鮑佳明 趙晨旭 孫凌云 趙 勇 （中國科學(xué)院動物研究所膜生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101）

巨噬細(xì)胞是一類專職的吞噬細(xì)胞和抗原遞呈細(xì)胞，是免疫系統(tǒng)的重要組成，廣泛參與病原體清除、炎癥反應(yīng)介導(dǎo)、組織微環(huán)境穩(wěn)態(tài)維持和修復(fù)等過程。巨噬細(xì)胞與人類許多疾病密切相關(guān)，包括癌癥、自身免疫病等［1］。此外，巨噬細(xì)胞也與移植物排斥反應(yīng)相關(guān)［2］。因此，以巨噬細(xì)胞為靶點(diǎn)的疾病治療策略具有巨大應(yīng)用潛力。巨噬細(xì)胞的基因工程改造手段受到廣泛關(guān)注。轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)作為改造細(xì)胞的一種重要手段廣泛用于科研和臨床。但巨噬細(xì)胞作為一種天然免疫細(xì)胞，一方面其胞內(nèi)有多種核酸酶和蛋白酶，能夠破壞外源核酸和蛋白結(jié)構(gòu)；另一方面在受到抗原或細(xì)胞因子刺激后迅速活化與極化，給巨噬細(xì)胞基因工程改造帶來挑戰(zhàn)。此外，由于巨噬細(xì)胞是終末分化細(xì)胞，幾乎不能進(jìn)行增殖。因此巨噬細(xì)胞改造時保證細(xì)胞活性十分重要。本文簡要介紹目前常用的幾種巨噬細(xì)胞基因工程改造方法，并分析其優(yōu)缺點(diǎn)，展望基因工程改造巨噬細(xì)胞在治療腫瘤、自身免疫病等疾病和抗移植物排斥反應(yīng)方面的應(yīng)用前景。

1 巨噬細(xì)胞改造方法

目前常用的巨噬細(xì)胞基因工程改造方法包括脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、電轉(zhuǎn)染法、腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus，AAV）轉(zhuǎn)導(dǎo)法、慢病毒（lentivirus，LV）轉(zhuǎn)導(dǎo)法和生物材料法，各種改造方法均存在其優(yōu)缺點(diǎn)，以下進(jìn)行簡要介紹（表1）。

表1 巨噬細(xì)胞改造方法及其優(yōu)缺點(diǎn)Tab.1 Methods of macrophage editing and their advantages and disadvantages

1.1 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法 將外源核酸片段通過主動或被動方式導(dǎo)入宿主細(xì)胞的過程稱為轉(zhuǎn)染。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法是利用帶正電荷的陽離子人工雙層膜結(jié)構(gòu)通過靜電作用包裹帶負(fù)電荷的核酸從而形成脂質(zhì)體，再通過膜融合方式將外源核酸序列傳遞到細(xì)胞中，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞改造。與病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)或電轉(zhuǎn)染法相比，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染具有操作簡便、成本低、安全性高和細(xì)胞毒性小等特點(diǎn)。但巨噬細(xì)胞對脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染不敏感，難以使用脂質(zhì)體對其進(jìn)行轉(zhuǎn)染［3］。主要原因?yàn)椋孩倬奘杉?xì)胞膜上含有大量糖蛋白，不利于膜融合；②巨噬細(xì)胞內(nèi)含有核酸酶，易破壞外源核酸片段，此外，受到外源核酸刺激后，巨噬細(xì)胞會迅速活化，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞狀態(tài)發(fā)生變化；③巨噬細(xì)胞作為終末分化細(xì)胞，幾乎不能增殖，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞核膜完整性高，外源核酸片段很難入核進(jìn)行復(fù)制、轉(zhuǎn)錄［4］。

目前針對脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞效率低下這一技術(shù)瓶頸，研究人員從不同角度對脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染進(jìn)行了優(yōu)化。凋亡細(xì)胞會產(chǎn)生一類被稱為凋亡小體（apoBD）的囊泡，巨噬細(xì)胞能夠識別這類囊泡并以胞吞形式將apoBD 攝入細(xì)胞。根據(jù)這一特點(diǎn)，LAI等［3］通過在脂質(zhì)體中加入Ca2+和1，2，二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰絲氨酸（DOPS）模擬apoBD 結(jié)構(gòu)，借此增加巨噬細(xì)胞對脂質(zhì)體的主動攝取。但脂質(zhì)體大多帶正電荷，大劑量脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染會產(chǎn)生很強(qiáng)的細(xì)胞毒性。NOGUEIRA 等［5］在脂質(zhì)體中摻入中性二油酰磷脂酰膽堿（DOPC）緩解陽離子脂質(zhì)體的細(xì)胞毒性作用，在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)巨噬細(xì)胞MCL1基因沉默。隨著脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染條件不斷優(yōu)化，脂質(zhì)體作為一種新型的生物材料在靶向編輯巨噬細(xì)胞方面將發(fā)揮重要作用，這部分內(nèi)容將在后續(xù)生物材料章節(jié)中進(jìn)行介紹。

