袁 戎 易慧智 (信陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,信陽(yáng) 464000)
急性髓性白血病(acute myeloid leukemia,AML)作為一種具有高度異質(zhì)性的血液系統(tǒng)惡性腫瘤疾病,是由于骨髓和外周血中未成熟的髓細(xì)胞大量積累和擴(kuò)增導(dǎo)致的造血功能衰竭[1-2]。免疫治療雖已被認(rèn)作是最有前景的治療措施,但腫瘤細(xì)胞可躲避機(jī)體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視及殺傷,發(fā)生免疫逃逸,因此,詳細(xì)了解AML 的免疫逃逸機(jī)制對(duì)其治療極具意義[3-4]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lnc-RNA)是造血系統(tǒng)功能和發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,研究 發(fā) 現(xiàn)lncRNA 參 與AML 細(xì) 胞 的 免 疫 逃 逸[5-6]。LINC01410 作為一種lncRNA 在胃癌等腫瘤疾病中呈異常高表達(dá)狀態(tài),但其對(duì)AML 免疫逃逸的影響還未見報(bào)道[7]。微小RNA(miRNA)作為高度保守的小分子非編碼RNA 參與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及免疫逃逸,miR-124 已被發(fā)現(xiàn)可通過(guò)抑制信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal trans ducerand activator of transcription 3,stat3)表達(dá)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的免疫逃逸,且miR-124 參與AML 的發(fā)生,抑制其表達(dá)可促進(jìn)AML 細(xì)胞的增殖[4,8]。已知stat3 在AML 患者骨髓標(biāo)本表達(dá)異常增加,參與AML 發(fā)生[9]。LINC01410 是否可能通過(guò)調(diào)控miR-124/stat3 軸影響AML 免疫逃逸值得探究,因此,本研究通過(guò)對(duì)LINC01410 在AML 免疫逃逸中的作用機(jī)制進(jìn)行探究,以期為AML 免疫逃逸存在潛在作用靶點(diǎn)的尋找提供一定參考。
1.1 材料 LipofectamineTM2000 Transfection Reagent(上海研卉生物);干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)ELISA 試劑盒、雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒(北京索萊寶);IL-2(蘇州賽業(yè)生物);兔抗p-stat3、β-actin、stat3抗體、Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody(Cell Signaling Technology)。Insta Q48TM熒光定量PCR 檢測(cè)系統(tǒng)購(gòu)自上海威正翔禹生物;DAIHAN 凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自上海連橋生物。
1.2 方法
1.2.1 骨髓及外周血樣本獲取 采集信陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院附屬醫(yī)院2019 年3 月至2021 年5 月收治的21 例AML 患者骨髓樣本,患者平均年齡(31.65±8.43)歲,另取同時(shí)期25 例非惡性血液病患者骨髓樣本及外周血樣本,患者平均年齡(30.34±7.98)歲,經(jīng)過(guò)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),受試者均知情同意。
1.2.2 白細(xì)胞收集 將所得骨髓樣本與6 ml 紅細(xì)胞裂解液混勻后冰上靜置15 min,2 000 r/min 離心10 min,棄上清后加入4 ml紅細(xì)胞裂解液重懸,再次離心棄上清取下層白細(xì)胞。
1.2.3 自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell,NK)收集及培養(yǎng) 將經(jīng)肝素抗凝的非惡性血液病患者外周血(2 ml)與PBS 等比例混勻后加入淋巴細(xì)胞分離液,1 500 r/min 離心15 min 后混合液分為4 層,吸取位于第2 層的乳白色淋巴細(xì)胞層,再次離心后棄上清取單個(gè)核細(xì)胞。按2.5×108個(gè)/ml 加入磁珠緩沖液MACS(miltenyi)重 懸,NK 細(xì) 胞 生 物 素 化 抗 體(7.5 μl)孵育10 min,再次添加macs緩沖液(22.5 μl)及抗生物素化抗體磁珠(15 μl)孵育20 min,經(jīng)質(zhì)譜分離、洗柱收集細(xì)胞,添加CD56、CD3抗體進(jìn)行標(biāo)記后篩選NK 細(xì)胞,將NK 細(xì)胞接種于RPMI1640 培養(yǎng)基培養(yǎng),作為對(duì)照組,NK 細(xì)胞經(jīng)20 ng/ml IL-2 刺激24 h后常規(guī)培養(yǎng)的細(xì)胞作為IL-2組。
