張 嬌, 馬寶蓮, 張永蘭

（重慶理工大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院藥理實(shí)驗(yàn)室，重慶 400054）

外泌體是由細(xì)胞分泌的具有單層膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞外囊泡，直徑為30～200 nm，具有與細(xì)胞相同的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。外泌體作為蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)物質(zhì)的運(yùn)輸及儲(chǔ)存工具，參與多種疾病的病理生理過(guò)程［1-3］。在發(fā)育、免疫、組織動(dòng)態(tài)平衡、癌癥和神經(jīng)退行性疾病等方面均發(fā)揮重要作用?？墒秤弥参飦?lái)源外泌體 樣 納 米 顆 粒 （edible plant-exosomes-like nanoparticles， ELNs）因其提取簡(jiǎn)便和活性明顯等特點(diǎn)受到研究者的重視，已有研究［4］顯示：從不同可食用鮮榨果蔬汁中提取得到的外泌體與其來(lái)源植物有相似的活性。氧化還原過(guò)程幾乎滲透到所有生命活動(dòng)過(guò)程中［5］。在正常情況下，氧化劑形成的速率和幅度與其去除速率相平衡，而促氧化劑和抗氧化劑之間失去平衡會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激在常見(jiàn)的疾病，如糖尿病、高血壓、子癇前期、動(dòng)脈粥樣硬化、急性腎功能衰竭、阿爾茨海默病和帕金森綜合征的生理過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［6］?？寡趸瘎┮蚱湓隗w內(nèi)和氧化應(yīng)激介導(dǎo)的病理過(guò)程中具有保護(hù)作用而越來(lái)越受關(guān)注［7］。目前，主要將自由基清除實(shí)驗(yàn)、脂質(zhì)過(guò)氧化抑制實(shí)驗(yàn)和總抗氧化能力測(cè)定作為抗氧化物質(zhì)體外抗氧化能力的評(píng)價(jià)方法［8］。體內(nèi)外研究［4，9-11］證實(shí)：ELNs 在抗炎、抗腫瘤和抗纖維化等方面具有重要作用，但目前關(guān)于其體外抗氧化作用尚無(wú)報(bào)道。本研究采用高速差速離心法分離提取得到生姜、青椒、大蒜、蘑菇、檸檬、山藥、葡萄、番茄、西蘭花和洋蔥10 種ELNs，并首次基于 二 苯 基 苦 基 苯 肼 （1， 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除體系、2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽［2，2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate， ABTS］ 陽(yáng) 離 子自由基體系和鐵離子總還原能力（Ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP） 體系3 種方法測(cè)定10 種ELNs 的體外抗氧化能力，采用MTT 比色法測(cè)定ELNs 對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞氧化損傷后細(xì)胞活力的影響，闡明ELNs 的抗氧化能力，為分析ELNs 的活性成分及抗氧化作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、植物、主要試劑和儀器PC12 細(xì)胞購(gòu)自上海傅衡生物科技有限公司。生姜、青椒、大蒜、蘑菇、檸檬、山藥、葡萄、番茄、西蘭花和洋蔥購(gòu)于重慶市某超市。 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS） 購(gòu)自蘭杰柯科技有限公司，DPPH 購(gòu)自源葉生物科技有限公司，ABTS 試劑盒和FRAP 總抗氧化檢測(cè)試劑盒購(gòu)自廣州碧云天生物技術(shù)公司，甲醇購(gòu)自重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司，過(guò)氧化氫購(gòu)自成都市科龍化工試劑廠，DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自上海源培生物科技股份有限公司，胎牛血清購(gòu)自以色列Biological Industries（BioInd）公司，胰蛋白酶和青霉素及鏈霉素雙抗購(gòu)自香港BBI 生命科學(xué)有限公司，噻唑藍(lán)［3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT］購(gòu)自美國(guó)MedChemExpress 公司， 二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）購(gòu)自成都化夏化學(xué)試劑有限公司，PEG8000 購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司。濾膜購(gòu)自海鹽新東方塑化科技有限公司，濾頭購(gòu)自美國(guó)Millipore 公司，JYL-C020E 榨汁機(jī)購(gòu)自九陽(yáng)股份有限公司，SQP 天平購(gòu)自賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司，5805 離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf 公司，1510 酶標(biāo)儀購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)） 有限公司。

