袁 曉，楊盼迪，王 斌

（1.廣東省粵北食藥資源利用與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/韶關(guān)學(xué)院生物與農(nóng)業(yè)學(xué)院，廣東 韶關(guān) 512005；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院/廣東省果蔬保鮮重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642）

【研究意義】芋頭（Colocasiaesculenta）是天南星科芋屬植物，起源于印度、馬來半島以及中國(guó)南方等熱帶地區(qū)［1］。芋頭在全球大部分地區(qū)均有栽培種植，其中以非洲和我國(guó)珠江流域的種植面積最大［2］。芋頭的主要食用器官是地下肉質(zhì)球莖，是非洲許多地區(qū)的主糧，在我國(guó)主要以菜用為主［3］。芋頭球莖中淀粉含量很高，食用風(fēng)味獨(dú)特，烹飪后口感軟糯香甜可口，深受消費(fèi)者喜愛［4］。但芋頭中的草酸含量也很高，每100 g 鮮芋頭的草酸含量可達(dá)574 mg［5］，草酸能與鈣離子結(jié)合形成草酸鈣，多以草酸鈣等草酸鹽的形式儲(chǔ)存植物體內(nèi)，在芋頭去皮、切分等前處理過程中，草酸鈣結(jié)晶會(huì)使接觸芋頭的皮膚產(chǎn)生紅腫、瘙癢難忍等過敏癥狀，給消費(fèi)者的食用帶來很多不便［6］。在生產(chǎn)基地或食品加工廠將芋頭切配好銷售，消費(fèi)者在購(gòu)買后無需再次加工處理，可有效避免消費(fèi)者皮膚過敏的發(fā)生、促進(jìn)芋頭的銷售。但切分好的芋頭（鮮切芋頭）在銷售過程中切面會(huì)發(fā)生褐變現(xiàn)象，表現(xiàn)出變黃、變褐等不良癥狀，嚴(yán)重降低鮮切芋頭的商品性，制約芋頭產(chǎn)業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展［7］。研究表明，鮮切果蔬表現(xiàn)出褐變癥狀主要有兩個(gè)方面的原因：一方面，果蔬感受到切割產(chǎn)生的損傷信號(hào)，會(huì)激活自身的防御系統(tǒng)誘導(dǎo)一些黃酮類物質(zhì)的合成積累，使鮮切果蔬的切面表現(xiàn)出黃褐色；另一方面，切割處理破壞了切面細(xì)胞的完整性，使細(xì)胞的區(qū)隔功能喪失，導(dǎo)致酚酶能與底物（主要是酚類物質(zhì)）直接反應(yīng)，從而形成黃褐色的化合物。另外，切割處理會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞膜脂過氧化反應(yīng)，使細(xì)胞膜的完整性和流動(dòng)性降低，增加了參與酶促褐變反應(yīng)的酶與底物的接觸機(jī)會(huì)，加劇酶促反應(yīng)［8-9］。因此，鑒定在鮮切芋頭褐變過程中起促進(jìn)作用的相關(guān)基因，并探究其表達(dá)與鮮切芋頭褐變的相關(guān)性，對(duì)于解析鮮切芋頭褐變發(fā)生機(jī)制、研發(fā)安全高效的鮮切芋頭褐變防控技術(shù)具有重要意義。

