袁慧情 胡佳敏 劉思溢 侯鑒基 吳科鋒 羅 輝 吳斌華 （廣東醫(yī)科大學(xué)，湛江 524023）

馬尾藻（Sargassum）是褐藻的一種，廣泛分布于 我國東海、南海，因其富含多種營養(yǎng)成分且具有一定的有益功效，廣泛用于食品和醫(yī)藥研究等［1］。馬尾藻多糖（sargassum polysaccharide，SP）是其主要成分，具有豐富的生物活性，包括抗氧化、抗癌、抗糖尿病、抗氧化等［2-5］。

目前SP 調(diào)控巨噬細(xì)胞抗炎作用的研究多集中于分析其影響的具體信號通路中，包括核因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、Janus 激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子（Janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT）等 炎癥通路［6］，例如，SP能通過下調(diào)p38和ERK的磷酸化以及NF-κB p50和p65的移位而抑制MAPK和NF-κB信號激活，從而發(fā)揮抗炎作用［7］。研究發(fā)現(xiàn)，SP能提高單核巨噬細(xì)胞的吞噬能力，促進(jìn)巨噬細(xì)胞增生和淋巴小結(jié)形成［8］。因此，選用小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7進(jìn)行研究。巨噬細(xì)胞是一種位于組織內(nèi)的白血球，源自單核細(xì)胞，在不同藥物刺激下極化為不同的功能表型［9-11］。由LPS 刺激激活為M1 表型，表現(xiàn)促炎活性，發(fā)揮促炎抑菌作用［12-13］。細(xì)胞由IL-4 刺激活化為M2 表型，表現(xiàn)抑炎活性，有利于促進(jìn)組織生長和愈合［14-16］。

除了誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化以外，脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）還能誘導(dǎo)細(xì)胞鐵死亡［17］。鐵死亡是一種鐵依賴性、區(qū)別于細(xì)胞凋亡、壞死、自噬的新型細(xì)胞程序性死亡方式［18］。不同于其他形式調(diào)控細(xì)胞死亡的分子特征，其用于描述一種由活性氧積累引起的依賴鐵的細(xì)胞死亡調(diào)控形式［19-20］。研究發(fā)現(xiàn)，LPS 除了引起巨噬細(xì)胞極化以外，還可劑量依賴性地增加細(xì)胞內(nèi)總鐵含量，F(xiàn)er-1 可使其恢復(fù)［21］；鐵死亡激活劑Erastin 可以通過激活STAT3 促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2 型極化增強上皮性卵巢癌的轉(zhuǎn)移能力［22］；此外，鐵死亡還能通過釋放和攝取致癌KRAS 蛋白促進(jìn)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞向M2 型極化，因此，巨噬細(xì)胞極化和鐵死亡之間存在密切聯(lián)系［23］。本研究重點探討SP 對LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞極化和鐵死亡這兩個因素的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 多糖來源 從硇洲島海岸采集的SP，用3.5%NaCl 溶液清洗，冷凍干燥，用水/乙醇（3∶7）在室溫下提取24 h，攪拌，過濾。隨后，提取物在減壓下濃縮，殘渣冷凍干燥，得到粗粉［24］。該海藻的憑證標(biāo)本保存于廣東醫(yī)科大學(xué)海洋醫(yī)藥研究院。

1.1.2 試劑及儀器 10%胎牛血清、cDNA 合成試劑盒［（賽默飛世爾科技（中國）有限公司，2279604CP、01071349）］；DMEM 完全培養(yǎng)基［（賽默飛世爾科技（中國）有限公司，8120365）］；LPS、CCK-8 試劑、PMSF、ROS 檢測試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限 公 司，022621210706、073020200930、ST506-2、011521210621）；AG RNAex Pro RNA 提取試劑（湖南艾科瑞生物工程有限公司，A3A0031）。

