李志杰

(國(guó)藥同煤總醫(yī)院內(nèi)分泌科,山西 大同 037009)

糖尿病足病是糖尿病患者常見的嚴(yán)重慢性并發(fā)癥之一[1],患者常出現(xiàn)局部神經(jīng)異常,伴有下肢遠(yuǎn)端外周血管病變相關(guān)的足部感染、潰瘍和(或)深層組織破壞[2]。其發(fā)病原因包括感覺運(yùn)動(dòng)和自主神經(jīng)病變、周圍血管病變、關(guān)節(jié)活動(dòng)受限和局部壓力增加[3]。糖尿病足病患者易出現(xiàn)糖尿病足潰瘍(DFU),若潰瘍并發(fā)感染將影響傷口愈合。傷口愈合是一個(gè)復(fù)雜而有序的過程,包括凝血、炎癥、細(xì)胞增殖和組織重塑四個(gè)互有重疊的階段[4],其中新生血管的形成十分關(guān)鍵,其能夠提供氧氣和營(yíng)養(yǎng)、促進(jìn)碎片清除和傷口愈合[5]。

微小RNA(miRNAs)是一種內(nèi)源性非編碼小RNA,長(zhǎng)度約為18～25個(gè)核苷酸,通過特異性結(jié)合下游靶mRNA的3′UTR區(qū)域來調(diào)節(jié)基因表達(dá)[6]。有研究[7]表明,糖尿病影響miRNAs表達(dá),而miRNAs與糖尿病微血管和大血管并發(fā)癥的發(fā)生密切相關(guān)。有研究[8]報(bào)道,miR-30b-5p在胰島素敏感和胰島素抵抗人群的皮下脂肪組織中呈差異性表達(dá),提示miR-30b-5p可能在糖尿病發(fā)生過程中起作用。臂板蛋白3A多肽(Sema3A)是Sema家族的成員,其家族已鑒定出20多種類型[9],Sema3A在心臟發(fā)育、血管生成、腫瘤轉(zhuǎn)移、破骨細(xì)胞生成和免疫調(diào)節(jié)中均發(fā)揮作用[10]。本研究以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVECs為研究對(duì)象,觀察miR-30b-5p是否通過Sema3A影響HUVECs細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移與血管形成,旨在為糖尿病足病傷口愈合機(jī)制的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVECs購自美國(guó)模式培養(yǎng)物研究所;FBS、1%青霉素/鏈霉素均購自美國(guó)Gibco公司;DMEM培養(yǎng)基、Trizol購自美國(guó)Invitrogen公司;高糖(25 mmol·L-1)購自美國(guó)Sigma公司;CCK-8溶液及凋亡試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;Matrigel購自Becton-Dickinson公司;RNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司;SuperScript Ⅳ試劑盒、PowerUpTMSYBRTMGreen Master mix均購自美國(guó)賽默飛公司;熒光素酶載體pGL3及雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購自普洛麥格生物技術(shù)有限公司。LiPofectamine 2000購自美國(guó)Invitrogen公司;mimic NC、miR-30b-5p mimic、pcDNA3.1-NC、pcDNA3.1-Sema3A均購自上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司;多功能酶標(biāo)儀購自美國(guó)BioTek公司;流式細(xì)胞儀及ABI ViiA 7 System均購自美國(guó)賽默飛公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與處理

HUVECs細(xì)胞用正常葡萄糖(5 mmol·L-1)或高糖(25 mmol·L-1)添加10% FBS和1%青霉素/鏈霉素DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

HUVECs細(xì)胞進(jìn)行6種不同處理:blank組:正常葡萄糖培養(yǎng)的HUVECs細(xì)胞;HG組:高糖培養(yǎng)的HUVECs細(xì)胞;HG+mimic-NC組:高糖培養(yǎng)HUVECs細(xì)胞轉(zhuǎn)染mimic-NC;HG+mR-30b-5p mimic:高糖培養(yǎng)HUVECs細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-30b-5p mimic;HG+miR-30b-5p mimic+oe-NC組:高糖培養(yǎng)HUVECs細(xì)胞共轉(zhuǎn)染miR-30b-5p mimic及pcDNA3.1-NC;HG+miR-30b-5p mimic+oe-Sema3A組:高糖培養(yǎng)HUVECs細(xì)胞共轉(zhuǎn)染miR-30b-5p mimic及pcDNA3.1-Sema3A。

1.2.2 CCK-8實(shí)驗(yàn)

各組以3000 個(gè)·孔-1細(xì)胞密度接種于96孔板中,待細(xì)胞貼壁后,培養(yǎng)0、12、24、48、72 h后加入10 μL CCK-8溶液處理1 h。使用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定各孔450 nm處的OD值。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)

