楊穎穎 黃 瑾 劉新宇 邱 煒 （貴州醫(yī)科大學生物與工程學院， 貴陽 550000）

巨噬細胞是特異性及非特異性免疫的重要參與者，具有抗原提呈、維持組織穩(wěn)態(tài)、吞噬及降解等功能。在不同條件刺激下，巨噬細胞呈現(xiàn)出不同的表型，發(fā)揮的功能也不同，被稱為巨噬細胞的極化［1］。根據(jù)激活條件的不同，將其分為經(jīng)典途徑激活的M1 型和替代途徑激活的M2 型［2］。M1 型巨噬細胞可由IFN-γ 及LPS 誘導活化，高表達CD86、CD11c 等標志分子，分泌大量IL-12、iNOS、TNF-α 等細胞因子，但分泌IL-10 較少，具有促進炎癥發(fā)生、抗腫瘤等功能；M2 型巨噬細胞可由IL-4 及IL-13 等細胞因子誘導活化，高表達Arg-1 等標志分子，分泌大量IL-10、HIF-1、VEGF 等細胞因子，但分泌IL-12較少，具有促進損傷修復及腫瘤形成等功能［3-4］。存在于腫瘤組織中的巨噬細胞，即腫瘤相關巨噬細胞（tumor-associated macrophages，TAM），是腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）中數(shù)量最多的免疫細胞［5］。近年來，已有大量研究證明，TAM主要表現(xiàn)為M2 型巨噬細胞的特點，且有促進腫瘤細胞增殖、轉移、血管生成及免疫逃逸等作用［6-7］。

生理條件下，人體大多數(shù)組織的pH 穩(wěn)定在7.35～7.45。對多種惡性實體腫瘤的研究表明，大部分TME pH 波動在6.4～7.0，最低可至5.6［8-9］。代謝過程中乳酸的大量堆積被認為是TME 呈酸性的最主要原因。在正常生理條件下，乳酸濃度為1.5～3.0 mmol/L，在大部分實體腫瘤的TME中，乳酸濃度為10～20 mmol/L，少部分可達到30 mmol/L［10］。乳酸的來源為“Warburg 效應”，即無論氧氣充足與否，腫瘤細胞都傾向于有氧糖酵解作為主要的能量代謝途徑［11］。通過有氧糖酵解，葡萄糖被轉化為大量的乳酸。谷氨酰胺分解途徑，作為人體含量最多的氨基酸，谷氨酰胺常被腫瘤細胞攝取從而釋放能量，在這個過程中，乳酸作為副產(chǎn)物被大量堆積［12］。已有大量研究證實，TME 中的乳酸亦能促進腫瘤細胞的形成、血管生成及免疫逃逸［13］。然而，關于乳酸與TAM 之間相互作用的研究還比較少，相互作用機制還不甚明確，本研究將以此為出發(fā)點展開。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展是個極其復雜且漫長的過程，其產(chǎn)生的具體機制尚未研究清楚，缺乏特效藥物。VEGF、HIF-1 等細胞因子均能促進腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展［14-15］。近年來，隨著貝伐珠單抗、雷莫蘆單抗等針對VEGF 受體的靶向藥物及帕博麗珠單抗等免疫治療藥物的問世，腫瘤患者的生存率得到了明顯提高，惡性腫瘤治療進入了“免疫治療”時代。但巨噬細胞相關的免疫治療藥物還是空白。因此本研究篩選乳酸調(diào)控小鼠腹腔巨噬細胞M2 型極化的關鍵靶點分子，為巨噬細胞相關的腫瘤免疫治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 6～8 周齡雌性C57 小鼠（Mus musculus）購自貴州醫(yī)科大學動物實驗中心，已通過動物倫理審批（審批號：2000269）。Trizol RNA 分離試劑、Lipo3000（美國Thermo Fisher 公司）；流式抗體（美國BD公司）；TB Green試劑及逆轉錄試劑盒（日本寶生物公司）；FBS、OPTI-MEM 培養(yǎng)基（美國Gibco 公司）；Deionized Water 及BSA、可溶淀粉、Cell Counting Kit 8、PBS（北京索萊寶科技有限公司）；ELISA試劑盒（上海愛必信公司）；CO2培養(yǎng)箱、QuantStudio3 qPCR 儀（美國Thermo Fisher 公司）；流式細胞儀（美國艾森公司）；F-4600 熒光分光光度計（日本Hitachi公司）；精密酸度計（上海大普儀器有限公司）；倒置顯微鏡（德國Leica公司）。