1.2 ELNs 提取采用差速離心法分別提取10 種ELNs。取大蒜、青椒、生姜、葡萄、檸檬、西蘭花、番茄、山藥、蘑菇和洋蔥10 種植物。對(duì)于葡萄和番茄等富含汁液的可食用食物，榨汁后收集汁液；對(duì)于大蒜、青椒、生姜、檸檬、西蘭花、山藥、蘑菇和洋蔥汁液較少的可食用植物，加入2 倍可食用植物質(zhì)量的去離子水，榨汁后收集汁液；將收集的可食用植物汁液經(jīng)5 000 g、4 ℃離心20 min；取上清，經(jīng)10 000 g、4 ℃離心 30 min；取上清，采用1 μm 濾膜過(guò)濾后加入終濃度8% 的PEG 8000，4 ℃過(guò)夜孵育；10 000×g、4℃，離心30 min；棄去上清，將得到的外泌體沉淀稱質(zhì)量，加入適量PBS 緩沖液，輕柔地吹打幾次，使沉淀均勻地懸浮于PBS 緩沖液中，經(jīng)0.22 μm 濾頭過(guò)濾除菌，即獲得大蒜外泌體、青椒外泌體、生姜外泌體、葡萄外泌體、檸檬外泌體、西蘭花外泌體、番茄外泌體、山藥外泌體、蘑菇外泌體和洋蔥外泌體，分裝后于4 ℃保存。PC12 細(xì)胞分為對(duì)照組、外泌體組、過(guò)氧化氫組和過(guò)氧化氫+外泌體組。

1.3 DPPH 自由基清除能力檢測(cè)避光精密稱取5 mg DPPH，加入50 mL 甲醇溶解，獲得濃度為0.1 g·L－1DPPH 溶液，避光保存，備用。分別吸 取20 μL ELNs 溶 液 與180 μL DPPH 甲 醇 溶 液（0.1 g·L－1）混合，同時(shí)以甲醇為空白，室溫避光反應(yīng)30 min，于517 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A）值，計(jì)算DPPH 自由基清除率。DPPH 自由基清除率= （A0－A）/A0×100%，A0：無(wú)提取物（空白對(duì)照）時(shí)自由基溶液的A 值；A：自由基溶液在ELNs 存 在 下 的A 值。

1.4 ABTS 陽(yáng)離子自由基清除能力檢測(cè)按照試劑盒說(shuō)明書(shū)在96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板的每個(gè)檢測(cè)孔中加入20 μL 過(guò)氧化物酶工作液，空白對(duì)照孔中加入10 μL PBS 緩沖液；標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測(cè)孔內(nèi)加入10 μL不 同 濃 度（0.15、 0.30、 0.60、 0.90、 1.20 和1.50 mmol·L－1）Trolox 標(biāo)準(zhǔn)溶液；樣品 檢測(cè)孔內(nèi)加入10 μL 各200 g·L－1ELNs。輕輕混勻，每個(gè)孔內(nèi)加入170 μL ABTS 工作液（包含152 μL 檢測(cè)緩沖液，10 μL ABTS 溶液，8 μL 1∶1 000 過(guò)氧化氫溶液），輕輕混勻。室溫孵育6 min 后于414 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定A 值。計(jì)算ABTS 陽(yáng)離子自由基清除率。ABTS 陽(yáng) 離 子 自 由 基 清 除 率= （1－A/A0） ×100%，A0：無(wú)提取物（空白對(duì)照）時(shí)ABTS 陽(yáng)離子自由基溶液的A 值；A：ABTS 陽(yáng)離子自由基溶液在可食用ELNs 存在條件下A 值。

1.5 FRAP 總抗氧化能力檢測(cè)按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，在96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板的每個(gè)檢測(cè)孔中加入180 μL FRAP 工 作 液（TPTZ 稀 釋 液150 μL，TPTZ 溶液15 μL，充分混勻后再加入檢測(cè)緩沖液15 μL）；空白對(duì)照孔中加入5 μL PBS 緩沖液；標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測(cè)孔內(nèi)加入5 μL 不同濃度（0.15、0.30、0.60、0.90、1.20 和1.50 mmol·L－1）Trolox 標(biāo)準(zhǔn)溶液；各樣品孔加入5 μL、200 g·L－1ELNs，輕輕混勻。37 ℃孵育3～5 min 后測(cè)定A（593）值。以各濃度Trolox 標(biāo)準(zhǔn)溶液A（593）值為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度為縱坐標(biāo)制成Trolox 標(biāo)準(zhǔn)曲線。擬合回歸方程為Y=0.676 6X+0.029 8，R2=0.993 5。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的FRAP 總抗氧化能力。