各組細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化后按照細(xì)胞凋亡試劑盒說明書,用500 μL結(jié)合緩沖液將細(xì)胞重懸,依次向細(xì)胞中加入Annexin V(5 μL)和PI(10 μL),并在室溫下避光孵育10 min。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡,ModFiLT軟件(4.1版本)分析細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

各組以5×105個(gè)·孔-1細(xì)胞密度接種于六孔板中,培養(yǎng)至約100%融合后使用100 μL無菌微量移液器吸頭進(jìn)行劃痕,用PBS清洗細(xì)胞2次,并用無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。在劃痕后0、24 h分別在相同位置用倒置顯微鏡拍照,每組采集3個(gè)獨(dú)立視野圖像。使用ImageJ軟件對(duì)劃痕的寬度進(jìn)行定量,評(píng)估遷移情況。

1.2.5 血管形成實(shí)驗(yàn)

24孔板中加入100 μL液化Matrigel,將孔板置于37 ℃下,直至Matrigel凝固。然后,將各組細(xì)胞接種于24孔板中。8 h后,使用倒置顯微鏡觀察HUVECs的管狀分枝形成情況并拍照。使用ImageJ軟件對(duì)血管的分枝數(shù)目及長(zhǎng)度進(jìn)行量化。

1.2.6 實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)

各組以1×105個(gè)·孔-1細(xì)胞密度接種于6孔板中,RNA提取試劑盒提取總RNA,SuperScript IV試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,PowerUpTMSYBRTMGreen Master mix和ABI ViiA 7 System進(jìn)行qRT-PCR。PCR條件:95 ℃初始變性120 s,95 ℃變性15 s,60 ℃延伸60 s,循環(huán)40次。用2-ΔΔCT方法[11]進(jìn)行定量,U6作為miR-30b-5p的內(nèi)參,GAPDH作為Sema3A的內(nèi)參。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.7 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

于Starbase(https://starbase.sysu.edu.cn/)、Targetscan(http://www.targetscan.org/vert_72/)、miRDB(http://mirdb.org/)網(wǎng)站進(jìn)行miR-30b-5p和Sema3A的靶向結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)分析,將結(jié)合序列及突變的序列分別克隆至熒光素酶載體pGL3中構(gòu)建野生型(Sema3A-WT)和突變型(Sema3A-MUT)熒光素酶質(zhì)粒。將Sema3A-WT或Sema3A-MUT分別與miR-30b-5p mimic或mimic NC共轉(zhuǎn)染至HUVECs細(xì)胞中,48 h后收集細(xì)胞,用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒評(píng)估熒光素酶活性。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS21.0軟件和GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。所有數(shù)據(jù)均采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示;2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);多組間比較采用單因素方差分析,采用Tukey檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-30b-5p逆轉(zhuǎn)高糖對(duì)HUVECs細(xì)胞的影響

qRT-PCR結(jié)果顯示,HG組miR-30b-5p表達(dá)較blank組更低,而HG+miR-30b-5p mimic組miR-30b-5p的表達(dá)較HG+mimic-NC組更高(均P<0.05)。見圖1A。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,HG組較blank組細(xì)胞活力更低,HG+miR-30b-5p mimic組細(xì)胞活力較HG+mimic-NC組更高(均P<0.05)。見圖1B。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,HG組細(xì)胞較blank組細(xì)胞凋亡率更高,HG+miR-30b-5p mimic組細(xì)胞凋亡率較HG+mimic-NC組更低(均P<0.05)。見圖1C。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示,HG組細(xì)胞較blank組細(xì)胞遷移能力更低,HG+miR-30b-5p mimic組細(xì)胞遷移能力較HG+mimic-NC組更高(均P<0.05)。見圖1D。血管生成實(shí)驗(yàn)顯示,HG組分枝數(shù)量較blank組血管生成能力更少,HG+miR-30b-5p mimic組分枝數(shù)量較HG+mimic-NC組更多(均P<0.05)。見圖1E。

A:qRT-PCR實(shí)驗(yàn);B:CCK-8實(shí)驗(yàn);C:流式細(xì)胞術(shù);D:細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn);E:血管生成實(shí)驗(yàn)。1組:blank組;2組:HG組;3組:HG+mimic-NC組;4組:HG+mR-30b-5p mimic組。*P<0.05。

2.2 miR-30b-5p靶向抑制Sema3A

3個(gè)網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-30b-5p的下游靶基因數(shù)目及交集情況,見圖2A。miR-30b-5p與Sema3A的結(jié)合位點(diǎn),見圖2B。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示,miR-30b-5p與Sema3A具有靶向結(jié)合關(guān)系(P<0.05)。見圖2C。qRT-PCR結(jié)果顯示,HG組Sema3A mRNA表達(dá)水平較blank組更高,而HG+miR-30b-5p mimic組Sema3A mRNA表達(dá)水平較HG+mimic-NC組更低(均P<0.05)。見圖2D。