【前人研究進(jìn)展】近年研究表明，脂質(zhì)氧化是促進(jìn)鮮切果蔬褐變的重要原因［10］，尤其膜脂過氧化導(dǎo)致的細(xì)胞膜完整性和流動(dòng)性降低，使得底物和酶直接接觸，加速了酶促褐變反應(yīng)。丙二烯氧化物合成酶（Allene oxide synthase,AOS）是一種典型的細(xì)胞色素P450 酶，在脂肪酸氧化過程中具有重要作用，能促進(jìn)脂肪酸的氧化［11］。另外，植物AOS 是茉莉酸（Jasmonic acid,JA）合成途徑中的關(guān)鍵酶，AOS 以13(s)-氫過氧化亞麻酸為底物直接催化13(s)-氫過氧化亞麻酸生成12-氧-植物二烯酸，生成的產(chǎn)物隨后進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)經(jīng)過1 次還原和3 次氧化反應(yīng)最終生成JA；JA 作為信號(hào)分子傳遞機(jī)械損傷信號(hào)使植物對(duì)機(jī)械損傷作出反應(yīng)，也可以反饋調(diào)控AOS家族基因的表達(dá)［12］，植物中誘導(dǎo)AOS的表達(dá)可能也是一種防御反應(yīng)。植物AOS家族基因的表達(dá)受多種生物和非生物因素的誘導(dǎo)［13］，例如：鹽脅迫顯著誘導(dǎo)水稻AOS基因的表達(dá)，而aos突變體水稻對(duì)鹽脅迫的敏感性很低［14］；真菌性生物脅迫處理顯著誘導(dǎo)板栗AOS表達(dá)，在擬南芥中過表達(dá)板栗AOS1基因可顯著延緩樟疫霉（Phytophthora cinnamomi）病原菌的生長(zhǎng)，并促進(jìn)擬南芥的生長(zhǎng)［15］。在煙草中，傷信號(hào)能顯著誘導(dǎo)AOS基因的表達(dá)，過表達(dá)一個(gè)細(xì)胞質(zhì)定位的AOS基因能促進(jìn)傷誘導(dǎo)的JA 積累［16］；在擬南芥中突變一個(gè)AOS基因CYP74A，會(huì)阻斷傷信號(hào)誘導(dǎo)的JA 合成積累［17］?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】芋頭鮮切處理本身就是一種物理性的機(jī)械損傷，褐變可能是鮮切芋頭對(duì)傷信號(hào)的一種反應(yīng)。前期分析轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)時(shí)發(fā)現(xiàn)，在鮮切芋頭褐變過程中，許多與脂質(zhì)氧化和代謝相關(guān)基因的表達(dá)顯著上調(diào)。植物AOS在脂肪酸氧化和JA 合成過程中具有重要作用，但芋頭AOS1是否參與對(duì)傷信號(hào)的響應(yīng)，以及其表達(dá)是否與鮮切芋頭有關(guān)，目前尚未見相關(guān)研究報(bào)道。此外，植物AOS基因最先在亞麻中成功克隆，之后陸續(xù)在擬南芥、水稻、煙草等模式植物和一些經(jīng)濟(jì)作物中成功克隆了AOSs基因［18］，但尚未在芋頭中見到AOS基因克隆的研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為研究脂質(zhì)氧化代謝基因在鮮切芋頭褐變中的作用，本研究從鮮切芋頭中克隆AOS1基因的編碼序列（Coding sequence,CDS），通過分析AOS1基因在鮮切芋頭褐變過程中的表達(dá)變化，及抗褐變劑對(duì)其表達(dá)的影響，初步明確AOS1基因表達(dá)與鮮切芋頭褐變的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用芋頭球莖分別于2021 年11、12月購(gòu)自廣東省韶關(guān)市湞江區(qū)當(dāng)?shù)氐囊粋€(gè)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，品種為‘檳榔芋’。挑選個(gè)頭大小基本一致，無病蟲害和明顯機(jī)械傷的芋頭作為試驗(yàn)材料，自來水清洗干凈表面的泥沙，去皮并切分成厚度約1 cm 的薄片，備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 鮮切芋頭褐變?cè)囼?yàn) 將鮮切芋頭裝在一次性塑料托盤，每個(gè)托盤裝9 片，3 個(gè)重復(fù)共27 片；用一次性塑料薄膜保鮮袋密封包裝，分別放置在20 ℃和4 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中觀察褐變變化。20 ℃貯藏期間，依次在0、12、24 h 觀察褐變變化，每個(gè)重復(fù)中隨機(jī)取1 片芋頭作為代表拍照；4 ℃貯藏期間，每隔2 d 測(cè)定色度值，并每次隨機(jī)取3片芋頭作為分析樣品（每個(gè)重復(fù)取1 片）。