1.2.4 分組、轉(zhuǎn)染及共培養(yǎng) 將NK 細(xì)胞分為對(duì)照組、IL-2 組、sh-NC 組、sh-LINC01410 組、sh-LINC-01410+inhibitor NC 組、sh-LINC01410+miR-124 inhibitor 組、miR-NC 組、miR-124 mimics 組、miR-124 mimics+pcDNA3.1-stat3 組、miR-124 mimics+pcDNA 3.1 組,將所得的白細(xì)胞(1×105個(gè)/ml)接種到96 孔板中,使用LipofectamineTM2000 試劑盒對(duì)IL-2 組NK細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)轉(zhuǎn)染后與白細(xì)胞以10∶1 的比例混勻共培養(yǎng)。
1.2.5 qRT-PCR 檢 測(cè)LINC01410 及miR-124 的 表達(dá) 使用TRIzol 法提取AML 患者、非惡性血液病患者骨髓以及對(duì)照組、IL-2組、sh-NC組、sh-LINC01410組、sh-LINC01410+inhibitor NC 組、sh-LINC01410+miR-124 inhibitor 組NK 細(xì) 胞 中 總RNA,逆 轉(zhuǎn) 錄 成cDNA 后 分 別 以U6、GAPDH 作 為miR-124 及LINC01410 的內(nèi)參進(jìn)行qRT-PCR 擴(kuò)增,采用2-ΔΔCt分析miR-124及LINC01410表達(dá)(n=5),引物見表1。
表1 qRT-PCR引物Tab.1 qRT-PCR primers
1.2.6 Western blot 檢測(cè)stat3 蛋白表達(dá) 收集轉(zhuǎn)染后的各組NK 細(xì)胞并經(jīng)蛋白裂解液裂解提取總蛋白,經(jīng)BCA 法定量、電泳分離、轉(zhuǎn)膜、封閉后,孵育兔抗p-stat3、β-actin、stat3(1∶1 000)抗體過(guò)夜,孵育2 h羊抗兔IgG(1∶3 000),避光孵育ECL發(fā)光液(5 min),使用成像儀進(jìn)行顯影,計(jì)算p-stat3/stat3 蛋白表達(dá)(n=5)。
1.2.7 ELISA 法檢測(cè)上清液中IFN-γ 含量 收集各組細(xì)胞共培養(yǎng)后的培養(yǎng)上清液后使用IFN-γ 試劑盒處理,于酶標(biāo)儀 光密度D450nm處檢 測(cè)IFN-γ 含 量(n=5)。
1.2.8 細(xì)胞毒性檢測(cè) 收集各組NK 細(xì)胞(5×105個(gè)/ml)作為效應(yīng)細(xì)胞,以白細(xì)胞為靶細(xì)胞:實(shí)驗(yàn)分為效應(yīng)細(xì)胞自然釋放組(100 μl NK 細(xì)胞懸液+100 μl 細(xì)胞培養(yǎng)液)、靶細(xì)胞自然釋放組(100 μl 白細(xì)胞懸液+100 μl 細(xì)胞培養(yǎng)液)、自然殺傷組(100 μl NK細(xì)胞懸液+100 μl白細(xì)胞懸液)、靶細(xì)胞最大釋放組(100 μl白細(xì)胞懸液+100 μl 2.5%的Triton X-100),培養(yǎng)4 h 后使用LDH 試劑盒檢測(cè)光密度D,計(jì)算細(xì)胞毒性(%)=(D自然殺傷組-D靶細(xì)胞自然釋放組-D效應(yīng)細(xì)胞自然釋放組)/(D靶細(xì)胞最大釋放組-D靶細(xì)胞自然釋放組)×100%(n=5)。
1.2.9 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)LINC01410、miR-124、stat3 的靶向關(guān)系 starBase 網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-124分別與LINC01410、stat3 的結(jié)合位點(diǎn);將含有miR-124 結(jié)合位點(diǎn)的LINC01410 及stat3 3'UTR 片段插入pMir-Report 載體上,構(gòu)建LINC01410-wt、stat3-wt 野生型載體,通過(guò)替換miR-124 結(jié)合片段產(chǎn)生突變構(gòu)建體,命名為L(zhǎng)INC01410-mut、stat3-mut;將白細(xì)胞分為L(zhǎng)INC01410-wt+miR-124 mimics 組、LINC01410-wt+miR-NC 組、LINC01410-mut+miR-124 mimics 