A:3個(gè)網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-30b-5p的下游靶基因情況;B:miR-30b-5p與Sema3A的結(jié)合位點(diǎn);C:雙熒光素酶實(shí)驗(yàn);D:qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。1組:blank組;2組:HG組;3組:HG+mimic-NC組;4組:HG+mR-30b-5p mimic組;*P<0.05。

2.3 過表達(dá)Sema3A部分抵消miR-30b-5p對(duì)高糖HUVECs細(xì)胞的保護(hù)作用

qRT-PCR結(jié)果顯示,HG+miR-30b-5p mimic+oe-Sema3A組Sema3A mRNA表達(dá)較HG+miR-30b-5p mimic+oe-NC組上調(diào)(P<0.05)。見圖3A。CKK-8結(jié)果顯示,HG+miR-30b-5p mimic+oe-Sema3A組細(xì)胞活力較HG+miR-30b-5p mimic+oe-NC組下降(P<0.05)。見圖3B。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,HG+miR-30b-5p mimic+oe-Sema3A組細(xì)胞凋亡率較HG+miR-30b-5p mimic+oe-NC組增加(P<0.05)。見圖3C。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示,HG+miR-30b-5p mimic+oe-Sema3A組細(xì)胞遷移能力較HG+miR-30b-5p mimic+oe-NC組更低(P<0.05)。見圖3D。血管生成實(shí)驗(yàn)顯示,HG+miR-30b-5p mimic+oe-Sema3A組分枝數(shù)量較HG+miR-30b-5p mimic+oe-NC組更少(P<0.05)。見圖3E。

A:qRT-PCR實(shí)驗(yàn);B:CCK-8實(shí)驗(yàn);C:流式細(xì)胞術(shù);D:細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn);E:血管生成實(shí)驗(yàn)。5組:HG+miR-30b-5p mimic+oe-NC組;6組:HG+miR-30b-5p mimic+oe-Sema3A組。*P<0.05與5組比較。

3 討論

作為細(xì)胞生理的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,miRNAs的紊亂可導(dǎo)致許多病理狀態(tài)[12]及疾病[13]。差異表達(dá)的miRNAs與2型糖尿病及其并發(fā)癥相關(guān)[14],故這些miRNAs可用于糖尿病及其并發(fā)癥診斷或治療的生物標(biāo)志物。DFU患者的內(nèi)皮細(xì)胞衰老且其血管生成能力不足[15],而內(nèi)皮細(xì)胞血管生成能力與高水平葡萄糖之間存在直接聯(lián)系[16]。大量研究[17-19]顯示,恢復(fù)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVECs的功能可以加速DFU的傷口愈合。本研究建立高糖HUVECs細(xì)胞模型,探討miR-30b-5p在HUVECs增殖、凋亡、遷移和血管生成中的作用。本研究發(fā)現(xiàn),高糖培養(yǎng)條件下miR-30b-5p表達(dá)水平顯著下降,且HUVECs細(xì)胞增殖、遷移和血管形成能力受到抑制,細(xì)胞凋亡率增加,而上調(diào)miR-30b-5p表達(dá)能夠部分逆轉(zhuǎn)HUVECs的增殖、凋亡、遷移、血管形成能力。這些研究提示,miR-30b-5p可能通過促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管形成影響DFU傷口愈合的發(fā)生發(fā)展。

Sema3A由結(jié)合受體neuropilin1和信號(hào)受體plexinA作為共受體,參與細(xì)胞遷移、血管生成等過程調(diào)節(jié)[20]。此外,ZHANG等[21]研究顯示Sema3A對(duì)糖尿病性骨病成骨分化能力具有調(diào)控作用。本研究結(jié)果顯示,高糖促進(jìn)Sema3A mRNA表達(dá),而過表達(dá)miR-30b-5p可抑制其mRNA表達(dá);同時(shí),雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示miR-30b-5p對(duì)Sema3A存在靶向調(diào)控關(guān)系。進(jìn)一步通過外源性過表達(dá)Sema3A發(fā)現(xiàn),過表達(dá)Sema3A可抑制HUVECs細(xì)胞增殖、遷移和血管形成能力,增加細(xì)胞凋亡率。這些研究表明miR-30b-5p靶向負(fù)調(diào)控Sema3A,Sema3A過表達(dá)可部分抵消miR-30b-5p對(duì)HUVECs增殖、遷移、凋亡和血管形成能力的作用。

綜上,本研究在細(xì)胞水平證實(shí)miR-30b-5p表達(dá)可減輕高糖誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞的損傷作用,且miR-30b-5p的這種作用可能是通過負(fù)調(diào)控Sema3A而實(shí)現(xiàn)的,這將為進(jìn)一步探討糖尿病足病防治機(jī)制研究提供理論基礎(chǔ)。然而,本研究局限于細(xì)胞水平,未來應(yīng)在動(dòng)物整體水平對(duì)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。