孟祥宇 葉亞運 王俊斌 （蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院腫瘤內科，蚌埠 233000）

胃癌（gastric cancer，GC）是最常見的惡性腫瘤之一。根據(jù)2021 年中國國家癌癥中心的統(tǒng)計，GC已成為我國第二常見的惡性腫瘤，也是癌癥相關死亡的第二大原因［1］。與多數(shù)發(fā)達國家相比，我國GC病死率（0.845）和五年發(fā)病率（27.6/100 000）都更高，并突出了一個令人擔憂的特征，即年輕人群中早發(fā)性GC 發(fā)病率持續(xù)上升［2］。盡管目前采取手術切除、全身化療及靶向治療等綜合治療手段改善了胃癌的治療效果，但GC 患者長期生存情況仍不令人滿意，尤其是晚期GC 臨床預后仍不理想［3-4］。新興的免疫療法已成為GC 患者的一種有前途的替代療法。免疫檢查點抑制劑包括抗細胞毒性T淋巴細胞抗原4（anti-cytotoxic T-lymphocyte antigen 4，CTLA4）單抗（Ipilimab）和抗程序性死亡受體-1（antiprogrammed cell death protein 1，anti-PD-1）單抗（nivolumab，pembrolizumab），開啟了腫瘤免疫治療的新時代，使癌癥治療模式發(fā)生轉變［5］。其中，PD-1單抗nivolumab 已被FDA 批準用于晚期GC 患者一線治療，并取得了良好效果［6］。但僅有少部分GC患者從中獲益，眾多GC 患者仍需更多新的和敏感的標志物預測或增強免疫治療應答。近年越來越多的證據(jù)表明，骨膜蛋白（periostin，POSTN）在非小細胞肺癌、乳腺癌、肝細胞癌和結腸癌等多種腫瘤中的表達明顯增加，在細胞增殖、遷移和血管生成中的作用也被證實［7-11］。POSTN 在GC 中的致癌作用機制尚不清楚，且POSTN 在腫瘤免疫學及預后中的意義也鮮有報道。本研究初步分析POSTN 在GC 組織中的表達及意義，發(fā)現(xiàn)GC 組織高表達POSTN，且與生存期呈負相關。于是，本研究系統(tǒng)地評價了GC 中淋巴細胞狀態(tài)，闡明了POSTN 與GC 免疫浸潤的關系以及POSTN 介導的免疫應答信號通路，以POSTN相關免疫調節(jié)劑確定免疫預后信號，結合此信號和臨床病理特征建立諾模圖，評估POSTN 在GC 中的免疫意義。

1 資料與方法

1.1 GC表達譜獲取和生存分析 從TCGA （https：//portal.gdc.cancer.gov/）數(shù)據(jù)庫獲取GC患者（非腫瘤組織32 例，腫瘤組織375 例）轉錄組RNA-Seq 數(shù)據(jù)（Workflow Type：HTSeq-FPKM）及所有樣本臨床信息。從GEO（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）數(shù)據(jù)庫獲取GSE29998數(shù)據(jù)集99例GC及非GC組織基因表達譜。利用R 軟件“Limma”“GGplot2”“GGpubr”等軟件包對上述數(shù)據(jù)進行進一步處理及分析，采用“survminer”包和KM 數(shù)據(jù)庫（http：//kmplot.com/analysis/index.php？p=service&cancer=gastric）繪制Kaplan-Meier圖。

1.2 免疫浸潤細胞評估和POSTN 與免疫細胞相關性分析 采用Cibersort 方法對組織中22 種免疫細胞進行定性和定量分析，主要依賴于LM22 的免疫細胞亞型表達矩陣，包含547 個標志基因，可區(qū)分22 種人類造血細胞表型［12］。利用Cibersort（https：//cibersort.stanford.edu/）的CiberSort R 腳本對其表達矩陣進行分析，蒙特卡羅法計算每種情況去卷積的經(jīng)驗P值，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

1.3 POSTN 與免疫調節(jié)劑的相關性 從TISIDB（http：//cis.hku.hk/TISIDB/）數(shù)據(jù)庫提取POSTN 相關免疫調節(jié)劑，該數(shù)據(jù)庫旨在通過整合多種不同類型數(shù)據(jù)闡明腫瘤-免疫系統(tǒng)的相互作用［13］。采用Spearman 相關檢驗篩選與POSTN 表達顯著相關的免疫調節(jié)劑。使用基因集分析工具（http：//www.webgestalt.org/）對上述基因進行GO 注釋和KEGG 途徑富集分析，P和FDR均＜0.05為富集顯著。