Epoch 酶標(biāo)儀（美國博騰儀器有限公司，Epoch）；傅里葉變換紅外光譜儀（日本島津公司，IRAffinity-1）；基因擴增儀（杭州柏恒科技有限公司，GE9612T）；熒光定量基因擴增儀（德國ANALYTIKJENA，qTOWER384G）；超分辨轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡（Olympus，Ixplore SpinSR）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 巨噬細(xì)胞株小鼠RAW264.7 來自本實驗室。細(xì)胞培養(yǎng)于含抗生素及10%胎牛血清的DMEM 完全培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2的孵箱中培養(yǎng)。細(xì)胞種板貼壁后，隨機分為4組：①空白對照組（blank control，BC 組）：細(xì)胞用DMEM 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，未加任何其他材料；②不同濃度SP組：細(xì)胞以含不同濃度SP 的DMEM 完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；③LPS 組：使用含終濃度為1 μg/ml LPS 的DMEM 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞；④SP+LPS 組：使用含有終濃度為1 μg/ml LPS 和不同濃度SP 的DMEM 完全培養(yǎng)基。細(xì)胞按各組要求加入相應(yīng)培養(yǎng)基后，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.2 紫外吸光度檢測 采用Epoch 酶標(biāo)儀在200～400 nm 對SP 進(jìn)行紫外吸光度分析，以判斷其純度及是否存在蛋白污染。

1.2.3 紅外分光光度法分析SP結(jié)構(gòu) 采用傅里葉變換紅外光譜儀對SP進(jìn)行紅外吸光度掃描檢測。

1.2.4 CCK-8 法檢測RAW264.7 細(xì)胞增殖情況

取對數(shù)生長期細(xì)胞計數(shù)，以5 000 個/孔均勻地接種于96 孔板，細(xì)胞貼壁后，分別用不同濃度的LPS、SP予以相應(yīng)處理；同時設(shè)置對照組，每個樣品6個重復(fù)孔。放入孵箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，每孔加入10 μl CCK-8 溶液，操作過程避光。放入孵箱繼續(xù)孵育2 h，避光輕微振蕩，待培養(yǎng)板內(nèi)結(jié)晶完全溶解后，酶標(biāo)儀于450 nm 處測定OD 值，并根據(jù)下列公式計算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率（%）=（實驗孔OD-空白孔OD）/（對照孔OD-空白孔OD）×100%

1.2.5 RT-qPCR RT-qPCR 試驗參考SUH 等［25］的實驗，取預(yù)處理、裝于6 孔板中的細(xì)胞，采用AG RNAex Pro RNA 提取試劑抽提細(xì)胞總RNA。采用cDNA 合成試劑盒合成cDNA，以基因擴增儀進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄操作，收集逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，使用熒光定量基因擴增儀進(jìn)行PCR 反應(yīng)，PCR 反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，95 ℃5 s，60 ℃ 30 s，40 個循環(huán)。以GAPDH 作為內(nèi)參，讀取各樣品Ct值，結(jié)果用2-ΔΔCt表示。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.6 Western blot 檢測 收集藥物干預(yù)后的細(xì)胞，使用加入PMSF 的細(xì)胞蛋白裂解液，冰上裂解，4 ℃、14 000 g離心20 min后，將蛋白樣品與5×上樣緩沖液按4∶1 體積混合，100 ℃煮沸10 min。通過SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5%脫脂奶粉封閉2 h 后，加入一抗（1∶1 000）4 ℃過夜孵育，TBST 洗滌3 次。二抗孵育1 h，TBST 洗膜3 次后，用免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）顯影。抗體來源見表2。

表2 抗體來源Tab.2 Antibody source

1.2.7 ROS 檢測 實驗操作參考HUANG 等［26］方法。在細(xì)胞中加入1 ml 含有稀釋DCFH 的PBS。實驗后37 ℃下孵育20 min，每隔3 min混合1次。然后用無血清DMEM培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次，最后以500 μl的PBS重懸。在超分辨轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡下觀察拍照，用Image J 計算出綠色熒光強度并對每組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗結(jié)果采用GraphPad Prism軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 紅外吸光度檢測結(jié)果 將分離的SP進(jìn)行紅外光譜分析，結(jié)果顯示，在3 087.83、1 520.14、1 183.61、1 061.94 cm-1處均顯示吸收峰，分別為-OH、C=O、CO 和C-O-C 的特征吸收峰。C=O 說明其中含有醛基，C-O-C 是吡喃糖的特征吸收峰，因此，可以判定SP為吡喃型多糖。見圖1。