1.2 電轉(zhuǎn)染法 電轉(zhuǎn)染又稱電穿孔，指細(xì)胞膜在強(qiáng)電脈沖作用下形成小孔，親水性核酸、蛋白等分子通過這一小孔進(jìn)入細(xì)胞的過程［6］。隨后這些小孔重新關(guān)閉維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整性［7］。當(dāng)附加電場刺激超過閾值時，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)無法恢復(fù)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。電場閾值與細(xì)胞大小等多因素相關(guān)，而細(xì)胞形態(tài)、大小、結(jié)構(gòu)、狀態(tài)具有高度不均一性，這就解釋了為什么電轉(zhuǎn)染的細(xì)胞毒性較大，易造成細(xì)胞大量死亡。值得重視的是，巨噬細(xì)胞作為終末分化細(xì)胞，幾乎無法進(jìn)行增殖，巨噬細(xì)胞改造時需更加關(guān)注細(xì)胞活性狀態(tài)。單核細(xì)胞作為巨噬細(xì)胞前體，能夠有效誘導(dǎo)發(fā)育為巨噬細(xì)胞，且單核細(xì)胞具有一定增殖能力，因此研究人員將目光轉(zhuǎn)移到單核細(xì)胞基因編輯上。目前已通過優(yōu)化電轉(zhuǎn)程序成功實(shí)現(xiàn)了對單核/巨噬細(xì)胞系（RAW264.7、THP-1）和骨髓來源單核/巨噬細(xì)胞的基因編輯，且轉(zhuǎn)染效率達(dá)90%以上，存活率達(dá)70%以上［8］。需要注意的是，單核/巨噬細(xì)胞電轉(zhuǎn)染死亡率與轉(zhuǎn)染的核酸片段大小有關(guān)［9］。電轉(zhuǎn)染后，骨髓來源單核/巨噬細(xì)胞激活標(biāo)志物上調(diào)，說明電轉(zhuǎn)染在一定程度導(dǎo)致原代單核/巨噬細(xì)胞激活［8］。如何根據(jù)需要有效調(diào)控巨噬細(xì)胞激活可能是未來電轉(zhuǎn)染改造巨噬細(xì)胞的發(fā)展目標(biāo)之一。

盡管電轉(zhuǎn)染法存在高細(xì)胞毒性的弊端，但與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染相比，電轉(zhuǎn)染有極高的轉(zhuǎn)染效率及更高的基因整合率。電轉(zhuǎn)染能夠打開巨噬細(xì)胞核膜，從而增加外源核酸片段進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)的機(jī)會，提高編輯效率。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和電轉(zhuǎn)染法不適合需要持續(xù)表達(dá)外源基因的巨噬細(xì)胞改造，因?yàn)殡S機(jī)整合是一個低概率事件，難以篩選出穩(wěn)定表達(dá)外源基因的巨噬細(xì)胞群體，而游離于基因組外的核酸片段會發(fā)生失活、水解或丟失［10］。使用AAV 和LV 轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)改造巨噬細(xì)胞并持續(xù)表達(dá)外源基因是更優(yōu)選擇。

1.3 AAV 轉(zhuǎn)導(dǎo)法 轉(zhuǎn)導(dǎo)指通過病毒將一個宿主DNA 轉(zhuǎn)移到另一個宿主細(xì)胞引起基因重組的現(xiàn)象。AAV是一類結(jié)構(gòu)簡單的單鏈DNA細(xì)小病毒，基因組大小約為4.7 kb，為復(fù)制缺陷型，需要輔助病毒（通常為腺病毒）存在才能復(fù)制。AAV 具有強(qiáng)大的基因傳遞能力、較高的安全性和缺乏致病性等優(yōu)點(diǎn)，已作為臨床最有潛力的病毒載體受到關(guān)注。不同AAV 亞型由于受體不同，具有不同組織偏好性，能夠感染特定的組織細(xì)胞，如AAV2 能夠以硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPG）、人類成纖維細(xì)胞生長因子受體1（FGFR1）等作為受體，幾乎能夠感染人體所有細(xì)胞［11］。而AAV8 能夠識別層黏連蛋白受體，靶向感染肝臟細(xì)胞［12］。這種不同亞型病毒的不同組織偏好性無疑給AAV帶來了更高的應(yīng)用潛力。