1.2.2 褐變抑制處理試驗(yàn) 試驗(yàn)設(shè)3 個(gè)處理，芋頭片分別用0.1 g/L 的肉桂酸（Cinnamic acid,CA）、乙醇酸（Glycolate,GA）和香草酸（Vanillic acid,VA）溶液浸泡30 min，用自來水浸泡30 min作為對(duì)照（CK）。撈出并瀝干鮮切芋頭表面的水分，用塑料薄膜保鮮袋密封包裝，放置在4 ℃低溫冰箱貯藏12 d。每個(gè)處理3 次重復(fù)共27 片鮮切芋頭，在處理0、12 d 分別收集樣品，送至北京百邁客生物科技有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。

1.2.3 鮮切芋頭表面L*值測(cè)定 使用CR-400 型色差儀（日本，柯尼卡美能達(dá)）測(cè)定鮮切芋頭表面的L*值（亮度），分別在芋頭切面的3 個(gè)不同部位測(cè)定，以3 次數(shù)據(jù)的平均值表示該片芋頭表面的亮度。

1.2.4 芋頭AOS1基因全長(zhǎng)克隆 使用北京天根生化科技有限公司的總RNA 提取試劑盒（產(chǎn)品編號(hào)：DP441）提取鮮切芋頭的總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。以芋頭cDNA 為模板，使用高保真Taq 酶，通過RT-PCR 法擴(kuò)增AOS1基因全長(zhǎng)序列。全長(zhǎng)克隆引物序列如下：正向引物5'-ATGGCTTCGGCCTCTCTCT-3'，反向引物5'-TCAGAAGGTCGCCCTCTTCAA-3'。PCR 擴(kuò) 增完成后，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，擴(kuò)增DNA 片段在確認(rèn)符合預(yù)期大小后，將PCR 產(chǎn)物回收并連接到pUCm-T 載體上，構(gòu)建重組克隆載體，并轉(zhuǎn)化DH 5α 感受態(tài)細(xì)胞。使用含有氨芐霉素的LB平板篩選陽性克隆，并再次通過菌落PCR 法鑒定克隆產(chǎn)物。

1.2.5 序列特性分析 根據(jù)測(cè)序序列推導(dǎo)出對(duì)應(yīng)的編碼蛋白序列，將蛋白序列提交至NCBI 數(shù)據(jù)庫中與擬南芥、煙草和番茄等模式植物的基因組比對(duì)，在相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)中找到AOS1 同源蛋白，使用DNAman 軟件繪制多序列比對(duì)圖。在Expasy 網(wǎng)站（https://www.expasy.org/）分析芋頭AOS1 蛋白的理化性質(zhì)。通過Plant-mPLoc 網(wǎng)站（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）預(yù)測(cè)芋頭AOS1 蛋白的亞細(xì)胞定位。使用芋頭AOS1 蛋白氨基酸序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫中Blast 同源蛋白，在Blast 結(jié)果中每種植物挑選一個(gè)AOS蛋白序列，使用MEGA 軟件中的鄰接法（Neiborjoining,NJ）構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.2.6AOS1表達(dá)分析 采用熒光定量PCR 法檢測(cè)鮮切芋頭褐變過程中AOS1表達(dá)變化，引物序列如下：正向引物5'-TTCCCCACCGTCATCAAGTG-3'，反向引物5'-GTCCTGATCTCCTCCGCAAG-3'。利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序檢測(cè)CA、GA 和VA 處理對(duì)AOS1表達(dá)的影響，結(jié)果用每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的片段數(shù)（Fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments,FPKM）值表示。