1.2 方法

1.2.1 鼠腹腔巨噬細胞的分離及處理 將30 只C57 小鼠隨機分為3 組，每組10 只分開提取腹腔巨噬細胞。提取細胞前3 d 給每只小鼠腹腔注射含5%淀粉的生理鹽水0.5 ml，1 次/d。第3 天使其麻醉后引頸處死小鼠。75%乙醇消毒小鼠后，用RPMI1640 對小鼠進行腹腔灌洗并將灌洗液收集在50 ml 離心管中，800 r/min 離心5 min，棄上清液，得到細胞沉淀。配制含10%胎牛血清的培養(yǎng)基重懸細胞，平鋪于6 孔板內(nèi)，放入含5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，2 h后換液，去除未貼壁的細胞，即得到小鼠腹腔巨噬細胞。將純化后的小鼠腹腔巨噬細胞分為2 個組，分別加入下列培養(yǎng)基：RPMI1640 完全培養(yǎng)基（對照）；將1 mmol/L 乳酸加至RPMI1640 培養(yǎng)基，使培養(yǎng)基中乳酸的終濃度為20 mmol/L。各組處理24 h后收集細胞。

1.2.2 腹腔巨噬細胞的消化及活力檢測 吸棄上清，加入適量的Ⅳ型膠原酶，放入37 ℃含有5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中15 min，收集細胞懸液，800 r/min離心5 min棄上清，PBS漂洗后用完全培養(yǎng)基重懸。收集細胞至96 孔板中，每孔加入100 μl 的細胞懸液。每組做3個重復實驗；處理24 h后吸棄培養(yǎng)基，向每個孔中加入CCK-8 溶液10 μl；將培養(yǎng)板放入37 ℃含有5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中孵育2 h；用酶標儀檢測出每個孔在450 nm處的吸光度。

1.2.3 流式細胞術鑒定巨噬細胞 消化、收集細胞至1.5 ml離心管，調(diào)整細胞濃度為1×106個/100 μl，900 r/min 離心5 min，PBS 漂洗細胞，800 r/min 離心5 min，棄上清；1%BSA 重懸細胞，加入適量熒光標記抗體的染色緩沖液，冰上孵育20 min。PBS 漂洗細胞，800 r/min 離心5 min，300 μl PBS 重懸細胞后上流式細胞儀讀取數(shù)據(jù)。

1.2.4 qPCR 法檢測VEGF、HIF-1、Arg-1等基因轉錄水平變化 Trizol 法提取兩組細胞的總RNA，采用TaKaRa PrimeScript RT reagent Kit 逆轉錄試劑按說明書合成cDNA，-20 ℃保存待用。采用TaKaRa TB Green Premix Ex Taq Ⅱ檢 測 巨 噬 細 胞VEGF、HIF-1、Arg-1、IL-10等表達。反應體系總體積10 μl，其 中 包 括TB Green 5 μl、正 反 向 引 物 各0.4 μl、RNase Free dH2O 3.2 μl、cDNA 1 μl。擴增條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，72 ℃ 30 s，重復40個循環(huán)； 95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 h，95 ℃ 1 s，Tm 56 ℃。引物序列見表1。反應結束后，以β-actin 為參照，采用2-ΔΔCt法計算各基因的相對表達量。

