料比>乙醇濃度>提取時間,交互因素對綜合評分的影響大小順序為:BC>AC>AB。

2.3.3 響應(yīng)面圖譜分析

根據(jù)交互因素對綜合評分的影響,通過響應(yīng)面分析軟件得到響應(yīng)面3D曲線圖譜和等高線圖,從響應(yīng)面圖譜上可以更直觀地看到各因素對綜合評分的影響程度及變化趨勢。曲面傾斜的程度反映了交互因素對綜合評分影響的大小,等高線的密度則反映了單因素對綜合評分的影響。由圖3響應(yīng)面圖譜可以看出,提取時間和乙醇濃度兩因素的交互作用曲面是最陡峭的,且等高線呈近橢圓形,說明對綜合評分的影響最大;而液料比和乙醇濃度對綜合評分的交互影響不大,其等高線圖近似于圓形;液料比和提取時間的交互影響最小,其等高線圖與圓周曲線相近。然后,各個因素對綜合評分的交互作用有顯著的排序: BC>AC>AB,與表9的方差分析結(jié)果一致。再根據(jù)軟件計算、綜合評分、操作方便確定最優(yōu)方案[5]。

圖3 響應(yīng)面圖譜

通過使用響應(yīng)面軟件預(yù)測得到桃紅四物丸的最優(yōu)醇提工藝為:液料比5.59倍,提取時間2.01小時,乙醇濃度46.4%,預(yù)測的綜合評分為97.99%。考慮到生產(chǎn)過程中的實施可行性,需要將預(yù)測的最優(yōu)工藝參數(shù)調(diào)整為:液料比6倍,提取時間2小時,乙醇濃度50%。

3 驗證實驗

分別按處方稱取三份藥材,在上述條件下進(jìn)行三次平行試驗,驗證結(jié)果見表10。所測得的綜合評分平均值為98.01%,RSD=0.66%,且三次平行試驗的綜合評分都接近于響應(yīng)面法的預(yù)測值,由此證明調(diào)整后的醇提工藝是穩(wěn)定的、可行的,可作為桃紅四物湯的最優(yōu)醇提工藝。

表10 驗證結(jié)果

4 討論

本文采用含量相對較高、分離度較好的川芎中的沒食子酸、川芎和當(dāng)歸中阿魏酸、紅花中羥基紅花黃素 A的含量作為評價指標(biāo), HPLC中沒食子酸的測定波長為271 nm,保持時間約7分鐘,而對羥基紅花黃素 A的測定波長為320 nm、約28 min、阿魏酸為230 nm、約41分鐘[9]。試驗選用0.05%的乙腈-0.05%的磷酸水溶液作為流動相進(jìn)行梯度洗脫,可以延長色譜峰的保留時間,提高分離度,穩(wěn)定基線,檢測出更加適合的峰高[12]。為了避免在配制溶液中使用的50%甲醇影響后續(xù)測定的出峰和保留時間,采用空白對照品進(jìn)樣。

實驗采用響應(yīng)面法優(yōu)化,求得實驗中最佳的工藝參數(shù)。傳統(tǒng)的正交試驗方法精度低、應(yīng)用范圍小,而響應(yīng)面法則可以通過建立回歸方程、響應(yīng)曲面模型、繪制等高線來實現(xiàn)對各個因素水平的響應(yīng),從而實現(xiàn)快速、方便地得到各因素水平的響應(yīng)值,并且可以將最佳工藝參數(shù)確定時的隨機(jī)誤差考慮在內(nèi)。這種方法具有試驗次數(shù)少、周期短、可以對試驗進(jìn)行連續(xù)分析的優(yōu)點,而且所獲得的二次多項回歸方程可以簡化后續(xù)的計算[13-15]。

本研究中確定了桃紅四物丸的最優(yōu)提取工藝為加6倍量50%乙醇,提取2小時,提取液中沒食子酸、阿魏酸、紅花中羥基紅花黃素 A的含量較高,且實測值與預(yù)測值相符,表明Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)選得到的提取工藝可靠,具有一定的實際應(yīng)用價值,可為桃紅四物丸的后續(xù)研究提供參考。