限制AAV 應(yīng)用的原因之一是AAV 仍具有一定免疫原性（雖然免疫原性低于LV），引起人體免疫應(yīng)答，導(dǎo)致病毒很快被清除，使用AAV 對巨噬細(xì)胞進(jìn)行改造時尤其如此。巨噬細(xì)胞膜上的TLR2 能夠識別AAV 衣殼蛋白結(jié)構(gòu)；而巨噬細(xì)胞胞內(nèi)的TLR9 能夠識別AAV 核酸的CpG 區(qū)［13］。這些因素導(dǎo)致使用AAV 轉(zhuǎn)導(dǎo)巨噬細(xì)胞的效率降低或巨噬細(xì)胞活化或極化。研究發(fā)現(xiàn)，在AAV 基因組中加入1 個24 bp的含有4個CpG 區(qū)域的高度炎癥性寡脫氧核糖核苷酸（ODN）能夠有效降低TLR9 活性，原因可能為ODN 競爭性與TLR9 結(jié)合，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞TLR9 處于“無應(yīng)答”狀態(tài)，從而降低巨噬細(xì)胞對AAV 的免疫應(yīng)答［14］。通過對AAV 衣殼蛋白三重對稱軸附近的堿基進(jìn)行點(diǎn)突變能夠降低AAV 衣殼蛋白免疫原性，但過多的點(diǎn)突變可能導(dǎo)致衣殼蛋白無法正確 折疊［15］。第二，由于AAV病毒結(jié)構(gòu)簡單，導(dǎo)致AAV 能夠接入的外源片段較短（不能大于4.5 kb）［16］。第三，不同于慢病毒，AAV 基因組主要以附加體形式存在于宿主細(xì)胞核，不易整合進(jìn)入細(xì)胞基因組，導(dǎo)致AAV 在轉(zhuǎn)導(dǎo)分裂旺盛的細(xì)胞時易造成外源基因丟失［17］。最后，由于AAV 基因組是單鏈的，但轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞后，病毒基因組必須首先轉(zhuǎn)換為具有轉(zhuǎn)錄活性的雙鏈形式，這是AAV 載體轉(zhuǎn)基因表達(dá)中重要的限速步驟，而這一過程往往需要1～2 周時間。目前開發(fā)的自配對型AAV（scAAV）能夠解決這一問題，scAAV 基因組在進(jìn)入宿主細(xì)胞后能夠通過自我配對形成具有轉(zhuǎn)錄活性的雙鏈形式，加快外源基因表達(dá)［18］。雖然使用scAAV 可加快外源基因表達(dá)，但更長的病毒基因組會壓縮外源基因插入空間，導(dǎo)致能夠接入外源片段的長度進(jìn)一步縮短。

1.4 LV轉(zhuǎn)導(dǎo)法 LV整個生命周期完成需要3個基因參與：gag、pol和env。其中g(shù)ag基因編碼慢病毒結(jié)構(gòu)蛋白，pol基因負(fù)責(zé)將病毒基因組整合進(jìn)入宿主基因組，而env基因則負(fù)責(zé)編碼慢病毒包膜糖蛋白。LV 載體中使用水泡性口炎病毒糖蛋白編碼基因VSV-G替換慢病毒env蛋白。VSV-G 蛋白能識別低密度脂蛋白（LDL）受體，使LV 載體能夠識別并侵染多種細(xì)胞，提高LV 轉(zhuǎn)染效率［19］。經(jīng)過幾代發(fā)展，LV安全性基本得到了保證。

除安全性和轉(zhuǎn)染能力外，與AAV 載體相比，LV載體能穩(wěn)定地將其基因組整合到宿主細(xì)胞基因組，不會隨著細(xì)胞分裂導(dǎo)致外源基因丟失。LV 載體更偏好于將自己的基因組整合到轉(zhuǎn)錄基因下游區(qū)域，而非啟動子區(qū)域［20］。與啟動子區(qū)域相比，下游區(qū)域更穩(wěn)定，更有利于保證插入基因長期穩(wěn)定表達(dá)。LV能夠接受的外源基因片段長度為9 kb，是AAV 的2 倍。與AAV 相同的是，LV 也存在一定免疫原性。除TLR2 能夠識別其衣殼蛋白外，TLR7 和TLR9 能夠識別LV 的基因組RNA，導(dǎo)致Ⅰ型干擾素產(chǎn)生［21-22］。目前可通過將LV 與地塞米松等免疫抑制藥物聯(lián)用抑制Ⅰ型干擾素產(chǎn)生，從而提高LV 轉(zhuǎn)導(dǎo)效率［23］。需要注意的是，地塞米松可能導(dǎo)致巨噬細(xì)胞發(fā)生線粒體依賴性細(xì)胞凋亡，因此使用地塞米松提高LV 對巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率時需格外注意巨噬細(xì)胞活性［24］。除TLR 外，巨噬細(xì)胞存在SAMHD1 蛋白，能夠通過耗竭掉LV 逆轉(zhuǎn)錄所需的三磷酸核苷酸限制LV 逆轉(zhuǎn)錄過程。研究發(fā)現(xiàn)，包裝LV 過程中整合1 個病毒蛋白X（Vpx）使SAMHD1 蛋白失活，提高LV 對巨噬細(xì)胞的編輯效率［25］。有趣的是，使用shRNA 耗竭掉THP-1 細(xì)胞的SAMHD1 后，發(fā)現(xiàn)耗竭掉SAMHD1 不影響THP-1 正常免疫應(yīng)答，說明利用Vpx 使巨噬細(xì)胞SAMDH1 失活后，可能并不影響巨噬細(xì)胞的功能［26］。