圖1 SP紅外吸收掃描結(jié)果Fig.1 Infrared absorption scanning results of SP

2.2 紫外吸光度檢測結(jié)果 紫外吸光度顯示在280 nm 處無吸收峰，提示樣品中無蛋白類物質(zhì)，見圖2。

圖2 SP紫外吸收掃描結(jié)果Fig.2 Ultraviolet absorption scanning results of SP

2.3 SP 對LPS 處 理 的RAW264.7 細(xì) 胞 增 殖 的 影響 采用CCK-8 法考察細(xì)胞經(jīng)不同濃度SP 和不同濃度LPS 處理RAW264.7 細(xì)胞后增殖活性的變化，結(jié)果見圖3。圖3A顯示，與BC組比較，25～200 μg/ml組細(xì)胞增殖無顯著影響（P＞0.05），但400 μg/ml SP 對RAW264.7 組細(xì)胞的增殖率為113.5%，與BC 組比較顯著升高（P＜0.05），提示400 μg/ml SP 本身對RAW264.7細(xì)胞有促增殖作用。為避免多糖的促增殖功能，采用0、50、100、200 μg/ml 進(jìn)行后續(xù)實驗。采用不同濃度LPS 處理RAW264.7 細(xì)胞（圖3B），觀察LPS 對巨噬細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1、10、100 μg/ml LPS 對RAW264.7 細(xì)胞增殖有明顯抑制作 用，抑 制 率 分 別 為（89.83±5.00）%、（86.26±1.19）%、（2.04±4.24）%，與BC 組比較有明顯抑制作用（均P＜0.05），說明1、10、100 μg/ml LPS 對巨噬細(xì)胞增殖具有明顯抑制作用。參考文獻(xiàn)［27］，在后續(xù)實驗中采用1 μg/ml LPS進(jìn)行實驗。

圖3 SP及LPS對RAW264.7細(xì)胞增殖的影響Fig.3 Effects of SP and LPS on proliferation of RAW264.7 cells

進(jìn)一步觀察SP 對LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞損傷的保護(hù)情況（圖3C），結(jié)果顯示，25 μg/ml 濃度組細(xì)胞增殖抑制率為（76.05±15.41）%，與LPS 組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而50、100、200 μg/ml 濃度組 細(xì) 胞 活 力 分 別 為（88.86±2.64）% 、（89.92±2.14）%、（94.29±1.47）%，與LPS 組比較顯著升高（均P＜0.05）。這一結(jié)果說明高濃度的多糖對LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖抑制具有顯著保護(hù)作用。

2.4 SP對巨噬細(xì)胞極化的調(diào)控

2.4.1 SP 對巨噬細(xì)胞極化相關(guān)標(biāo)志物轉(zhuǎn)錄水平的影響 qPCR 結(jié) 果顯示：25、100、200 μg/ml SP 組CD163 轉(zhuǎn)錄水平分別是BC 組的0.55 倍（P＞0.05）、2.88 倍（P＜0.01）、11.90 倍（P＜0.01）；IL-10 轉(zhuǎn)錄水平分別是BC 組的2.67 倍（P＞0.05）、6.88 倍（P＜0.01）、4.44 倍（P＜0.01）；Arg-1 轉(zhuǎn)錄水平分別是BC組的0.90 倍（P＞0.05）、6.16 倍（P＜0.01）、12.17 倍（P＜0.01）；由此得出一定濃度的SP能使RAW264.7細(xì)胞的IL-10、CD163和Arg-1表達(dá)量升高。見圖4。

圖4 SP對IL-10、CD163和Arg-1的mRNA表達(dá)的影響Fig.4 Effect of SP on mRNA expressions of IL-10，CD163 and Arg-1

2.4.2 SP 對巨噬細(xì)胞極化相關(guān)標(biāo)志物的蛋白表達(dá)水平的影響 如圖5 所示，與BC 組比較，iNOS、CD86 的蛋白表達(dá)量均隨著SP 劑量的增加而降低，而IL-10在加入SP后蛋白表達(dá)量增加（P＜0.05）。結(jié)果與圖4 的趨勢一致。表明SP 單獨作用小鼠巨噬細(xì)胞，可能導(dǎo)致細(xì)胞向M2型極化。

圖5 SP對iNOS、IL-10、CD86蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effects of SP on protein expressions of iNOS，IL-10 and CD86