表1 qPCR引物序列Tab.1 Primer sequences of qPCR

1.2.5 轉錄組學分析及qPCR 驗證 用Trizol 法提取各組細胞的總RNA。隨后通過Agilent 2100 bioanalyzer 精確檢測RNA 完整性，確定合格后得到后期轉錄組測序使用的totalRNA。以片段化的mRNA為模板，隨機寡核苷酸為引物，在M-MuLV逆轉錄酶體系中合成cDNA 第一條鏈。由dUTP 取代dNTPs中的dTTP，USER 酶降解含U 的cDNA 第二條鏈后進行PCR 擴增并獲得文庫。庫檢合格后，把不同文庫按照濃度及數(shù)據(jù)量的需求pooling 后進行Illumina測序。上述得到的單鏈環(huán)狀DNA 文庫即為Raw reads，隨后對其進行質(zhì)控，利用HISAT2 軟件將質(zhì)控后的clean reads 與參考基因組進行比對，獲取定位信息。利用subread 軟件中的featureCounts 工具統(tǒng)計每個基因從起始到終止范圍內(nèi)覆蓋的reads 數(shù)并進行過濾。然后對每個樣本分別進行基因表達水平的定量分析。應用edgeR 軟件，按ROBINSON等［16］的方法對定量分析結果進行統(tǒng)計學分析，定義差異基因篩選標準為|log2（fold change）|＞1，P＜0.05。據(jù)差異倍數(shù)大小及表達量高低選擇4 個基因Tpt1、Malat1、Hes6、Slc4a7 進行qPCR 驗證，校驗轉錄組數(shù)據(jù)可靠性，方法同1.2.4，引物序列見表2。

表2 部分差異表達基因qPCR驗證引物序列Tab.2 Primer sequences of some differentially expressed genes verified by qPCR

1.2.6 基因互作網(wǎng)絡圖的構建及關鍵差異表達基因的篩選 將篩選到的差異表達基因按數(shù)據(jù)庫編號，其與蛋白網(wǎng)絡互作數(shù)據(jù)庫進行STRING 比對后，按照confidence score＞0.7提取得到差異表達基因互作關系。利用Cytoscape軟件將篩選出的差異表達基因構建互作網(wǎng)絡圖，并按照節(jié)點數(shù)篩選關鍵基因。

1.2.7 siRNA 轉染及驗證 選擇蛋白互作節(jié)點數(shù)最多的兩個差異表達基因Malat1及Tpt1構建siRNA進行轉染。收集細胞平鋪于6 孔板上，以每個視野細胞融合率在70%～80%為佳；轉染前1 h 將培養(yǎng)基更換為OPTI-MEM。采用250 μl DEPC 水稀釋目的基因siRNA（由上海吉熒生物技術有限公司合成，序列見表3），125 μl DEPC水稀釋NC siRNA。在250 μl OPTI-MEM 中加入4 μl Lipo3000，充分混勻后室溫孵育5 min，制成溶液1；在250 μl OPTI-MEM 中加入6.5 μl 上述稀釋好的siRNA，制成溶液2；將溶液1和溶液2 充分混合，室溫靜置15 min；將混合孵育好的溶液1和溶液2加入細胞培養(yǎng)孔內(nèi)，再加入1.5 mlOPTI-MEM 培養(yǎng)基，即每個孔的總液體量為2 ml。轉染6 h 后，更換為含10%血清的1640 培養(yǎng)基，24 h后收取細胞。提取一部分轉染后細胞的總RNA 并逆轉錄。以上述逆轉錄的cDNA 為模板，檢測Tpt1及Malat1的表達水平，計算出轉染效率。再次處理剩余的轉染后細胞，qPCR 法檢測轉染后巨噬細胞Arg-1、VEGF、CD11c等基因的相對表達量變化情況。

表3 siRNA序列Tab.3 siRNA sequences

1.3 統(tǒng)計學方法 采用GraphPad Prism8 軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以±s形式表示。組間比較使用獨立樣本t檢驗，P＜0.05 即代表差異有統(tǒng)計學意義。GO 分析使用Metascape 軟件，KEGG 分析采用cluster Profiler R package 軟件檢驗差異表達基因在KEGG 通路中的統(tǒng)計富集性，校正P＜0.05 被認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 小鼠巨噬細胞的鑒定 F4/80 及CD11b 是鼠源巨噬細胞的標志性表面標志物。流式細胞術結果顯示，獲得的小鼠腹腔細胞表達F4/80 的陽性率為97.40%，CD11b的陽性率為93.37%（P＜0.000 1），表明已成功獲得高純度的小鼠腹腔來源巨噬細胞（圖1）。