1.5 生物材料法 近年生物材料表現(xiàn)出高可塑性、高容量、高安全性、高生物相容性、高轉(zhuǎn)染效率，使其越來越受到重視［27］。生物材料可依賴巨噬細(xì)胞主動吞噬能力促進(jìn)巨噬細(xì)胞對外源物質(zhì)的主動攝取。生物材料顆粒大小、所帶電荷和形狀都會影響巨噬細(xì)胞對其吞噬［28］。研究發(fā)現(xiàn)，生物材料大小控制為30 nm～3 μm有利于巨噬細(xì)胞攝取，生物材料過大或過小均影響巨噬細(xì)胞攝取效率［29］。YU 等［30］發(fā)現(xiàn)帶有強(qiáng)正電荷或強(qiáng)負(fù)電荷的生物材料能夠以更快速度被巨噬細(xì)胞吞噬。巨噬細(xì)胞優(yōu)先吞噬球狀生物材料顆粒，而桿狀或棒狀顆粒則不易被吞噬［31］。因此，包裝顆粒的選擇很大程度影響巨噬細(xì)胞對生物材料的攝取效率，從而影響編輯效率。

1.5.1 脂質(zhì)體 脂質(zhì)體類型生物材料是目前最常用的生物材料。與常規(guī)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染不同，作為生物材料的脂質(zhì)體需經(jīng)過改造增加其靶向性和轉(zhuǎn)染效率，同時延長其血液半衰期。研究發(fā)現(xiàn)，直徑小于85 nm的帶負(fù)電荷脂質(zhì)體可促進(jìn)單核/巨噬細(xì)胞對其吞噬；相反，大的帶正電荷的脂質(zhì)體更易引起單核/巨噬細(xì)胞激活［32］。目前臨床常用的DOPC 脂質(zhì)體經(jīng)過不同表面修飾后能夠促進(jìn)M2 型巨噬細(xì)胞或/和Na?ve 巨噬細(xì)胞向M1 型極化，為脂質(zhì)體治療疾病提供了新思路［33］。ANSELMO等［34］開發(fā)了一種扁平的圓形脂質(zhì)體，稱為“細(xì)胞背包”（cellular backpage，BPs），這種脂質(zhì)體能夠靶向單核細(xì)胞，BPs 接觸到單核細(xì)胞后不會被吞噬，而是緊緊附著于單核細(xì)胞，且不影響單核細(xì)胞趨化功能和向巨噬細(xì)胞分化的潛力。利用單核細(xì)胞的趨化功能將攜帶藥物的脂質(zhì)體通過單核細(xì)胞攜帶到炎癥組織，為治療炎癥性疾病提供了新策略。

1.5.2 無機(jī)納米材料 納米材料擁有廣泛的臨床疾病診斷和治療潛力。根據(jù)納米材料性質(zhì)可將其分為無機(jī)納米材料、有機(jī)納米材料和有機(jī)-無機(jī)雜化納米材料，其中無機(jī)納米材料由于高穩(wěn)定性、高可塑性受到青睞。目前常見無機(jī)納米材料又可分為量子點(diǎn)（包括碳量子點(diǎn)、硅量子點(diǎn)、鎘量子點(diǎn)，直徑2～20 nm）、納米二氧化硅（直徑20～80 nm）和金屬納米顆粒（直徑＜5.5 nm）等。研究發(fā)現(xiàn)，通過直接使用金屬納米顆粒、二氧化鈦或包裹某些物質(zhì)（IL-4、RGD 序列等）能夠靶向誘導(dǎo)組織巨噬細(xì)胞極化，用于治療急性肝炎、急性腎損傷或加快成骨和肌肉修復(fù)［35］。有趣的是，＜30 nm 的無機(jī)納米材料常用于誘導(dǎo)M2 型巨噬細(xì)胞極化，而＞100 nm 的無機(jī)納米材料則用于誘導(dǎo)M1 型巨噬細(xì)胞極化。碳納米材料可在體內(nèi)外引起巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組改變，從而引起巨噬細(xì)胞M1 或M2 型極化［36］。體外研究表明，巨噬細(xì)胞極化水平與碳納米材料處理濃度和時間相關(guān)［37］。因此需要根據(jù)目的選擇納米材料種類、大小及優(yōu)化使用濃度和時間，以達(dá)到最佳的巨噬細(xì)胞改造效果。

限制無機(jī)納米材料應(yīng)用的最大問題是其人體毒性，無機(jī)納米材料常在內(nèi)皮系統(tǒng)中積聚，導(dǎo)致長期人體毒性和靶向性減弱。值得注意的是，不同無機(jī)納米粒子聯(lián)用可能增強(qiáng)細(xì)胞毒性，TSUGITA 等［38］發(fā)現(xiàn)，使用二氧化硅和二氧化鈦同時處理巨噬細(xì)胞能夠激活Caspase-1炎癥小體，導(dǎo)致IL-1β產(chǎn)生，提示使用多種無機(jī)納米材料進(jìn)行巨噬細(xì)胞改造時應(yīng)合理選擇，降低細(xì)胞毒性。目前采取的方法有在無機(jī)納米材料中加入有機(jī)結(jié)構(gòu)（如PEG），即有機(jī)-無機(jī)雜化納米材料加速納米材料溶解或通過整合某些酶反應(yīng)位點(diǎn)，促進(jìn)氧化或還原反應(yīng)，加快材料降解等［39］。

2 基因工程改造巨噬細(xì)胞與疾病

巨噬細(xì)胞具有可塑性，受其外界微環(huán)境影響發(fā)生極化。巨噬細(xì)胞根據(jù)激活方式不同常分為兩個亞型：經(jīng)典激活的M1 型和替代激活的M2 型。對巨噬細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)或體外的基因工程改造緩解甚至治愈某些疾病具有廣闊應(yīng)用前景。