2.4.3 SP 拮抗LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞極化進(jìn)一步觀察SP 能否拮抗LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞M1 型極化，RT-qPCR 結(jié)果（圖6A）顯示，在經(jīng)過LPS 單獨處理后，M1 極化指標(biāo)CD80、iNOS 和TNF-α 的轉(zhuǎn)錄水平均顯著升高（P＜0.01），經(jīng)過LPS 和SP 處理后，相較于LPS 組各組均顯著降低（P＜0.05）。LPS 組CD80 的 轉(zhuǎn) 錄 水 平 升 高 為BC 組 的70.78 倍（P＜0.01），LPS 和25、100 μg/ml SP 處理以后，降低為BC組的37.46、44.40 倍（P＜0.01）；LPS 組iNOS 的轉(zhuǎn)錄水平升高到BC 組的33.69 倍（P＜0.01），經(jīng)過LPS 和25、100 μg/ml SP 處理以后，降低為BC 組的11.96、13.29 倍（P＜0.01）；LPS 組TNF-α 的轉(zhuǎn)錄水平升高為BC 組的14.14 倍（P＜0.05），LPS 和25、 100 μg/ml SP 處理以后，降低為BC 組的8.70、8.53 倍（P＜0.05）。M2 極 化 標(biāo) 志 物CD163 經(jīng) 過LPS 和25、100 μg/ml SP 處理后其轉(zhuǎn)錄水平顯著升高為BC 組的14.85、55.84倍（P＜0.05）。

圖6 SP對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞極化的影響Fig.6 Effects of SP on LPS-induced polarization of RAW264.7 cells

Western blot 結(jié)果顯示（圖6B），在經(jīng)過LPS 單獨處理以后，M1 極化相關(guān)標(biāo)志物iNOS 的蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），經(jīng)過LPS和SP處理以后顯著降低（P＜0.05）。BC 組和LPS 組的M2 極化標(biāo)志物Arg-1 表達(dá)均不明顯，因此無法進(jìn)行比較，但經(jīng)過LPS 和SP 處理后，其蛋白表達(dá)水平均增高并存在劑量依賴性（P＜0.05）。M2 極化標(biāo)志物IL-6 經(jīng)過LPS單獨處理以后，蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），經(jīng)過LPS 和SP 共同處理，與LPS 組相比IL-P 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）。SP 能拮抗LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞M1極化。

2.5 SP拮抗LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞鐵死亡

2.5.1 SP 對LPS 損傷RAW264.7 細(xì)胞內(nèi)ROS 的影響 如圖7 所示，與BC 組相比，1 μg/ml LPS 損傷細(xì)胞24 h 后細(xì)胞內(nèi)的ROS 水平明顯升高（P＜0.01），而SP處理后的細(xì)胞內(nèi)ROS相較于LPS組明顯降低（P＜0.01），并呈劑量依賴性。

圖7 DCFH-DA熒光探針檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平Fig.7 Intracellular ROS level was detected by DCFH-DA fluorescent probe

2.5.2 SP 對巨噬細(xì)胞內(nèi)鐵死亡相關(guān)基因GPX4 表達(dá)的影響 Western blot實驗分析細(xì)胞中GPX4蛋白的表達(dá)，結(jié)果如圖8 顯示，與BC 組比較，LPS 組中的GPX4蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）；經(jīng)25 μg/ml馬尾藻多糖處理后，GPX4 蛋白表達(dá)略微升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），劑量加大后，400 μg/ml SP 與LPS 組相比，GPX4 蛋白表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng) 計 學(xué) 意 義（P＜0.01）。SP 能 拮 抗LPS 引 起 的RAW264.7細(xì)胞GPX4蛋白表達(dá)水平升高，ROS水平升高。因此，SP能拮抗LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞鐵死亡。

圖8 LPS和SP對GPX4蛋白表達(dá)的影響Fig.8 Effects of LPS and SP on expression of GPX4 protein

3 討論

近年來，海洋藥物研究一直是國內(nèi)外研究的熱點，海洋生物由于生活環(huán)境的不同，與其他物質(zhì)相比，通常具有特殊化學(xué)結(jié)構(gòu)和獨特生物活性，比如抗氧化、抗衰老、抗炎、抗腫瘤、抗菌和神經(jīng)保護(hù)等作用［28-29］。其中，海洋藥物中許多萜類、生物堿、多糖類和多肽類等均具有抗炎活性，海藻多糖通常通過調(diào)控NF-κB、MAPK、JAK/STAT等信號通路發(fā)揮其抗炎作用，對海藻多糖的研究可以用于新型抗炎藥的研發(fā)或者作為新型抗炎藥的前體［30-31］。