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)從液氮中取出凍存的PC12 細(xì)胞，置于 37 ℃溫水中晃動(dòng)使其快速融化，移液槍吸取細(xì)胞凍存液到含有適量培養(yǎng)液的離心管中，1 000 r·min－1離心5 min 后棄上清液，加入2～3 mL新鮮培養(yǎng)液，均勻吹散細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，補(bǔ)足培養(yǎng)液至10 mL，輕柔搖晃培養(yǎng)皿直至細(xì)胞完全均勻分散，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

1.7 MTT 法檢測(cè)不同濃度過(guò)氧化氫作用后PC12細(xì)胞活力將處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期PC12 細(xì)胞接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL（每孔1×104個(gè)細(xì)胞），待細(xì)胞貼壁過(guò)夜后加入5 μL 各濃度過(guò)氧化氫溶液制備氧化損傷的PC12 細(xì)胞，使終濃度為50、100、 200、 300、 400、 500、 600、 700 和800 μmol·L－1，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組（加入5 μL PBS溶液），處理細(xì)胞24 h。培養(yǎng)結(jié)束后向每孔加入10 μL 5 g·L－1MTT 溶液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞4 h。去除上清液后以PBS 緩沖液洗滌3 次，最后加入100 mL DMSO， 振 蕩 溶 解10 min， 在570 和630 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定A 值，并計(jì)算平均A 值，以平均A 值代表細(xì)胞活力。

1.8 MTT 法檢測(cè)ELNs 作用后PC12 細(xì)胞活力

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12 細(xì)胞以每孔100 μL（每孔1×104個(gè)細(xì)胞）的密度接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁過(guò)夜后加入5 μL 各種ELNs，使其終濃度為200 mg·L－1，同時(shí)加入5 μL PBS 緩沖液作為空白對(duì)照，處理細(xì)胞24 h。培養(yǎng)結(jié)束后向每孔加入10 μL 5 g·L－1MTT 溶液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞4 h。去除上清液后以PBS 緩沖液洗滌3 次，最后加入100 μL DMSO，振蕩溶解10 min，在570 和630 nm波長(zhǎng)處測(cè)定A 值，并計(jì)算平均A 值，以平均A 值代表細(xì)胞活力。

1.9 MTT 法檢測(cè)ELNs 作用后氧化損傷的PC12細(xì)胞活力將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12 細(xì)胞接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL（每孔1×104個(gè)細(xì)胞），細(xì)胞貼壁過(guò)夜。分別加入5 μL 各種ELNs，使其終濃度為200 mg·L－1，預(yù)處理4 h 后加入5 μL過(guò) 氧 化 氫，使 其 終 濃 度 為600 μmol·L－1，誘 導(dǎo)PC12 細(xì)胞氧化損傷。繼續(xù)處理細(xì)胞24 h，向每孔加入10 μL 5 g·L－1MTT 溶液培養(yǎng)細(xì)胞4 h。去除上清液后以PBS 緩沖液洗滌3 次，最后加入100 mL DMSO，振 蕩 溶 解10 min， 在570 和630 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定A 值，并計(jì)算平均A 值，以平均A 值代表細(xì)胞活力。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用GraphPad Prism 8.01 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。10 種可食用ELNs 的DPPH 自由基清除率、ABTS 陽(yáng)離子自由基清除率、FRAP 總抗氧化能力和ELNs 作用后氧化損傷的PC12 細(xì)胞活力符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 10 種可食用ELNs 的DPPH 自由基清除率、ABTS 陽(yáng)離子自由基清除率和FRAP 總抗氧化能力設(shè)定ELNs 濃度為200 g·L－1，分別測(cè)定DPPH自由基清除率、ABTS 陽(yáng)離子自由基清除率和FRAP 總抗氧化能力，見(jiàn)表1。10 種ELNs 對(duì)DPPH自由基的清除能力從高到低依次為蘑菇、洋蔥、生姜、檸檬、葡萄、番茄、青椒、西蘭花、山藥和大蒜；10 種ELNs 對(duì)ABTS 陽(yáng)離子自由基的清除能力從高到低依次為生姜、蘑菇、洋蔥、檸檬、山藥、葡萄、青椒、大蒜、番茄和西蘭花；10 種ELNs 對(duì)FRAP 體系的總抗氧化能力從高到低依次為生姜、青椒、洋蔥、蘑菇、檸檬、西蘭花、葡萄、山藥、番茄和大蒜。其中洋蔥、生姜、蘑菇、青椒和檸檬5 種ELNs 對(duì)3 種檢測(cè)體系均表現(xiàn)出抗氧化能力。