1.4 風險與預測模型構建 基于POSTN 相關免疫調節(jié)劑構建一個可預測預后的模型。使用Cox 回歸模型的Akaike 信息標準進行逐步變量選擇［14］。篩選出免疫基因后生成預后指數(shù)（風險評分），風險評分=X1y1+X2y2+……+Xiyi，Xi 代表各基因風險系數(shù)，yi 代表各基因表達。采用Kaplan-Meier 生存曲線、對數(shù)秩和檢驗及單變量Cox 分析評價免疫相關基因特征和臨床特征與總生存率的關系。對風險評分進行多因素Cox 分析，調整年齡、性別、分級和臨床分期。使用“Survival ROC”軟件包繪制ROC 曲線，評估風險評分的預后準確性。

1.5 諾模圖繪制 作為一種廣泛使用的預測模型，諾模圖可直觀地提供個性化的預后風險評估［15］?；诨颊吲R床特征和風險評分，使用“RMS”軟件包構建諾模圖預測一年、三年和五年總生存期（overall survival，OS）概率。Bootstrap（1 000 個重復）法計算一致性指數(shù)（Cindex）評估諾模圖的預測準確性。繪制校準曲線比較預測OS與實際OS概率。

1.6 統(tǒng)計學分析 采用Rv 4.1.1 軟件進行統(tǒng)計學分析。箱線圖顯示POSTN 在GC 中的表達分布，Wilcoxon 檢驗差異表達。Kaplan-Meier 圖、HR、P或CoxP用于生存曲線log-rank檢驗。采用Spearman相關分析確定POSTN 表達與其他基因或免疫浸潤水平在腫瘤類型中的相關性。除非另有說明，否則截斷點設為中位值。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 POSTN 在GC 中的表達及預后價值 為探討POSTN 在GC 中的表達及意義，本研究分析了TCGA STAD 及GSE29998 數(shù)據(jù)集，發(fā)現(xiàn)與非腫瘤組織相比，GC 中POSTN 表達顯著上調（圖1A、B）。以POSTN 在GC 中表達的中位值將其分為高、低表達兩組進行生存分析，結果顯示POSTN 低表達組OS高于POSTN高表達組（圖1C、D）。

圖1 POSTN在GC中的表達及預后價值Fig.1 POSTN expression and its prognostic significance in GC

2.2 GC和正常胃組織中免疫細胞浸潤情況 為探討正常組織與GC 組織中免疫細胞浸潤水平，采用Cibersort 對組織中22 種免疫細胞進行分析，發(fā)現(xiàn)正常組織和GC 組織腫瘤浸潤性免疫細胞（tumorinfiltrating immune cells，TIIC）成 分 有 顯 著 差 異（圖2A），且與正常組織相比，腫瘤組織免疫細胞浸潤模式不同（圖2B）。各類型TIICs 呈正相關（圖2C）。POSTN 表達與記憶性B 細胞、初始B 細胞、漿細胞、CD8+T 細胞和調節(jié)性T 細胞呈負相關（圖3A～E）；與γδT細胞、嗜酸性粒細胞、活化肥大細胞、M0巨噬細胞、未活化的NK細胞、M2巨噬細胞水平和中性粒細胞呈正相關（圖3F～L）。

圖2 375例GC和32例非GC組織22種TIICs表達及相關性分析Fig.2 22 TIICs expressions in 375 GC and 32 non-GC tissues and correlation analysis

圖3 GC患者POSTN與免疫細胞浸潤水平的相關性Fig.3 Correlation between POSTN and immune cell infiltration levels in GC patients