圖1 巨噬細胞表面標志物鑒定Fig.1 Identification of macrophage surface markers

2.2 乳酸對巨噬細胞活力的影響 結果顯示，隨著乳酸濃度增加，細胞活力也逐漸下降。在乳酸濃度為20 mmol/L 時，對細胞活力影響較小，且該濃度亦為大部分實體腫瘤TME 中的乳酸濃度。當乳酸濃度升至40 mmol/L 時，細胞活力明顯下降，細胞大量死亡。故本實驗選擇20 mmol/L 乳酸處理細胞（圖2）。

圖2 乳酸對巨噬細胞活力的影響Fig.2 Effect of lactic acid on macrophage activity

2.3 乳酸促進巨噬細胞的M2 型極化 M2 型巨噬細胞高表達Arg-1，同時分泌大量IL-10、VEGF及HIF-1α。通過qPCR 法檢測Arg-1、IL-10、VEGF及HIF-1α的相對表達量。結果顯示，Arg-1、IL-10、VEGF及HIF-1α的表達量均上調(diào)，表明乳酸能促進巨噬細胞的M2型極化（圖3）。

圖3 乳酸促進巨噬細胞的M2型極化Fig.3 Lactic acid promotes M2-type polarization of macrophages

2.4 轉錄組學分析

2.4.1 差異表達基因的篩選及GO 富集分析 與對照組相比，經(jīng)20 mmol/L 乳酸處理后，得到差異表達基因共6 295 個，其中上調(diào)基因2 690 個，下調(diào)基因3 605 個。GO 富集分析結果顯示，上調(diào)差異表達基因主要參與細菌防御反應、胞質(zhì)基因翻譯、胎盤發(fā)育等生物過程；核糖體、胞質(zhì)、核糖體亞單位等細胞組分；結構分子活性、核糖體結構組成、受體調(diào)節(jié)活性等分子功能（圖4A）。下調(diào)差異表達基因主要參與ncRNA 代謝、加工、核糖體生物合成等生物過程；核仁、前核糖體、小亞基加工體等細胞組分；RNA 催化活性、轉移酶活性、核酸酶活性等分子功能（圖4B）。

圖4 上調(diào)差異表達和下調(diào)差異表達基因的GO分析Fig.4 GO analysis of up-regulated and down-regulated differentially expressed genes

2.4.2 差異表達基因的KEGG 富集分析 KEGG富集分析結果顯示，上調(diào)差異表達基因主要富集在核糖體（mmu03010）、癌癥通路（mmu05200）、MAPK（mmu04010）、PI3K-Akt（mmu04151）等 信 號 通 路（圖5A）。下調(diào)差異表達基因主要富集在細胞因子受體相互作用（mmu04060）、嘌呤代謝（mmu00230）、NOD 樣受體信號通路（mmu04621）、自然殺傷細胞介導的細胞毒性（mmu04650）等信號通路（圖5B）。

圖5 上調(diào)差異表達基因和下調(diào)差異表達基因的KEGG分析Fig.5 KEGG analysis of up-regulated and down-regulated differentially expressed genes

2.4.3 差異表達基因的qPCR 驗證 根據(jù)差異倍數(shù)（|log2（fold change）|）的大小，選擇了排名靠前的上調(diào)表達基因Tpt1、Malat1和下調(diào)表達基因Hes6、Slc4a7進行qPCR 驗證。結果顯示，4 個基因qPCR結果與轉錄組測序結果趨勢一致（圖6）。