表1 10 種ELNs 的DPPH 自由基清除率、ABTS 陽(yáng)離子自由基清除率和FRAP 總抗氧化能力Tab.1 DPPH scavenging,ABTS cationic radical scavenging rate, and FRAP total antioxidant capacity of ten ELNs（n=3,±s）

表1 10 種ELNs 的DPPH 自由基清除率、ABTS 陽(yáng)離子自由基清除率和FRAP 總抗氧化能力Tab.1 DPPH scavenging,ABTS cationic radical scavenging rate, and FRAP total antioxidant capacity of ten ELNs（n=3,±s）

Type of ELNs FRAP total antioxidant capacity[mB/(mol·g－1)]Ginger ELNs Green pepper ELNs Garlic ELNs Mushroom ELNs Lemon ELNs Yam ELNs Grape ELNs Tomato ELNs Broccoli ELNs Onion ELNs DPPH scavenging rate (η/%)11.4±4.49 3.00±0.29－13.4±6.34 18.7±5.39 7.84±2.87 0.86±0.12 6.66±4.31 4.74±2.01 2.91±1.82 14.0±1.79 ABTS cationic radical scavenging rate (η/%)21.80±1.00 0.52±0.13 0.58±1.63 12.90±1.40 5.81±1.08 1.77±0.97 1.07±0.49－2.10±0.14－7.80±0.19 7.40±0.54 6.37±0.08 4.60±0.42 0.23±0.26 3.9±0.10 2.70±0.17 0.30±0.05 1.02±0.24 0.24±0.04 1.22±0.66 4.30±0.29

2.2 5 種ELNs 的DPPH 自由基清除能力5 種ELNs 的DPPH 自由基清除能力存在明顯差異（圖1），在 質(zhì) 量 濃 度 為10～100 g·L－1時(shí)，5 種ELNs 的DPPH 自由基清除能力與質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系，按照擬合的回歸方程計(jì)算比較DPPH自由基清除率為50%時(shí)對(duì)應(yīng)的可食用植物外泌體濃度，結(jié)果顯示：5 種ELNs 的DPPH 自由基清除能 力 從 大 到 小 依 次 為 洋 蔥（73.15 g·L－1）、生 姜（124.07 g·L－1）、 蘑 菇 （310.44 g·L－1）、 青 椒（969.06 g·L－1） 和 檸 檬（1 718.94 g·L－1）。5 種ELNs 的擬合回歸方程分別為Y=0.043 6X+7.710 0，R2=0.777 1；Y=0.361 4X+5.160 0，R2=0.852 8； Y=0.506 1X+12.980 0，R2=0.897 7；Y=0.138 2X+7.097 0，R2=0.955 3；Y=0.028 6X+0.769 5，R2=0.743 0。