1.2.7 啟動(dòng)子上順式作用元件分析 根據(jù)克隆的AOS1基因cDNA 序列，在NCBI 數(shù)據(jù)庫中檢索同源基因（登錄號(hào)：mQL89524.1），找到翻譯起始密碼子（ATG）上游長(zhǎng)度為2 000 bp 左右的DNA 序列［19］。在PlantCARE 網(wǎng)站（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）預(yù)測(cè)啟動(dòng)子序列中的順式作用元件，根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果，使用TBtools 軟件繪制順式作用元件在啟動(dòng)子上的分布。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Microsoft Power Point 軟件繪圖，使用SPSS 22.0 軟件分析差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 鮮切芋頭在不同溫度下貯藏期間的褐變表現(xiàn)變化

為觀察鮮切芋頭在貯藏期間的褐變變化，以及明確低溫貯藏對(duì)鮮切芋頭褐變的抑制作用，將鮮切芋頭分別貯藏在20 ℃和4 ℃的環(huán)境下。在20 ℃貯藏期間，鮮切芋頭貯藏12 h 即產(chǎn)生輕微的變黃癥狀，在24 h 時(shí)切面明顯變黃，基本喪失了商品性（圖1A）；在4 ℃貯藏期間，鮮切芋頭褐變進(jìn)程較為緩慢，貯藏6 d 僅觀察到輕微的變黃癥狀，在12 d 時(shí)褐變癥狀才較為明顯（圖1B）。表明貯藏溫度是影響鮮切芋頭褐變的重要因素，4 ℃低溫貯藏可有效延緩鮮切芋頭褐變。但即使在4 ℃低溫貯藏期間，鮮切芋頭褐變?nèi)詴?huì)緩慢發(fā)展。因此，探究鮮切芋頭在低溫貯藏期間的褐變發(fā)生機(jī)制，對(duì)于研發(fā)安全高效的抗褐變技術(shù)，減少鮮切芋頭采后損失具有重要意義。

圖1 鮮切芋頭在不同貯藏溫度下的褐變變化Fig.1 Changes in browning of fresh-cut taros at different storage temperatures

2.2 芋頭AOS1 全長(zhǎng)序列克隆

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序組裝的芋頭AOS1基因的CDS 序列長(zhǎng)度為1 560 bp。為從鮮切芋頭中克隆AOS1全長(zhǎng)，以鮮切芋頭cDNA 為模板，采用RT-PCR法擴(kuò)增芋頭AOS1基因全長(zhǎng)序列。經(jīng)PCR 擴(kuò)增后在1 000～2 000 bp 間得到一條DNA 條帶（圖2A），表明初步擴(kuò)增到目的片段。將該片段回收，并連接至T 載上轉(zhuǎn)化大腸桿菌。挑選2 個(gè)單菌落，進(jìn)行菌落PCR 驗(yàn)證，結(jié)果（圖2B）顯示，從2個(gè)單克隆菌落中均擴(kuò)增出1 條約1 500 bp 長(zhǎng)度的DNA 條帶，表明回收產(chǎn)物成功與T 載連接，可用于測(cè)序鑒定。

圖2 AOS1 全長(zhǎng)序列的PCR 產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoregram of PCR product of AOS1 full-length sequence

2.3 芋頭AOS1 生物信息學(xué)分析

芋頭AOS1編碼519 個(gè)氨基酸，編碼的蛋白質(zhì)分子量大小為57.63 kD，理論等電點(diǎn)為8.68。氨基酸殘基中，60 個(gè)氨基酸帶負(fù)電荷，64 個(gè)帶正電荷。蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定指數(shù)為46.24，是一個(gè)不穩(wěn)定蛋白；脂肪指數(shù)為87.92，親水性指數(shù)為-0.108。Plant-mPLoc 分析結(jié)果顯示，芋頭AOS1 蛋白定位在葉綠體。