圖6 部分差異表達基因qPCR驗證Fig.6 Some differentially expressed genes were verified by qPCR

2.4.4 基因互作網(wǎng)絡圖的構建及關鍵差異表達基因的篩選 利用Cytoscape 軟件將篩選出的差異表達基因構建互作網(wǎng)絡圖（附圖1，www.immune99.com）。網(wǎng)絡圖中，與某基因相對應的蛋白相互作用的節(jié)點數(shù)越多，說明該基因可能在乳酸對巨噬細胞調(diào)控過程中發(fā)揮的功能越重要。篩選出關鍵上調(diào)差異表達基因Malat1、Tpt1、FADD、Per1、Gipr等（表4）。

表4 部分上調(diào)關鍵差異表達基因Tab.4 Some key up-regulated differentially expressed genes

2.5 關鍵基因驗證

2.5.1Tpt1和Malat1siRNA 有效片段的篩選 分別設計了2條針對小鼠Tpt1和Malat1基因的siRNA，同時采用與哺乳動物無關的siRNA 作為陰性對照（NC），qPCR 檢測轉染24 h 后巨噬細胞內(nèi)Tpt1和Malat1的 表 達。結 果 發(fā) 現(xiàn)，Tpt1siRNA-1 序 列 及Malat1siRNA-1 序列的抑制效果最明顯，抑制率分別為77%及81%（P＜0.01）。后續(xù)實驗均選取這兩個序列進行轉染（圖7）。

圖7 Tpt1及Malat1的 siRNA對其mRNA表達的影響Fig.7 Tpt1 and Malat1 siRNA and their effect on mRNA expressions

2.5.2Tpt1及Malat1對巨噬細胞極化的影響 結果顯示，抑制Tpt1及Malat1基因表達并再次進行乳酸處理后，巨噬細胞VEGF及Arg-1的表達出現(xiàn)下調(diào)，CD11c出現(xiàn)上調(diào)，表明乳酸對巨噬細胞M2 型極化的促進作用明顯下降（圖8、圖9）。

圖8 Tpt1對巨噬細胞極化的影響Fig.8 Effects of Tpt1 on polarization of macrophages

圖9 Malat1對巨噬細胞極化的影響Fig.9 Effects of Malat1 on polarization of macrophages

3 討論

巨噬細胞的極化受多種因素的調(diào)控，是一個動態(tài)轉化的過程，M1/M2 型只是人為將其極端化的兩種亞型。但實際上，巨噬細胞的亞型分類眾多，并不局限于M1 和M2。目前，比較公認的是高表達CD11c 和IL-12 者 鑒 定 為M1 型；高 表 達Arg-1、VEGF、HIF-1 及IL-10 者鑒定為M2 型［17］。因此，通過qPCR 實驗檢測CD11c、Arg-1、VEGF、HIF-1等基因相對表達量的變化來評估乳酸對巨噬細胞極化的影響。結果表明，20 mmol/L乳酸能上調(diào)巨噬細胞Arg-1、VEGF、HIF-1、IL-10等基因的表達，說明乳酸能促進小鼠巨噬細胞M2型極化。