組、LINC01410-mut+miR-NC 組、stat3-wt+miR-124 mimics組、stat3-wt+ miR-NC 組、stat3-mut+miR-124 mimics組、stat3-mut+miR-NC 組,將miR-NC、miR-124 mimics 分別與所構(gòu)建的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至白細(xì)胞中,24 h 后通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)(Promega)計(jì)算海腎和螢火蟲熒光值,計(jì)算白細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)通過(guò)SPSS22.0 軟件分析,±s描述,多組數(shù)據(jù)比較行One-way ANOVA,SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步兩兩比較,P<0.05表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 AML 以及非惡性血液病患者骨髓中LINC01410、miR-124表達(dá)水平比較 與非惡性血液病患者相比,AML 患者骨髓中LINC01410 表達(dá)顯著增加,miR-124表達(dá)顯著降低(P<0.05),見表2。
表2 AML 以及非惡性血液病患者骨髓中LINC01410、miR-124表達(dá)比較(±s)Tab.2 Comparison of LINC01410 and miR-124 expressions in bone marrow of AML patients and non malignant hematological patients (±s)
表2 AML 以及非惡性血液病患者骨髓中LINC01410、miR-124表達(dá)比較(±s)Tab.2 Comparison of LINC01410 and miR-124 expressions in bone marrow of AML patients and non malignant hematological patients (±s)
Note:Compared with non malignant hematological diseases group, 1)P<0.05.
Groups Non malignant hematological diseases AML n LINC01410 miR-124 0.99±0.04 0.42±0.061)37.122 0.000 25 21 t P--1.01±0.03 1.96±0.221)19.601 0.000
2.2 各組NK 細(xì)胞中LINC01410、miR-124 及stat3蛋白表達(dá)水平比較 與對(duì)照組相比,IL-2組NK細(xì)胞中LINC01410 及p-stat3/stat3 表 達(dá) 顯 著 降 低(P<0.05),miR-124 表達(dá)顯著增加(P<0.05);與IL-2 組、sh-NC組相比,sh-LINC01410組LINC01410及p-stat3/stat3 表達(dá)顯著降低(P<0.05),miR-124 表達(dá)顯著增加(P<0.05);與sh-LINC01410 組、sh-LINC01410+inhibitor NC 組相比,sh-LINC01410+miR-124 inhibitor組LINC01410 表達(dá)無(wú)顯著變化(P>0.05),而miR-124 表達(dá)顯著降低,p-stat3/stat3 表達(dá)顯著增加(P<0.05),見表3、圖1。
圖1 各組NK細(xì)胞中stat3蛋白表達(dá)比較Fig.1 Comparison of stat3 protein expression in NK cells of each group
表3 各組NK細(xì)胞中LINC01410、miR-124及stat3蛋白表達(dá)比較(±s,n=5)Tab.3 Comparison of LINC01410, miR-124 and stat3 protein expressions in NK cells of each group(±s,n=5)
表3 各組NK細(xì)胞中LINC01410、miR-124及stat3蛋白表達(dá)比較(±s,n=5)Tab.3 Comparison of LINC01410, miR-124 and stat3 protein expressions in NK cells of each group(±s,n=5)
Note:Compared with control group, 1)P<0.05; compared with IL-2 group, 2)P<0.05; compared with sh-NC group, 3)P<0.05; compared with sh-LINC01410 group, 4)P<0.05; compared with sh-LINC01410+inhibitor NC group, 5)P<0.05.