2.1 基因工程改造巨噬細(xì)胞與腫瘤 目前已證明基因工程改造巨噬細(xì)胞在腫瘤診斷和治療方面具有潛力（圖1）。

2.1.1 基因工程改造巨噬細(xì)胞與腫瘤診斷 實(shí)體腫瘤微環(huán)境中常存在大量腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophage，TAM），且TAM 往往與腫瘤預(yù)后不良相關(guān)［29］。AALIPOUR等［40］在小鼠模型中開發(fā)了一種過繼改造后同源巨噬細(xì)胞診斷癌癥的方法，發(fā)現(xiàn)小鼠過繼的巨噬細(xì)胞能夠遷移到腫瘤部位，且這一偏好比遷移到其他位置強(qiáng)4倍，遷移到腫瘤部位的巨噬細(xì)胞能夠被腫瘤微環(huán)境誘導(dǎo)為M2型，Arg-1 表達(dá)上調(diào)200 倍，因此將熒光素報告基因與Arg-1 基因啟動子相偶聯(lián)并通過LV 轉(zhuǎn)導(dǎo)改造巨噬細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)熒光素在腫瘤微環(huán)境中的高特異性表達(dá)。過繼改造巨噬細(xì)胞后，通過觀察熒光信號分布能夠發(fā)現(xiàn)25～50 mm3的腫瘤，對腫瘤的敏感性遠(yuǎn)超當(dāng)前正電子發(fā)射斷層掃描（positron emission tomography，PET）的200 mm3，可以發(fā)現(xiàn)更早期的腫瘤，為腫瘤診斷提供了更靈敏的手段。

2.1.2 腫瘤微環(huán)境內(nèi)巨噬細(xì)胞改造 前文提到，腫瘤微環(huán)境中常存在大量M2 型巨噬細(xì)胞浸潤，發(fā)揮免疫抑制功能，促進(jìn)腫瘤血管形成、腫瘤轉(zhuǎn)移，加速腫瘤生長［41-42］。目前治療腫瘤思路之一是耗竭TAM 或馴化TAM 使其發(fā)揮抑制腫瘤生長功能。QIAN 等［43］開 發(fā) 了 一 種M2 型TAM 靶 向 納 米 顆 粒M2NPs，并在M2NPs上裝載了針對CSF-1R的siRNA，通過阻斷M2型TAM 存活信號耗竭腫瘤微環(huán)境中的M2 型巨噬細(xì)胞。根據(jù)肺癌中TAM 葉酸受體β 上調(diào)的特點(diǎn)，TIE 等［44］通過將葉酸與脂質(zhì)體融合靶向肺癌TAM，同時在脂質(zhì)體中包裹1 個編碼促凋亡蛋白BIM 的 質(zhì) 粒 促 進(jìn)TAM 凋 亡。ZHANG 等［45］開 發(fā) 了一種納米載體包裹體外轉(zhuǎn)錄的IRF5 和IKKβ mRNA對TAM 中的M2 型巨噬細(xì)胞進(jìn)行重編程，促進(jìn)其向M1型極化，使其從促腫瘤狀態(tài)轉(zhuǎn)向抑制腫瘤發(fā)展?fàn)顟B(tài)。RODELL 等［46］設(shè) 計(jì) 了 一 種 裝 載R848（一 種TLR7、TLR8 激動劑）的β-環(huán)糊精納米顆粒靶向TAM，實(shí)現(xiàn)了TAM由M2型向M1型轉(zhuǎn)化。

TAM 中除具有促進(jìn)腫瘤生長的M2 型巨噬細(xì)胞，還有能夠執(zhí)行正常腫瘤殺傷功能的M1 型巨噬細(xì)胞，這些具有腫瘤殺傷潛力的巨噬細(xì)胞正常功能受到抑制或處于一種無應(yīng)答狀態(tài)，無法發(fā)揮正常的腫瘤殺傷功能。改造這類巨噬細(xì)胞使其發(fā)揮正常功能也是一個腫瘤治療策略。抑制受體調(diào)節(jié)蛋白-α（SIRPα）是在髓系細(xì)胞表達(dá)的一類免疫檢查點(diǎn)分子，能夠與正常細(xì)胞的跨膜蛋白CD47 結(jié)合，從而抑制巨噬細(xì)胞對正常細(xì)胞的吞噬［47］。腫瘤細(xì)胞常有CD47分子表達(dá)，從而限制巨噬細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的吞噬作用。RAO 等［48］設(shè)計(jì)了一種基因工程細(xì)胞膜包被的磁性納米顆粒（gCM-MNs），其中納米膜囊泡包被SIRPα 突變體CV1，CV1 對CD47 的親和力是正常SIRPα的50 000倍以上，可有效阻斷SIRPα-CD47通路。而內(nèi)部磁納米顆?？蓪CM-MNs靶向至腫瘤微環(huán)境，并促進(jìn)TAM由M2型向M1型極化。將gCM-MNs靜脈注射到荷瘤小鼠中，腫瘤生長明顯減緩，且未觀察到明顯體內(nèi)毒性作用。除通過阻斷SIRPα-CD47恢復(fù)巨噬細(xì)胞對腫瘤正常的吞噬功能外，研究人員在卵巢癌和三陰性乳腺癌中發(fā)現(xiàn)這些腫瘤高表達(dá)CD24，能與巨噬細(xì)胞Siglec 10 結(jié)合促進(jìn)其免疫逃逸［49］。在巨噬細(xì)胞中敲除Siglec 10或使用抗體進(jìn)行阻斷后能夠顯著增加巨噬細(xì)胞對這些腫瘤的吞噬作用，為卵巢癌和三陰性乳腺癌這類無靶向藥的腫瘤提供了新的治療靶點(diǎn)［50］。此外，針對TAM 在腫瘤中無法執(zhí)行正?？乖f呈作用這一問題，MURAOKA等［51］開發(fā)了一種膽固醇支鏈淀粉（cholesterol amylopectin，CHP）納米凝膠，將CHP 納米凝膠和腫瘤抗原復(fù)合物靜脈注射荷瘤小鼠，發(fā)現(xiàn)CHP 抗原復(fù)合物能夠有效聚集于腫瘤，恢復(fù)TAM 正?？乖f呈能力，從而激活CD8+T細(xì)胞，發(fā)揮抗腫瘤作用。