圖1 5 種ELNs 的DPPH 自由基清除率Fig.1 DPPH scavenging rates of five ELNs

2.3 5 種ELNs 對(duì)ABTS 陽(yáng)離子自由基的清除能力5 種可食用ELNs 對(duì)ABTS 陽(yáng)離子自由基的清除能力具有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系（圖2），當(dāng)ELNs質(zhì) 量 濃 度 為10～100 g·L－1時(shí)，可 食 用ELNs 與ABTS 陽(yáng)離子自由基清除能力呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系；按照擬合的回歸方程計(jì)算比較ABTS 陽(yáng)離子自由基清除率為50%時(shí)對(duì)應(yīng)的可食用植物外泌體質(zhì)量濃度結(jié)果顯示：5 種可食用ELNs 的ABTS 陽(yáng)離子自由基清除能力從大到小依次為生姜（91.24 g·L－1）、 洋 蔥（123.02 g·L－1）、 蘑 菇（518.04 g·L－1）、檸 檬（544.38 g·L－1） 和 青 椒（847.32 g·L－1）。Y=0.426 7X+11.070 0，R2=0.914 1；Y=0.372 7X+4.151 0，R2=0.994 9；Y=0.089 8X+1.131 0，R2=0.978 8； Y=0.098 9X－1.229 0，R2=0.879 2；Y=0.058 0X+0.838 5，R2=0.958 4。

圖2 5 種ELNs 的ABTS 陽(yáng)離子自由基清除率Fig.2 ABTS cationic radical scavenging rates of five ELNs

2.4 5 種ELNs 對(duì)FRAP 體 系 的 總 抗 氧 化 能力

5 種可食用植物來(lái)源外泌樣納米顆粒對(duì)FRAP體系的總抗氧化能力存在明顯差異，在可食用ELNs 質(zhì)量濃度為10～100 g·L－1時(shí)，其總抗氧化能力與質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系， FRAP 為0.5 mol·L－1時(shí)，對(duì)應(yīng)的可食用植物外泌體濃度計(jì)算結(jié)果顯示：在FRAP 體系中，5 種可食用植物來(lái)源外泌樣納米顆?？偪寡趸芰拇蟮叫∫来螢樯?4.17 g·L－1）、洋 蔥（83.00 g·L－1）、青 椒（122.74 g·L－1）、蘑 菇（237.10 g·L－1） 和 檸 檬（962.12 g·L－1）。見(jiàn) 圖3。Y=0.009 5X－0.014 2，R2=0.961 0；Y=0.007 5X－0.119 7，R2=0.995 3；Y=0.005 4X－0.164 4，R2 =0.975 1； Y=0.001 9X+0.045 2，R2=0.804 2；Y=0.000 5X－0.023 8，R2=0.813 3。

圖3 5 種ELNs 的FRAP 總抗氧化能力Fig.3 Total antioxidant capacities of five ELNs

2.5 各組PC12 細(xì)胞活力與對(duì)照組比較，10 種可食用ELNs 濃度為200 mg·L－1時(shí)，除蘑菇外泌體外，其余9 種植物外泌體處理24 h 后，PC12 細(xì)胞活力無(wú)明顯變化。采用MTT 法檢測(cè)不同濃度過(guò)氧化氫對(duì)PC12 細(xì)胞活力的影響，結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，PC12 細(xì)胞活力隨著過(guò)氧化氫濃度升高而降低，呈劑量依賴關(guān)系，當(dāng)過(guò)氧化氫濃度達(dá)到600 μmol·L－1時(shí)，PC12 細(xì) 胞 活 力 降 低 約30%，因此，選擇600 μmol·L－1過(guò)氧化氫作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)濃 度。與 對(duì) 照 組 比 較，600 μmol·L－1過(guò) 氧 化 氫 組PC12 細(xì)胞活力下降約30%。與過(guò)氧化氫組比較，過(guò)氧化氫+ELNs組（青椒、檸檬、山藥和西蘭花）PC12細(xì)胞活力明顯提高21.08%、26.2%、11.72%和15.15%。見(jiàn)表2～4。

表2 MTT 法檢測(cè)各組PC12 細(xì)胞活力Tab.2 Viabilities of PC12 cells in various groups detected by MTT assay （n=3,±s,η/%）

表2 MTT 法檢測(cè)各組PC12 細(xì)胞活力Tab.2 Viabilities of PC12 cells in various groups detected by MTT assay （n=3,±s,η/%）

Group Control Ginger ELNs Green pepper ELNs Garlic ELNs Mushroom ELNs Lemon ELNs Yam ELNs Grape ELNs Tomato ELNs Broccoli ELNs Onion ELNs Concentration of ELNs[ρB/(mg·L－1)]0 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 Viability of PC12 cells 100.40±4.37 105.10±1.29 91.55±5.30 97.23±8.89 79.50±4.52 95.66±3.30 96.52±6.51 98.33±4.44 93.38±5.59 94.46±5.22 89.70±5.99

表3 不同濃度過(guò)氧化氫處理后PC12 細(xì)胞活力Tab.3 Viabilities of PC12 cells after treated with different concentrations of H2O2 （n=3,±s,η/%）

表3 不同濃度過(guò)氧化氫處理后PC12 細(xì)胞活力Tab.3 Viabilities of PC12 cells after treated with different concentrations of H2O2 （n=3,±s,η/%）

*P <0.05，**P<0.01 vs control group.