Groups Control IL-2 sh-NC sh-LINC01410 sh-LINC01410+inhibitor NC sh-LINC01410+miR-124 inhibitor LINC01410 0.99±0.05 0.52±0.041)0.53±0.05 0.24±0.022)3)miR-124 1.01±0.03 1.63±0.201)1.64±0.24 2.33±0.262)3)p-stat3/stat3 1.63±0.21 0.92±0.101)0.93±0.12 0.35±0.042)3)0.25±0.03 2.35±0.28 0.34±0.06 0.23±0.04 1.29±0.164)5)0.98±0.084)5)
2.3 LINC01410 及miR-124 表達(dá)沉默對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ 含量的影響 與對(duì)照組相比,IL-2組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ 含量顯著增加(P<0.05);與IL-2 組、sh-NC 組相比,sh-LINC01410 組IFN-γ含量顯著增加(P<0.05);與sh-LINC01410組、sh-LINC01410+inhibitor NC 組相比,sh-LINC01410+miR-124 inhibitor 組IFN-γ 含量顯著降低(P<0.05),見表4。
表4 各組IFN-γ含量比較(±s,n=5)Tab.4 Comparison of IFN-γ content in each group (±s,n=5)
表4 各組IFN-γ含量比較(±s,n=5)Tab.4 Comparison of IFN-γ content in each group (±s,n=5)
Note:Compared with control group, 1)P<0.05; compared with IL-2 group, 2)P<0.05; compared with sh-NC group, 3)P<0.05;compared with sh-LINC01410 group, 4)P<0.05; compared with sh-LINC01410+inhibitor NC group, 5)P<0.05.
IFN-γ/(pg·ml-1)40.19±4.32 83.27±6.141)82.50±5.63 129.52±6.982)3)130.81±7.60 85.92±5.744)5)Groups Control IL-2 sh-NC sh-LINC01410 sh-LINC01410+inhibitor NC sh-LINC01410+miR-124 inhibitor
2.4 LINC01410 及miR-124 表 達(dá) 沉 默 對(duì)NK 細(xì) 胞毒性的影響 與對(duì)照組相比,IL-2組NK細(xì)胞毒性顯著增強(qiáng)(P<0.05);與IL-2 組、sh-NC 組相比,sh-LINC01410 組NK 細(xì)胞毒性顯著增強(qiáng)(P<0.05);與sh-LINC01410 組、sh-LINC01410+inhibitor NC 組 相比,sh-LINC01410+miR-124 inhibitor 組NK 細(xì)胞毒性顯著降低(P<0.05),見表5。
表5 各組NK細(xì)胞毒性比較(±s,n=5)Tab.5 Comparison of NK cytotoxicity in each group(±s,n=5)
表5 各組NK細(xì)胞毒性比較(±s,n=5)Tab.5 Comparison of NK cytotoxicity in each group(±s,n=5)
Note:Compared with control group, 1)P<0.05; compared with IL-2 group, 2)P<0.05; compared with sh-NC group, 3)P<0.05;compared with sh-LINC01410 group, 4)P<0.05; compared with sh-LINC01410+inhibitor NC group, 5)P<0.05.