2.3 POSTN 與免疫細胞的相關性 幾個免疫亞群與POSTN mRNA 水平呈正相關（圖4）。深入研究POSTN 在調節(jié)GC 免疫應答中的功能涉及的信號通路，29 種免疫刺激劑（CD27、CD28、CD40、CD48、CD70、CD80、CD86、CXCL12、CXCR4、ENTPD1、ICOS、IL2RA、IL6、KLRC1、KLRK1、LTA、MICB、NT5E、TMEM173、TNFRSF14、TNFRSF25、TNFRSF4、TNFRSF8、TNFRSF9、TNFSF14、TNFSF13B、TNFSF4、TNFSF9 和ULBP1）和17 種免疫抑制劑（ADORA2A、CD96、CD160、CD274、CSF1R、CTLA4、HAVCR2、IDO1、IL10、KDR、LAG3、PDCD1LG2、PVRL2、TGFB1、TGFBR1、TIGIT和VTCN1）與GC中的POSTN顯著相關（圖5A）。對上述差異表達基因進行GO注釋（圖5B）。KEGG 分析表明，細胞因子-細胞因子受體相互作用、產(chǎn)生IgA 的腸道免疫網(wǎng)絡、細胞黏附分子、類風濕關節(jié)炎、自身免疫性甲狀腺疾病、瘧疾、移植物抗宿主病、同種異體移植排斥、1 型糖尿病、NF-κB信號通路、病毒性心肌炎、自然殺傷細胞介導的細胞毒性、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、非洲錐蟲病與POSTN介導的免疫事件相關（圖5C）。

圖4 POSTN表達與免疫細胞亞群的相關性Fig.4 Correlation of POSTN expression with immune cell subpopulations

圖5 POSTN相關免疫調節(jié)劑鑒定與分析Fig.5 Identification and analysis of POSTN-related immunomodulators

2.4 風險評分模型構建、獨立預后分析和生存分析 為探討POSTN 相關免疫調節(jié)劑在GC 中的臨床應用價值，將上述因素納入單因素Cox分析，共鑒定出5 個預后基因：CSF1R、TGFB1、TGFBR1、CXCR4和NT5E（表1）。進一步采用多因素Cox分析篩選出2 個獨立預后相關基因，即CXCR4 和NT5E，用其構建風險評分模型，風險值=（0.194 243 205 285 578×CXCR4）+（0.286 593 744 086 602×NT5E）。以風險評分中位值為截斷值將患者分為高、低風險兩組并繪制生存相關圖形，Kaplan-Meier 分析顯示，高風險組OS 較低風險組縮短（P=0.026，圖6A）。GC 風險分數(shù)和生存狀態(tài)分布及特征性基因表達譜見圖7A。為進一步驗證該模型獨立性，單因素Cox 分析顯示風險評分與生存顯著相關（HR=2.470，95%CI=1.690～3.608，P＜0.001，圖7B）。多因素Cox 分析顯示調整年齡、性別、分級和分期后，風險評分（HR=2.217，95%CI=1.472～3.341，P＜0.001，圖7C）可獨立預測GC 預后。ROC 分析得出風險評分的AUC=0.696；結合風險評分和患者臨床特征時，AUC=0.734（圖6B）。

表1 POSTN相關免疫基因單因素和多因素Cox分析Tab.1 Univariate and multifactor Cox analysis of POSTNassociated immune genes

圖6 GC生存分析及ROC曲線Fig.6 GC survival analysis and ROC curve

圖7 構建GC患者預后相關免疫相關風險信號Fig.7 Immune-related risk signals associated with prognosis of GC patients

2.5 諾模圖構建 基于TCGA-STAD 數(shù)據(jù)集通過權衡風險分數(shù)、年齡、分級、臨床分期、T、N和M預測個體生存概率，采用Cox回歸構建預測GC患者的預后諾模圖（圖8A）。計算每位患者各項特征得分，預測一年、三年和五年OS 概率，有助于個性化精確治療。為驗證該模型，計算該模型C-index并繪制校準曲線，該模型C-index 為0.70，證實該模型具有一致性。校準曲線顯示，諾模圖預測五年生存的概率（虛線）與實際生存的參考線（實線）很好地匹配（圖8B）。