2.1.3 改造巨噬細(xì)胞作為藥物載體 巨噬細(xì)胞被CCL2、CSF-1和補(bǔ)體級聯(lián)產(chǎn)物等招募至腫瘤微環(huán)境，從而執(zhí)行腫瘤殺傷功能或促進(jìn)腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移［52］。根據(jù)巨噬細(xì)胞能夠越過生理屏障而被招募到腫瘤微環(huán)境的這一特點(diǎn)，科研人員嘗試使用改造后的巨噬細(xì)胞作為藥物載體達(dá)到向腫瘤中特異性遞送藥物并增加藥物半衰期的目的［53］。CHOI 等［54］使用脂質(zhì)體包裹阿霉素（Dox）增加巨噬細(xì)胞對Dox的攝取，且能夠顯著降低Dox 對巨噬細(xì)胞的毒性，巨噬細(xì)胞攜帶Dox 進(jìn)入腫瘤后，隨著Dox 釋放殺傷腫瘤細(xì)胞。將金納米顆粒（AuNS）與巨噬細(xì)胞共同孵育促進(jìn)巨噬細(xì)胞對AuNS 的攝取，裝載AuNS 的巨噬細(xì)胞在使用近紅外激光照射時，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞及其周圍腫瘤細(xì)胞發(fā)生熱誘導(dǎo)的死亡，這一治療方法稱為光熱療法［55］。目前這一治療方法在體內(nèi)或體外被證明對乳腺癌、頭頸鱗癌等有良好的治療效果［56-57］。盡管使用巨噬細(xì)胞進(jìn)行藥物遞送能夠提高對腫瘤的靶向性，降低全身反應(yīng)性和延長藥物半衰期等優(yōu)點(diǎn)，需要注意的是，裝載到巨噬細(xì)胞的藥物對巨噬細(xì)胞具有毒性，CHOI 等［54］發(fā)現(xiàn)裝載Dox 的巨噬細(xì)胞24 h后活性就會降低，因此巨噬細(xì)胞能裝載的藥物有限。此外，使用巨噬細(xì)胞進(jìn)行藥物遞送時還存在脫靶效應(yīng)，全身注射巨噬細(xì)胞48 h 后，除腫瘤部位外，肝臟、脾臟和肺中也觀察到大量巨噬細(xì)胞積累［58］。這些因素可能限制改造巨噬細(xì)胞藥物遞送體系應(yīng)用。

2.1.4 嵌合抗原受體巨噬細(xì)胞（CAR-M） 近年隨著基因工程技術(shù)不斷發(fā)展，體外改造巨噬細(xì)胞技術(shù)越來越成熟。最近，KLICHINSKY 等［59］通過AAV 載體Ad5f35 轉(zhuǎn)導(dǎo)人THP-1 細(xì)胞系，構(gòu)建表達(dá)針對HER2 嵌合抗原受體（CAR）的巨噬細(xì)胞（CAR-M），發(fā)現(xiàn)HER2 CAR-M 能夠以劑量和時間依賴方式清除HER2+SKOV3卵巢腫瘤，且CAR-M 在腫瘤部位存活100 d 以上。重要的是，由于腺病毒載體Ad5f35的存在，使CAR-M始終處于M1型極化狀態(tài)，保證了CAR-M 的抗腫瘤能力。ZHANG 等［60］構(gòu)建了一種CAR-HER2-CD147，由用來識別人HER2 的scFV 胞外區(qū)和小鼠CD147 跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)組成，利用LV轉(zhuǎn)導(dǎo)方式構(gòu)建了CAR-HER2-CD147-RAW264.7 細(xì)胞系，當(dāng)CAR-HER2-CD147-RAW264.7 識別到腫瘤表面的HER2分子時，激活CD147下游信號通路，促進(jìn)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶降解腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)，從而增加T細(xì)胞浸潤，發(fā)揮抗腫瘤作用。值得關(guān)注的是，CAR-HER2-CD147-RAW264.7 與HER2-4T1 在體外共培養(yǎng)并無直接殺傷腫瘤功能，說明改造后的巨噬細(xì)胞作用方式更加溫和，毒副作用更小。