Cytotoxicity/%32.65±4.35 49.23±6.221)50.01±5.92 72.62±6.852)3)71.53±7.20 48.20±5.374)5)Groups Control IL-2 sh-NC sh-LINC01410 sh-LINC01410+inhibitor NC sh-LINC01410+miR-124 inhibitor
2.5 LINC01410、miR-124、stat3 的靶向關(guān)系驗(yàn)證starBase 預(yù)測(cè)顯示:LINC01410 與miR-124 間及miR-124與stat3間存在結(jié)合位點(diǎn)(圖2);熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示:與LINC01410-wt+miR-NC 組相比,LINC01410-wt+miR-124 mimics 組熒光素酶活性顯著降低(P<0.05),LINC01410-mut+miR-124 mimics組、LINC01410-mut+miR-NC 組熒光素酶活性無(wú)明顯變化(P>0.05),見圖3;與stat3-wt+miR-NC 組相比,stat3-wt+miR-124 mimics組熒光素酶活性顯著降低(P<0.05),stat3-mut+miR-124 mimics組、stat3-mut+miR-NC 組熒光素酶活性無(wú)顯著性變化(P>0.05),見圖4。
圖3 熒光素酶活性檢測(cè)Fig.3 Detection of luciferase activity
圖4 熒光素酶活性檢測(cè)Fig.4 Luciferase activity assay
2.6 miR-124 及stat3 過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ 含量及NK 細(xì)胞毒性作用的影響 與IL-2 組、miR-NC 組相比,miR-124 mimics 組IFN-γ 含量及NK細(xì)胞毒性顯著增強(qiáng)(P<0.05);與miR-124 mimics組、miR-124 mimics+pcDNA3.1 組 相 比,miR-124 mimics+pcDNA3.1-stat3 組IFN-γ 含量及NK 細(xì)胞毒性顯著降低(P<0.05),見表6。
表6 各組IFN-γ含量及NK細(xì)胞毒性比較(±s,n=5)Tab.6 Comparison of IFN-γ content and NK cytotoxicity in each group (±s,n=5)
表6 各組IFN-γ含量及NK細(xì)胞毒性比較(±s,n=5)Tab.6 Comparison of IFN-γ content and NK cytotoxicity in each group (±s,n=5)
Note:Compared with control group, 1)P<0.05; compared with IL-2 group, 2)P<0.05; compared with miR-NC group, 3)P<0.05;compared with miR-124 mimics group, 4) P<0.05; compared with miR-124 mimics+pcDNA3.1 NC group, 5) P<0.05.
Cytotoxicity/%31.60±4.32 47.53±6.141)48.80±5.55 76.40±6.732)3)75.22±7.52 50.43±5.284)5)Groups Control IL-2 miR-NC miR-124 mimics miR-124 mimics+pcDNA3.1 miR-124 mimics+pcDNA3.1-stat3 IFN-γ/(pg·ml-1)40.10±4.35 82.07±6.331)83.10±5.86 135.22±7.862)3)136.82±8.64 86.92±7.154)5)
AML 可通過(guò)基因融合、突變和表觀遺傳修飾來(lái)躲避NK 細(xì)胞的免疫監(jiān)視,造成免疫逃避的發(fā)生,而至今免疫逃逸的發(fā)生機(jī)制尚不清楚[10-11]。因此有必要對(duì)其深入探討。
腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸機(jī)制涉及NK 細(xì)胞等免疫細(xì)胞的細(xì)胞毒作用改變,NK 細(xì)胞作為機(jī)體抗腫瘤第一道防線,其功能異常會(huì)造成機(jī)體免疫耐受及功能障礙的發(fā)生,從而導(dǎo)致免疫逃逸[4,11]。lncRNA 可在細(xì)胞中充當(dāng)信號(hào)分子,調(diào)節(jié)某些基因的表達(dá),如充當(dāng)miRNA 海綿,調(diào)控miRNA 表達(dá)[12]。但目前關(guān)于LINC01410 在AML 免疫逃逸機(jī)制中的相關(guān)研究還未見報(bào)道,本研究結(jié)果顯示,AML 患者骨髓中LINC01410 表達(dá)顯著增加,LINC01410 參與AML 的發(fā)生;在IL-2 刺激的NK 細(xì)胞中LINC01410 顯著降低,IFN-γ 含量、NK 細(xì)胞毒性顯著增加,并且沉默LINC01410 表達(dá)后與AML 患者白細(xì)胞共培養(yǎng)促進(jìn)NK 細(xì)胞的細(xì)胞毒作用及IFN-γ 分泌,表明LINC01410表達(dá)沉默能夠有效增加NK細(xì)胞毒性,增強(qiáng)對(duì)AML 的殺傷作用,并通過(guò)釋放IFN-γ 等促進(jìn)其殺傷效應(yīng),從而抑制免疫逃逸。
本研究發(fā)現(xiàn),miR-124 是LINC01410 的靶基因。有研究報(bào)道,腫瘤抑制因子miR-124 在AML 患者骨髓中表達(dá)降低,其參與AML 的發(fā)生[13]。lncRNA SNHG16 沉默通過(guò)促進(jìn)miR-124-3p 表達(dá)在急性淋巴細(xì)胞白血病中起到腫瘤抑制作用[14]。近期有研究稱,miR-124 與IL-2、IFN-γ 等細(xì)胞因子表達(dá)與細(xì)胞免疫應(yīng)答有關(guān)[4]。本研究發(fā)現(xiàn),AML患者骨髓中miR-124表達(dá)顯著降低,IL-2 刺激的NK 細(xì)胞miR-124 表達(dá)顯著增加,與前述研究一致[13],且沉默LINC01410后與AML 患者白細(xì)胞共培養(yǎng)促進(jìn)NK 細(xì)胞miR-124 表達(dá),而miR-124 表達(dá)沉默可逆轉(zhuǎn)LINC01410 沉默對(duì)NK 細(xì)胞的毒性作用,結(jié)果表明,LINC01410 表達(dá)沉默對(duì)AML 免疫逃逸的抑制作用可能與其促進(jìn)miR-124 表達(dá)有關(guān)。為進(jìn)一步對(duì)miR-124 在AML 免疫逃逸中的作用機(jī)制進(jìn)行驗(yàn)證,本研究對(duì)miR-124 過(guò)表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn),miR-124 過(guò)表達(dá)能夠有效促進(jìn)IFN-γ釋放及NK細(xì)胞毒性增加。
miRNA 可通過(guò)與目標(biāo)mRNA 3'-UTR 結(jié)合在轉(zhuǎn)錄水平上負(fù)向調(diào)控其目標(biāo)基因表達(dá),有研究表明,其主要通過(guò)拷貝數(shù)改變、表觀遺傳變化等機(jī)制參與AML 發(fā)?。?2]。本研究發(fā)現(xiàn),stat3 是miR-124 的靶基因。miR-124過(guò)表達(dá)可通過(guò)抑制stat3表達(dá)增加NK 細(xì)胞對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用,抑制免疫逃逸[4]。stat3作為轉(zhuǎn)錄因子參與多種類型的腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的發(fā)生[15-17]。本研究發(fā)現(xiàn),IL-2 刺激的NK細(xì)胞中p-stat3/stat3 表達(dá)顯著降低,并且沉默LINC01410 后與AML 患者白細(xì)胞共培養(yǎng)抑制NK 細(xì)胞p-stat3/stat3 表達(dá),miR-124 表達(dá)沉默可逆轉(zhuǎn)LINC01410 沉默對(duì)p-stat3/stat3 表達(dá)的抑制作用,上述結(jié)果表明,LINC01410 表達(dá)沉默可能通過(guò)促進(jìn)miR-124表達(dá)抑制stat3表達(dá)。本研究還發(fā)現(xiàn)stat3過(guò)表達(dá)可逆轉(zhuǎn)miR-124過(guò)表達(dá)對(duì)AML的殺傷作用。
綜上所述,LINC01410 沉默通過(guò)激活miR-124/stat3 軸抑制AML 免疫逃逸。本研究為AML 免疫逃逸機(jī)制的研究以及AML 治療靶點(diǎn)的尋找提供了線索。