圖8 GC附有校準曲線的諾模圖Fig.8 Nomogram with calibration curve in GC

3 討論

腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）是指與腫瘤發(fā)生、生長及轉移密切相關的局部穩(wěn)態(tài)環(huán)境，主要由腫瘤細胞、多種基質細胞、免疫細胞及細胞因子等組成，為細胞增殖和腫瘤轉移創(chuàng)造了各種有利環(huán)境，同時也在誘導腫瘤細胞耐藥方面發(fā)揮重要作用［16-17］。因此，研究GC 微環(huán)境及其潛在因素對臨床過程的影響對不同亞型GC 轉歸具有重要意義。大量證據(jù)表明一些特定基因可用于癌癥診斷和個性化治療。本研究基于TCGA及GEO數(shù)據(jù)集分析發(fā)現(xiàn)POSTN 在GC 組織中的表達高于正常組織，與ZHONG 等［18］與LI 等［19］通過不同方法檢測POSTN在GC 組織中的表達均高于正常胃組織的結果一致。本研究進一步結合臨床生存預后分析發(fā)現(xiàn)：與POSTN 低表達患者相比，POSTN 高表達患者OS 更短，表明POSTN 高表達的GC 患者預后不良，且POSTN 影響GC 患者預后與TME 和免疫浸潤有關，可能為GC免疫治療提供新的靶點。

腫瘤免疫治療發(fā)展改變了許多腫瘤的治療方式，但并非所有患者都對免疫治療有效果［20］。多種腫瘤中，腫瘤浸潤細胞CD8+T 細胞數(shù)量與患者生存及對免疫治療的反應相關［21-22］。基于TCGA數(shù)據(jù)集，本研究采用Cibersort 分析發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比，GC 的22 個免疫亞群組成顯著變化，提示免疫細胞侵襲方式與GC 預后有關。目前臨床環(huán)境中很難捕捉到單個患者滲透免疫細胞的靶點。因此，發(fā)現(xiàn)新的標志物確定患者免疫狀態(tài)非常重要。本研究分析POSTN 與GC 免疫細胞浸潤的相關性，證實POSTN 與腫瘤免疫有關，并發(fā)現(xiàn)POSTN 水平與記憶B 細胞、幼稚B 細胞、漿細胞、CD8+T 細胞和調節(jié)性T細胞呈負相關；與γδT 細胞、嗜酸性粒細胞、活化肥大細胞、M0巨噬細胞、靜止NK細胞、M2巨噬細胞水平和中性粒細胞呈正相關。此前，POSTN 在幾種類型腫瘤中的功能已有報道。如POSTN 可通過ILK/AKT/mTOR 途徑促進GC 細胞增殖和上皮-間充質轉化［23］。YUE 等［24］發(fā)現(xiàn)TGF-β1 可誘導間質POSTN 促進卵巢癌細胞遷移和侵襲。一種新的治療方法中，miR-599通過靶向下調POSTN 抑制膠質瘤細胞遷移和侵襲［25］。這些發(fā)現(xiàn)凸顯了POSTN 在腫瘤進展中的致癌作用，但潛在機制仍不清楚。本研究鑒定出POSTN 相關的46 種免疫調節(jié)劑，對其進行GO 和KEGG 通路分析表明：細胞因子-細胞因子受體相互作用、產(chǎn)生IgA 的腸道免疫網(wǎng)絡、細胞黏附分子、NF-κB 信號通路、自然殺傷細胞介導的細胞毒性等與POSTN 介導的免疫事件相關。已有研究證實其中2 個信號通路功能，NF-κB 可通過與其啟動子結合直接誘導PD-L1 基因轉錄，也可通過間接途徑對PD-L1 進行轉錄后調控［26］。細胞黏附分子在介導免疫細胞遷移到腫瘤部位并與惡性腫瘤相互作用過程中起重要作用［27］。其他信號通路功能尚待進一步證實。此外，本研究通過POSTN 相關免疫調節(jié)劑建立GC 免疫基因預后模型，發(fā)現(xiàn)由此產(chǎn)生的風險分數(shù)與GC 生存密切相關。表明風險評分可區(qū)分由一組特征基因差異表達定義的風險人群，可能加速開發(fā)出對癌癥預后有良好驗證作用的信號。

綜上，本研究表明，POSTN 不僅是GC 預后不良的潛在生物標志物，且可能通過調節(jié)免疫細胞的腫瘤侵襲在POSTN 微環(huán)境中發(fā)揮重要作用，提示POSTN 可作為調節(jié)抗腫瘤免疫應答的治療靶點。本研究也有一定局限性。首先，由于回溯性特征，研究可能導致選擇偏差，未來可進行前瞻性研究以驗證生物標志物在GC 個性化管理中的臨床應用。其次，未進一步證實POSTN 在腫瘤中作用的相關通路。第三，POSTN 治療腫瘤免疫的基礎機制和免疫特征的預后價值應進一步研究。