通過轉錄組學技術分析了乳酸對小鼠巨噬細胞轉錄水平的影響，篩選出差異表達基因共6 295 個，其中上調(diào)基因2 690 個，下調(diào)基因3 605 個。GO 分析結果顯示，上調(diào)差異表達基因主要參與細菌防御反應、胞質(zhì)基因翻譯、結構分子活性、核糖體結構組成等。下調(diào)差異表達基因主要參與ncRNA 代謝、核糖體生物合成、核酸酶活性等。通過KEGG 分析發(fā)現(xiàn)，上調(diào)差異表達基因主要涉及PI3K-Akt、癌癥通路、MAPK 等信號通路。PI3K-Akt 通路即磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶通路，該通路被激活后能促進細胞增殖［18-19］。此外，PI3K-Akt 通路還可通過P13K/Akt/mTOR 途徑調(diào)節(jié)VEGF 蛋白合成，促進腫瘤血管生成［18，20］。而癌癥通路的激活能直接促進癌細胞的形成、發(fā)展及轉移，在惡性腫瘤形成及發(fā)展過程中有不可或缺的作用。MAPK 即絲裂原活化蛋白激酶，參與細胞有絲分裂、增殖及凋亡［21］。MAPK 的激活，促進了腫瘤細胞的增殖。同時，通過調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MOL/LPs）和聚焦黏附激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）的表達和活化，MAPK 參與了腫瘤細胞的遷移和浸潤，進一步促進腫瘤的轉移［22-23］。以上均說明乳酸能促進巨噬細胞中腫瘤相關通路的激活并促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。下調(diào)差異表達基因主要涉及NOD 樣受體、自然殺傷細胞介導的細胞毒性等信號通路。NOD 樣受體是參與天然免疫的一種特殊模式識別受體，可被巨噬細胞識別并呈遞給其他免疫細胞，啟動免疫應答［24］。自然殺傷細胞介導的細胞毒性，即ADCC 作用，通過自然殺傷細胞與癌細胞IgG的Fc部分結合，可殺滅癌細胞［25］。在乳酸微環(huán)境中，巨噬細胞的NOD 樣受體信號通路和ADCC、抗原呈遞功能被抑制，削弱了天然免疫應答，機體免疫功能受損，這可能是導致腫瘤細胞發(fā)生免疫逃逸的原因之一。

通過構建互作網(wǎng)絡圖，篩選出了Tpt1、Malat1等關鍵上調(diào)差異表達基因。Tpt1可編碼細胞質(zhì)蛋白TCTP（translationally controlled tumor protein）。通過Toll樣受體，TCTP可刺激趨化因子CXCL1（C-X-C Motif Chemokine 1）和CXCL2（C-X-C Motif Chemokine 2）的分泌以及中性粒細胞在TME 內(nèi)的聚集，從而減弱其抗腫瘤活性［26］。目前已有證據(jù)證實Tpt1 在多種腫瘤組織中過表達：在卵巢癌和宮頸癌中，Tpt1 的過表達能促進腫瘤細胞的轉移［27-28］；在胃癌組織中，過表達的Tpt1 可能通過調(diào)節(jié)細胞周期G1/S 轉換而促進胃癌的增殖、侵襲及遷移［29］。這說明Tpt1 與腫瘤關系密切，是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要參與者與促進者。Malat1 即肺腺癌轉移相關轉錄本1，是長鏈非編碼RNA 的一種，通過作用于SR 蛋白調(diào)控細胞周期從而發(fā)揮生物學作用。Malat1 在非小細胞肺癌、腎癌、膀胱癌、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌等組織中均呈高表達，能促進腫瘤組織的增殖、侵襲及轉移，敲低Malat1 的表達能夠抑制癌細胞增殖并促進其凋亡［30］：在乳腺癌中，通過激活PI3K-Akt 通路，Malat1能誘導Her-2 陽性細胞的EMT 樣表型，提高細胞侵襲力，從而促進乳腺癌細胞轉移［31］；在前列腺癌中，沉默Malat1 能使前列腺癌細胞恢復正常細胞的糖酵解表型，從而促進癌細胞的清除［32-33］。作為最早被發(fā)現(xiàn)的長鏈非編碼RNA，Malat1 作為腫瘤進展和轉移的促進劑的作用是明確的。通過轉染實驗，分別驗證了Tpt1及Malat1表達被抑制后，乳酸能下調(diào)巨噬細胞VEGF、Arg-1表達，上調(diào)CD11c表達，這說明乳酸可能通過上調(diào)巨噬細胞Tpt1及Malat1表達從而促進其M2型極化。

綜上所述，基因Tpt1及Malat1可能為乳酸調(diào)控小鼠巨噬細胞M2 型極化的關鍵靶點分子。但本實驗僅為體外研究結果，下一步將通過構建腫瘤動物模型，進一步探討乳酸微環(huán)境中Tpt1及Malat1調(diào)控小鼠巨噬細胞M2 型極化的分子機制，以期為巨噬細胞相關的腫瘤免疫治療提供理論基礎及新思路。