在擬南芥等模式植物中對(duì)具體基因的功能研究較為深入，基于已有文獻(xiàn)分析芋頭AOS1基因的潛在功能，比較芋頭AOS1 與其他植物AOS1蛋白的氨基酸序列一致性，結(jié)果（圖3）表明，芋頭AOS1 與同屬天南星科的浮萍（Spirodela intermedia）SiAOS1 的同源性最高，序列相似性為74.42%；與擬南芥（Arabidopsisthaliana）、煙草（Nicotianatabacum）和番茄（Solanum lycopersicum）等模式植物AOS1 蛋白的序列相似性較低，相似性分別為38.50%、67.41%和28.87%，與番茄SlAOS1 蛋白的序列相似性最低，與擬南芥AtAOS1 蛋白的氨基酸序列一致性差異最大。

圖3 植物AOS1 蛋白序列比對(duì)Fig.3 Sequence alignment of AOS1 proteins of plant

通過同源比對(duì)，篩選到與芋頭AOS1 蛋白同源性較高的植物AOS1 蛋白，利用他們構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析不同植物AOS1 蛋白間的親緣關(guān)系。同樣，芋頭AOS1 與同屬天南星科的浮萍SiAOS1的親緣關(guān)系最近，聚在同一分支（圖4）。盡管與擬南芥AtAOS1 和番茄SlAOS1 聚在一大支上，但他們之間的親緣關(guān)系很遠(yuǎn)，暗示著芋頭AOS1可能與擬南芥等模式植物AOS1 蛋白的功能有著較大差異。

圖4 幾種同源性較高的植物AOS1 蛋白系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.4 Phylogenetic analysis of AOS1 proteins in several plants with high homology

2.4 鮮切芋頭褐變過程中AOS1 表達(dá)變化

為探究芋頭AOS1基因表達(dá)在鮮切芋頭褐變過程中的作用，分析了其在鮮切芋頭褐變過程中的表達(dá)變化及其與褐變指標(biāo)的相關(guān)性。L*是一個(gè)亮度指示指標(biāo)，L*值越小，物體表面亮度越低。在低溫貯藏期間，鮮切芋頭的L*值逐漸降低（圖5A），表明切面的亮度在貯藏期間下降，鮮切芋頭發(fā)生了較嚴(yán)重的褐變現(xiàn)象（圖1）。AOS1的表達(dá)量在鮮切處理3 d 后迅速增加，表明鮮切處理誘導(dǎo)了AOS1表達(dá)。在低溫貯藏期間，AOS1的表達(dá)總體呈增加趨勢(shì)（圖5B）。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，L*值與AOS1表達(dá)呈明顯的負(fù)相關(guān)（圖5C）。

圖5 AOS1 基因在鮮切芋頭褐變過程中的表達(dá)Fig.5 Changes in expression of AOS1 gene during the browning process of fresh-cut taro

2.5 褐變抑制劑處理對(duì)AOS1 表達(dá)的抑制作用

CA、GA 和VA 是天然的褐變抑制劑，外源處理可有效抑制鮮切芋頭褐變［20］。分析0.1 g/L CA、GA 和VA 浸泡處理30 min 對(duì)AOS1表達(dá)的影響，結(jié)果（圖6）表明，處理12 d 后，對(duì)照（CK）中AOS1表達(dá)量是0 d 的3.71 倍，再次證實(shí)鮮切后AOS1表達(dá)量顯著增加；CA、GA 和VA 處理AOS1的表達(dá)量?jī)H為CK 的0.89、0.86 和0.29 倍，GA 和VA 處理中AOS1表達(dá)量顯著低于CK，表明褐變抑制劑處理能有效抑制AOS1表達(dá)，尤其VA 處理對(duì)AOS1表達(dá)的抑制作用最為強(qiáng)烈。這從另一個(gè)角度反映AOS1表達(dá)可能與鮮切芋頭褐變相關(guān)。

圖6 3 種褐變抑制劑處理對(duì)AOS1 基因表達(dá)的影響Fig.6 Effects of three browning inhibitors on AOS1 gene expression