巨噬細(xì)胞M2 極化有促進(jìn)細(xì)胞生長和組織修復(fù)的功能［32］。前期已有研究證明石斛多糖、枸杞多糖能通過促進(jìn)RAW264.7 細(xì)胞增殖作用來發(fā)揮其抗炎活性［33-34］，基于此，本實驗采用CCK-8法觀察SP各濃度對RAW264.7 細(xì)胞增殖的影響，選取對細(xì)胞增殖無明顯抑制作用的SP（25、50、100、200 μg/ml） 開展研究，發(fā)現(xiàn)各濃度SP促進(jìn)細(xì)胞增殖。研究結(jié)果表明，1 μg/ml LPS 對細(xì)胞增殖有顯著影響，因此在后續(xù)實驗中，均選取1 μg/ml LPS 進(jìn)行操作。此外，檢測SP 對LPS 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的影響。以1 μg/ml LPS刺激RAW264.7 細(xì)胞24 h，再用不同濃度的SP 處理細(xì)胞，50、100、200 μg/ml SP 能顯著拮抗LPS 引起的細(xì)胞活力下降。

結(jié)合其他“多糖通過調(diào)控小鼠單核巨噬細(xì)胞極化來發(fā)揮抗炎作用”的研究，比如黑靈芝多糖可顯著降低巨噬細(xì)胞吞噬能力并抑制IL-1β、NO 和ROS的生成，由此得出結(jié)論黑靈芝多糖能抑制RAW264.7 細(xì)胞的M1 極化而發(fā)揮抗炎作用［35］。本研究基于M1、M2 巨噬細(xì)胞活化相關(guān)的表面膜蛋白iNOS、CD80、TNF-α、IL-10、Arg-1、CD206 等作為活化指標(biāo)，qPCR、Wstern blot 結(jié)果均顯示：當(dāng)單獨給予SP 刺激RAW264.7 細(xì)胞，特異性M2 亞型巨噬細(xì)胞的膜蛋白高表達(dá)CD206，IL-10、Arg-1 等，而iNOS、CD80、TNF-α 等特異性M1 亞型巨噬細(xì)胞各指標(biāo)呈低表達(dá)，SP 通過活化巨噬細(xì)胞，分泌具有生物活性的細(xì)胞因子參與細(xì)胞的免疫功能，從而起到調(diào)節(jié)機體免疫的效應(yīng)［36］。

研究發(fā)現(xiàn)，LPS 能誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、非血紅素鐵和血紅素水平升高［37］。Ferrostatin-1 能通過抑制鐵死亡減輕LPS引起的急性肺損傷［38］。鐵死亡產(chǎn)生的主要原因是細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)活性氧生成與降解失衡，脂質(zhì)活性氧堆積，導(dǎo)致細(xì)胞氧化性死亡［39］。GPX4、Nrf2等可以通過限制細(xì)胞對鐵的攝入和減少ROS 的產(chǎn)生作為負(fù)性調(diào)節(jié)因子發(fā)揮抑制鐵死亡作用［40］。本實驗用LPS 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)GPX4 蛋白表達(dá)降低，ROS產(chǎn)生增加，因此得出LPS能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞鐵死亡［41］。再用不同濃度的馬尾藻多糖處理LPS誘導(dǎo)過的RAW264.7 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)馬尾藻多糖GPX4 的表達(dá)相比較于LPS 組顯著降低，ROS 的產(chǎn)生也明顯下降，充分說明馬尾藻多糖能通過抑制ROS 的產(chǎn)生來拮抗LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞鐵死亡。

總之，SP 能促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖，并保護(hù)LPS 引起的RAW264.7 細(xì)胞損傷。此外，它還通過抑制iNOS、TNF-α、CD80 和促進(jìn)IL-10、Arg-1、CD206 蛋白及轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，從而逆轉(zhuǎn)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞向M1 型極化，其作用機制與抑制iNOS、TNF-α、CD80 和促進(jìn)IL-10、Arg-1、CD206 蛋白及轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)有關(guān)。LPS 能通過抑制GPX4 蛋白表達(dá)、促進(jìn)ROS 產(chǎn)生來誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞鐵死亡，SP能逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象。由此說明SP能拮抗LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞鐵死亡，提示SP在抗炎方面具有巨大的開發(fā)潛力。為此，將進(jìn)一步探討SP炎癥保護(hù)作用的具體分子機制，尋找其他更有效的下游分子靶點及信號調(diào)控通路，為相關(guān)藥理研究和藥物開發(fā)提供理論依據(jù)。