利用基因工程改造巨噬細(xì)胞治療腫瘤已成為一種有前景的腫瘤治療方式，但如何提高靶向性及降低人體毒性仍是亟待解決的問題。此外，大規(guī)模細(xì)胞檢測技術(shù)、單細(xì)胞測序技術(shù)、多重免疫組化可幫助選擇新的巨噬細(xì)胞靶點(diǎn)，從而提高治療腫瘤效果［61］。總之，巨噬細(xì)胞憑借其強(qiáng)大的趨向性、可塑性，在腫瘤治療中的地位逐漸凸顯，巨噬細(xì)胞特異性靶點(diǎn)、高效率巨噬細(xì)胞改造工具和巨噬細(xì)胞靶向性生物材料等開發(fā)可能成為未來這一領(lǐng)域研究重點(diǎn)。

2.2 基因工程改造巨噬細(xì)胞與自身免疫病 巨噬細(xì)胞與多種自身免疫病相關(guān)，包括哮喘、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、腎小球腎炎、自身免疫性神經(jīng)炎、炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）、系統(tǒng)性硬化病等［62］。自身免疫病發(fā)生常伴隨巨噬細(xì)胞浸潤增加及M1與M2型巨噬細(xì)胞極化失衡。通過改造巨噬細(xì)胞進(jìn)行免疫治療是緩解某些自身免疫病的有效手段，具有廣闊應(yīng)用前景。

2.2.1 基因工程改造巨噬細(xì)胞與RA RA 是一類與M1/M2 比例失衡相關(guān)的自身免疫病［63］。研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠體內(nèi)通過注射AAV2/8 載體在巨噬細(xì)胞中過表達(dá)IL-38，可緩解膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎和K/BxN 血清轉(zhuǎn)移性關(guān)節(jié)炎小鼠癥狀［64］。此外，在THP-1 細(xì)胞系中使用LV 載體過表達(dá)IL-38 能夠抑制IL-6、IL-23和TNF-α等促炎因子產(chǎn)生，說明IL-38過表達(dá)巨噬細(xì)胞在治療RA方面具有潛力［64］。

2.2.2 基因工程改造巨噬細(xì)胞與腎小球腎炎 腎小球腎炎中常發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞浸潤，說明巨噬細(xì)胞在腎小球腎炎中發(fā)揮作用。20 年前，WILSON 等［65］利用腺病毒載體在骨髓來源巨噬細(xì)胞中過表達(dá)IL-10并回輸至小鼠，發(fā)現(xiàn)腎小球腎炎癥狀得到緩解。PEREIRA 等［66］使用DEF（一種鐵螯合劑）在體內(nèi)處理腎小球腎炎小鼠模型，通過改變巨噬細(xì)胞代謝方式限制巨噬細(xì)胞M1型極化緩解腎小球腎炎。

2.2.3 基因工程改造巨噬細(xì)胞與IBD IBD 包括潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病。IBD 與M1/M2比例失衡而導(dǎo)致的腸道微生物或食物抗原耐受降低及慢性炎癥相關(guān)［67］。有報道稱，維生素D3的活性形式1，25（OH）2D3能夠減少巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-1β 和COX-2產(chǎn)生，并增加IL-10 產(chǎn)生［68］。ZAI 等［69］開發(fā)了一種不會被胃酸破壞的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體NLCs，通過口服給藥方式到達(dá)腸道后被腸道巨噬細(xì)胞攝取，減少巨噬細(xì)胞炎癥因子分泌，緩解IBD 癥狀。CAO 等［70］制備了一種利用殼聚糖包裹胰島素樣生長因子1C 端結(jié)構(gòu)域（IGF-1）的水凝膠CS-IGF-1，將CS-IGF-1注射到小鼠體內(nèi)能夠激活并誘導(dǎo)M2 型巨噬細(xì)胞極化，從而促進(jìn)IBD小鼠腸道上皮修復(fù)，減輕癥狀。

2.3 基因工程改造巨噬細(xì)胞與抗移植物排斥 器官移植是挽救終末期器官衰竭患者生命的一項(xiàng)重要策略。近年巨噬細(xì)胞在急性和慢性排斥反應(yīng)中的作用受到重視。巨噬細(xì)胞在移植物中積累被認(rèn)為是移植物排斥的特征之一，與患者預(yù)后較差相關(guān)［2］。肝臟缺血再灌注損傷中，供體肝臟中駐留的Kupffer 細(xì)胞向M1 型極化，造成移植物功能障礙［71］。急性排斥反應(yīng)過程中，巨噬細(xì)胞能夠產(chǎn)生IL-6、TNF-α、iNOS、MCP-1 等炎癥因子和趨化因子招募和激活白細(xì)胞導(dǎo)致移植物微血管損傷。此外，巨噬細(xì)胞還能發(fā)揮抗原遞呈作用激活適應(yīng)性免疫細(xì)胞介導(dǎo)供體特異性細(xì)胞毒反應(yīng)。除分泌炎癥因子、發(fā)揮抗原遞呈等作用介導(dǎo)急性排斥反應(yīng)外，巨噬細(xì)胞可直接作為效應(yīng)細(xì)胞通過穿孔素依賴途徑直接排斥小鼠同種異體移植物［72］。慢性排斥反應(yīng)在移植后數(shù)月至數(shù)年內(nèi)發(fā)生，長期活化的巨噬細(xì)胞向M2 型偏移并發(fā)揮促纖維化功能［73］。據(jù)報道，術(shù)后1年，患者移植物內(nèi)90%以上巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出CD68+CD206+的M2 型巨噬細(xì)胞表型［74］。WU 等［75］使用氯膦酸脂質(zhì)體清除心臟移植受體大鼠全身巨噬細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，心臟功能下降減緩，移植物存活時間延長。