啟動(dòng)子是感受環(huán)境變化并直接調(diào)控基因表達(dá)的重要元件［19］。AOS1在鮮切處理后表達(dá)量顯著增加，意味著鮮切處理產(chǎn)生的傷信號(hào)可能通過啟動(dòng)子中的響應(yīng)元件調(diào)控AOS1表達(dá)。為此，在芋頭基因組中查找到AOS1基因ATG 上游2 053 bp的DNA 序列，默認(rèn)該序列為芋頭AOS1基因的啟動(dòng)子序列，提交至PlantCARE 網(wǎng)站分析其上的順式作用元件。啟動(dòng)子序列中含有豐富的TATAbox 和CAAT-box 等啟動(dòng)子核心元件，證明查找的DNA 序列符合啟動(dòng)子特性，是AOS1基因的啟動(dòng)子序列。

AOS1基因啟動(dòng)子序列中含有豐富的逆境響應(yīng)元件，其中光響應(yīng)元件（P-box、TCCC-motif、Box 4、Sp1、GT1-motif、G-box 和GATA-motif）數(shù)量最多、共11 個(gè)，說明AOS1表達(dá)可能受光照的影響。此外，還鑒定到了多個(gè)植物激素響應(yīng)元件，如2 個(gè)赤霉素響應(yīng)元件（GARE-motif 和TATC-box）、4 個(gè)脫落酸響應(yīng)元件（ABRE）、4個(gè)水楊酸響應(yīng)元件（TCA-element）、1 個(gè)乙烯響應(yīng)元件（ERE）（圖7）。啟動(dòng)子中還含有多個(gè)反式作用因子結(jié)合元件，如4 個(gè)MYB 識(shí)別位點(diǎn)（MYB）、2 個(gè)MYC 轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別位點(diǎn)（Myc）和2 個(gè)WRKY 結(jié)合位點(diǎn)（W box），表明AOS1的表達(dá)還受轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。

圖7 芋頭AOS1 基因啟動(dòng)子中的逆境響應(yīng)元件Fig.7 Stress response elements in the promoter of taro AOS1 gene

3 討論

AOS 是脂質(zhì)氧化過程中的關(guān)鍵酶之一，也是通過脂質(zhì)氧化途徑合成JA 前體物質(zhì)的關(guān)鍵酶［21］。細(xì)胞膜脂過氧化是導(dǎo)致鮮切果蔬發(fā)生褐變的重要原因［22］。因此，克隆芋頭AOS1基因并分析其在鮮切芋頭褐變過程中的表達(dá)變化，明確其在鮮切芋頭褐變過程中的作用，對(duì)于挖掘關(guān)鍵基因資源具有重要意義。本研究成功克隆了芋頭AOS1基因，其編碼519 個(gè)氨基酸殘基。芋頭AOS1 與同屬天南星科的浮萍SiAOS1 的進(jìn)化關(guān)系最近，序列同源性最高，證明芋頭AOS1 屬于植物AOS家族。但與擬南芥、煙草AOS1 蛋白的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，說明不同植物AOS1 蛋白的生物學(xué)功能可能存在一定差異，暗示不同植物AOS1 功能的多樣性［23］。預(yù)測(cè)結(jié)果分析顯示芋頭AOS1 定位在葉綠體，與其他植物AOS1 蛋白的定位特性一致［24］。但芋頭AOS1 蛋白的亞細(xì)胞定位結(jié)果仍需進(jìn)一步通過試驗(yàn)確認(rèn)，因?yàn)橛箢^肉質(zhì)球莖是淀粉等養(yǎng)分的主要貯藏器官，葉綠體數(shù)量不會(huì)很豐富。