Group Control Concentration of H2O2（μmol·L－1）Viability of PC12 cells 50 100 200 300 400 500 600 700 800 100.00±2.84 96.19±1.91 96.45±2.12 97.27±0.62 93.58±4.51 96.91±1.92 83.50±11.80*74.93±8.30**34.87±9.40**23.87±3.90**

表4 過(guò)氧化氫和ELNs 作用后PC12 細(xì)胞活力Tab.4 Viabilities of PC12 cells after treated with H2O2 and ELNs （n=3,±s,η/%）

表4 過(guò)氧化氫和ELNs 作用后PC12 細(xì)胞活力Tab.4 Viabilities of PC12 cells after treated with H2O2 and ELNs （n=3,±s,η/%）

*P<0.05，**P<0.01 vs H2O2 group.

Group H2O2 H2O2+Hydrogen peroxide H2O2+Ginger ELNs H2O2+Green pepper ELNs H2O2+Garlic ELNs H2O2+Mushroom ELNs H2O2+Lemon ELNs H2O2+Yam ELNs H2O2+Grape ELNs H2O2+Tomato ELNs H2O2+Broccoli ELNs H2O2+Onion ELNs Viability of PC12 cells 100.30±4.55 58.64±0.25 29.57±0.24 79.72±0.39*52.88±0.49 50.86±0.31 84.84±0.65*70.36±4.51*57.78±0.11 59.94±0.94 73.79±0.34*36.70±0.16

3 討 論

氧化還原過(guò)程幾乎滲透從生物能學(xué)到代謝和生命功能的全部過(guò)程［13］。當(dāng)機(jī)體在受到有害刺激時(shí)，體內(nèi)自由基增加或抗氧化能力減弱，導(dǎo)致氧化-抗氧化系統(tǒng)失衡、氧化還原信號(hào)和控制的中斷或分子損傷［14］，從而積累過(guò)多的活性氧，損傷核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等生物大分子，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，引起多種疾病的發(fā)生［15］?？寡趸瘎┰诰S持人體健康、預(yù)防和治療疾病方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。因此，研究抗氧化劑對(duì)預(yù)防和治療與氧化應(yīng)激相關(guān)的疾病具有重要的作用。體外評(píng)價(jià)抗氧化能力是前期篩選抗氧化活性物質(zhì)的重要手段。

外泌體是一種小型的膜狀納米顆粒，可由多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞形成并分泌到細(xì)胞外環(huán)境中，能夠保護(hù)其內(nèi)部活性物質(zhì)在血液或組織液的遠(yuǎn)距離運(yùn)輸過(guò)程中不被降解，其膜上的特異性表面配體還能與受體細(xì)胞高度結(jié)合，參與細(xì)胞間的物質(zhì)和信息交換［16］。研究［17-20］顯示：與哺乳動(dòng)物細(xì)胞分泌的外泌體類似，ELNs 攜帶蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等，可反映來(lái)源細(xì)胞的生理和病理情況，在細(xì)胞間物質(zhì)交換和信息傳遞中發(fā)揮重要作用，但目前暫未見(jiàn)其體外抗氧化能力評(píng)價(jià)的相關(guān)報(bào)道。本研究采用差速離心法提取得到生姜、青椒、大蒜、蘑菇、檸檬、山藥、葡萄、番茄、西蘭花和洋蔥10 種ELNs，首次采用DPPH、ABTS 和FRAP 這3 種體外抗氧化評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)10 種ELNs 的抗氧化能力進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示：10 種ELNs 在3 種體外抗氧化體系中表現(xiàn)出不同的抗氧化能力，其中生姜、蘑菇、檸檬和洋蔥4 種ELNs 在3 種體外抗氧化評(píng)價(jià)體系中均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化能力。