巨噬細(xì)胞在誘導(dǎo)抑制免疫耐受方面也發(fā)揮重要作用。CONDE 等［76］在小鼠異位心臟同種異體移植模型中，使用anti-CD40L 單克隆抗體誘導(dǎo)耐受期間，觀察到CD11b+CSF1R+Ly6CloLy6G-巨噬細(xì)胞在移植物中積累，這種積累依賴CSF1驅(qū)動的單核前體向Ly6Clo抑制性巨噬細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化?；谶@一發(fā)現(xiàn)，BRAZA 等［77］制備了一種辛伐他汀-高密度脂蛋白納米載體限制單核前體增殖，發(fā)現(xiàn)CSF1誘導(dǎo)的免疫耐受抑制狀態(tài)被打破。說明CSF1 可促進(jìn)單核前體增殖和向免疫耐受方向轉(zhuǎn)化，可能是未來改造巨噬細(xì)胞發(fā)揮抗移植物排斥反應(yīng)功能的潛在靶點(diǎn)。BRAZA 等［78］利用高密度脂蛋白包裹mTOR 抑制劑制備了兩種納米顆粒，這兩種納米顆粒聯(lián)用可促進(jìn)Ly6Clo巨噬細(xì)胞積累，移植后100 d，移植物存活率仍超過70%。Zbtb7a 表達(dá)僅局限于肺泡巨噬細(xì)胞，在肺移植小鼠模型中過繼Zbtb7a 敲除的巨噬細(xì)胞能夠通過降低肺泡巨噬細(xì)胞抗原遞呈能力，限制T 細(xì)胞增殖，減輕支氣管堵塞，延長移植物存活時間［79］。此外，IL-33能夠刺激移植物內(nèi)巨噬細(xì)胞脂肪酸攝取并限制巨噬細(xì)胞M1 型極化，減輕急性排斥反應(yīng)［80］。IL-34 處理CD14++CSF-1R+PTPξ+單核細(xì)胞促進(jìn)其向具有免疫耐受特性的巨噬細(xì)胞分化［81］。盡管目前基因工程改造巨噬細(xì)胞在抗移植物排斥方面的研究較少，前期基礎(chǔ)研究為后期基因工程改造巨噬細(xì)胞提供了新靶點(diǎn)和思路，改造巨噬細(xì)胞在移植免疫中存在巨大應(yīng)用潛力。

3 討論

基因工程改造巨噬細(xì)胞為許多疾病如腫瘤、自身免疫病、感染性疾病、移植物排斥等提供了新的診斷方式、治療思路和手段。多種以改造巨噬細(xì)胞為目標(biāo)的疾病治療手段已進(jìn)入臨床試驗(yàn)，如CAR-M、金納米顆粒等，為使用現(xiàn)有手段難以治療的疾病帶來了新希望。盡管如此，現(xiàn)階段基因工程改造巨噬細(xì)胞仍存在一些技術(shù)瓶頸需要克服和優(yōu)化。首先是巨噬細(xì)胞難以轉(zhuǎn)染的問題，現(xiàn)有轉(zhuǎn)染手段或多或少存在靶向性低、效率不高、對細(xì)胞毒性大、引起細(xì)胞狀態(tài)改變等問題，因此，需要對現(xiàn)有基因工程改造手段進(jìn)行優(yōu)化或開發(fā)新的改造方法提高轉(zhuǎn)染和編輯效率，提高安全性，并根據(jù)治療需要誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化。改造能否能夠穩(wěn)定維持巨噬細(xì)胞特定功能也是考量其臨床應(yīng)用價值的重要因素。改造后的巨噬細(xì)胞應(yīng)能夠維持較長時間活性和穩(wěn)定性而不會被微環(huán)境重新誘導(dǎo)。此外，如何有效降低臨床應(yīng)用成本也是改造巨噬細(xì)胞時需要考慮的重要問題。總之，基因工程改造巨噬細(xì)胞的臨床應(yīng)用仍有諸多問題需要解決。幸運(yùn)的是，大量細(xì)胞分子生物學(xué)等領(lǐng)域新技術(shù)開發(fā)為有效解決基因工程改造巨噬細(xì)胞現(xiàn)有問題和瓶頸、實(shí)現(xiàn)巨噬細(xì)胞精準(zhǔn)“馴化”及提高治療效果提供了新手段和新策略。