機(jī)械傷誘導(dǎo)植物合成積累酚和黃酮以及醌等褐色物質(zhì)，是植物對(duì)機(jī)械損傷作出反應(yīng)的一種自我防御機(jī)制［25］。植物AOS1表達(dá)也受到機(jī)械傷處理的誘導(dǎo)，但機(jī)械傷誘導(dǎo)AOS1表達(dá)與鮮切果蔬褐變的關(guān)系尚不明確。水稻中含有4 個(gè)AOSs基因，機(jī)械損傷能顯著誘導(dǎo)OsAOS1的表達(dá)，但未能誘導(dǎo)OsAOS4表達(dá)［26］。本研究中，鮮切芋頭AOS1在鮮切3 d 后急劇增加，表明切分等物理損傷誘導(dǎo)了芋頭AOS1表達(dá)。在隨后的低溫貯藏期間，芋頭AOS1表達(dá)量隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增加，且與L*值呈顯著負(fù)相關(guān)性。褐變抑制劑處理又能顯著抑制芋頭AOS1表達(dá)，尤其是香草酸處理。以上結(jié)果表明，AOS1表達(dá)與鮮切芋頭褐變密切相關(guān)。此外，我們還發(fā)現(xiàn)芋頭AOS1與木薯AOS1 的進(jìn)化關(guān)系也較近，芋頭和木薯的主要食用器官均是地下球莖，且在采后或切分后顏色會(huì)變黑變褐［27］。暗示著芋頭AOS1 和木薯AOS1 可能具有類似的功能，其在鮮切后褐變發(fā)生過程中具有重要促進(jìn)作用。

植物AOS家族基因的表達(dá)受多種因子的調(diào)控，啟動(dòng)子中的順式作用元件是響應(yīng)環(huán)境因子變化的重要元件。甘蔗AOS家族基因的啟動(dòng)子中存在光響應(yīng)、ABA 響應(yīng)、JA 響應(yīng)、厭氧、干旱等多種脅迫響應(yīng)元件［11］。與甘蔗AOS家族基因啟動(dòng)子相似，芋頭AOS1啟動(dòng)子中含有豐富的光響應(yīng)、植物激素（ABA、SA、JA、GA、乙烯）響應(yīng)等逆境響應(yīng)元件，表明機(jī)械傷誘導(dǎo)的激素信號(hào)在調(diào)控AOS1表達(dá)中發(fā)揮重要作用。在水稻葉片和莖中，紅光和遠(yuǎn)紅光能誘導(dǎo)OsAOS1和OsAOS4表達(dá)，其中OsAOS1的轉(zhuǎn)錄應(yīng)答迅速但短暫，而OsAOS4的轉(zhuǎn)錄應(yīng)答緩慢但持久，且OsAOS1的轉(zhuǎn)錄上調(diào)程度比OsAOS4高很多［26］。表明AOS1表達(dá)受光照調(diào)控，加之其表達(dá)與鮮切芋頭褐變的相關(guān)性，意味著其可通過調(diào)節(jié)光照控制鮮切芋頭褐變，為鮮切芋頭綠色高效褐變防控技術(shù)研發(fā)提供了思路。此外，芋頭AOS1啟動(dòng)子中還含有多個(gè)MYB、MYC 和WRKY 轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別位點(diǎn)，表明芋頭AOS1表達(dá)還受到MYB 等反式作用因子的調(diào)控，但具體的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)理尚需深入研究。

4 結(jié)論

本研究克隆到的芋頭AOS1屬于植物AOS 家族，芋頭AOS1 與同屬天南星科的浮萍SiAOS1的氨基酸序列一致性最高，與模式植物擬南芥等AOS1 蛋白的序列一致性較低，表明植物AOS家族基因可能具有豐富多樣的生物學(xué)功能。鮮切處理誘導(dǎo)芋頭AOS1表達(dá)，其表達(dá)與鮮切芋頭褐變呈明顯正相關(guān)，且褐變抑制劑處理能抑制其表達(dá)，證明AOS1表達(dá)可能與鮮切芋頭褐變有關(guān)。芋頭AOS1啟動(dòng)子中含有豐富的植物激素和環(huán)境響應(yīng)元件，以及反式作用因子結(jié)合位點(diǎn)，表明其表達(dá)受到轉(zhuǎn)錄因子和植物激素的調(diào)控。