與體外化學(xué)測(cè)定的方法比較，抗氧化能力的體外細(xì)胞篩選實(shí)驗(yàn)更能模擬真實(shí)生物機(jī)體內(nèi)部環(huán)境，說(shuō)明抗氧化活性物質(zhì)的作用機(jī)制，因而更具有說(shuō)服力和發(fā)展前景，過(guò)氧化氫損傷模型是目前應(yīng)用最廣泛的細(xì)胞損傷模型［21］。本 研 究 采 用MTT 法 檢測(cè)10 種ELNs 對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞氧化損傷模型細(xì)胞活力的影響，結(jié)果表明：青椒、檸檬、山藥和西蘭花ELNs 作用后，PC12 細(xì)胞活力升高，上述ELNs 表現(xiàn)出顯著的保護(hù)作用。本課題組前期研究［22］證實(shí)：藍(lán)莓外泌體可以改善魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的肝癌HepG2 細(xì)胞和高脂飲食喂養(yǎng)的C57BL/6 小鼠的氧化應(yīng)激。在魚(yú)藤酮處理的肝癌HepG2 細(xì)胞中，藍(lán)莓外泌體預(yù)孵育加速了核紅細(xì)胞2 相關(guān)因子2（NF-E2-related factor 2， Nrf2）從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核的移位。此外，藍(lán)莓外泌體通過(guò)影響在高脂飼料喂養(yǎng)小鼠肝細(xì)胞胞漿和胞核中Nrf2 的分布，改善胰島素抵抗和肝細(xì)胞功能障礙，調(diào)節(jié)抗氧化基因的表達(dá)。研究［23］顯示：氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)可相互作用，氧化應(yīng)激可誘發(fā)炎癥反應(yīng)，炎癥是氧化應(yīng)激的重要下游反應(yīng)，可以進(jìn)一步加速氧化應(yīng)激的過(guò)程。研究［24］顯示：花椰菜外泌體可以介導(dǎo)腺苷-磷酸激活蛋白激酶（adenosine 5'-monophosphate-activated protein kinase，AMPK）抑制樹(shù)突狀細(xì)胞的激活達(dá)到防治結(jié)腸炎的目的。從香菇中提取得到的外泌體能通過(guò)抑制NOD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3） 炎癥小體的活化減輕D-半乳糖胺/脂多糖誘導(dǎo)的小鼠肝功能損傷［14］。西柚外泌體能被腸道巨噬細(xì)胞選擇性吸收并抑制腸道 巨 噬 細(xì)胞 產(chǎn) 生 白細(xì) 胞 介 素1β （interleukin-1β，IL-1β）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），從而改善硫酸葡聚糖鈉鹽（dextran sulfate，DSS）誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎［25］。葡萄外泌體被小鼠腸道巨噬細(xì)胞攝取，誘導(dǎo)抗氧化基因表達(dá)和抑制促炎細(xì)胞因子［26］。柑橘外泌體可以改變與炎癥相關(guān)的細(xì)胞間黏附分子1（inter cellular adhesion molecule-1， ICAM-1） 等基因表達(dá)，有助于限制炎癥刺激，并通過(guò)增加閉合蛋白來(lái)恢復(fù)功能屏障［27］，上述研究結(jié)果均提示ELNs 具有潛在的直接或間接抗氧化活性。

綜上所述，本研究選取不同機(jī)制為基礎(chǔ)的3 種評(píng)價(jià)方法共同觀察10 種ELNs 的體外抗氧化能力，3 種方法檢測(cè)的結(jié)果具有高度一致性，同時(shí)也采用了細(xì)胞損傷模型模擬體內(nèi)真實(shí)氧化應(yīng)激環(huán)境，但本研究仍存在不足之處，如過(guò)氧化氫細(xì)胞損傷模型無(wú)法模擬生理?xiàng)l件下的多條氧化途徑，10 種ELNs 內(nèi)在組成有待深入研究，其發(fā)揮作用的活性成分及其體內(nèi)抗氧化作用機(jī)制尚未完全清楚，今后可根據(jù)本研究結(jié)果結(jié)合體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)深入探討ELNs 的抗氧化途徑和具體作用機(jī)制。